藥物靶點常見項目FAQ（二）

藥物靶點常見項目FAQ（二）1.為什么做蛋白芯片篩小分子靶點要生物素標記呀？這個是基于我們蛋白芯片的原理，下圖是人類蛋白質芯片的原理圖，白色的部分是我們芯片的片基部分，上面藍色的是純化出來的蛋白固定在芯片上，黃色部分是小分子，綠色五角星是生物素，灰色的是鏈霉親和素，紅色的是CY3熒光（或CY5），在進行芯片實驗時，您的小分子會和我們的芯片進行孵育，如果小分子和蛋白有結合，小分子就會結合到蛋白上，但是如果不進行生物素的修飾，那么我們是沒有辦法進行結合的監(jiān)測的，雖然結合上了，但是看不到，也是不行的，所以我們對小分子進行生物素標記，這樣鏈霉親和素就可以和生物素進行結合，進而熒光就可以固定在結合的蛋白上，這樣我們就可以通過檢測熒光的發(fā)光情況去檢測小分子與蛋白的結合。是基于這樣的原因所以需要對小分子進行生物素標記。2.人類20K蛋白質組芯片的應用方向有哪些？人類20K蛋白質組芯片是非常具有探索性和創(chuàng)新性的研究工具，是功能性芯片的代表。芯片上有近2萬種全長蛋白質，覆蓋81%的人類基因組ORF區(qū)。重組蛋白采用酵母表達系統(tǒng)，逐個進行表達與純化鑒定。在芯片上每個蛋白質均設置技術重復，并設有多種質控點，確保實驗體系穩(wěn)定可靠。研究人員除了可以進行血清或血漿中自身抗體譜的篩選建立疾病診斷標志物外，還可以基于蛋白質結構與相互作用的特點進行蛋白質與蛋白質、核酸、小分子藥物、糖類、脂類等的相互作用檢測。同時，研究人員還可以在芯片上進行復雜的酶與底物反應實驗，從而確定酶的底物譜，進而廣泛用于磷酸化、甲基化、乙?；⒎核鼗鹊鞍仔揎椦芯?。目前我們蛋白質-蛋白質相互作用和lncRNA互作蛋白應用方面有很多高分文章發(fā)表，具體見知識庫售前資料。在自身抗體譜篩選這個業(yè)務點上，可以找到很多大項目，尤其是做腫瘤免疫、風濕科、器官移植等科室。3.DNA/RNA，脂質，糖類等小分子可以檢測嗎？用什么芯片？可以檢測與其相互作用的蛋白質。如果還不明確這些分子可能的作用蛋白是哪些，可以選用我們的Huprot20K蛋白質組芯片，確定與這些分子有相互作用的蛋白質。如果您已經明確相互作用蛋白，但是想知道二者結合的動力學情況，可以選用我們的SPR技術。4.人類20K蛋白質組芯片的檢測手段有哪些？對于小分子藥物、糖類、核酸類可以采用Cy5熒光直接標記或biotin+SA_Cy5的方式標記和檢測。如果是蛋白檢測，除了上述兩種方法外，還可以采用針對該蛋白純化時的非GST/Histag抗體標記熒光，或者直接針對該蛋白的一抗標記熒光檢測。需要注意的是，抗體檢測在實驗設計時尤其要考慮相關陰性對照。5.20K做小分子靶點篩選比pulldown+MS的優(yōu)勢？1）芯片實驗為體外實驗，芯片上每個蛋白點相互獨立，保證篩選到的互作蛋白均為目標蛋白的直接結合蛋白，數據分析簡單；pulldown-LC/MS檢測到的是與小分子有結合的蛋白復合物，不一定是直接結合的蛋白。2）pulldown使用細胞內的蛋白進行檢測，如果細胞中目的蛋白表達量少的話，拉下來的互作蛋白也少，質譜打出來目的蛋白的可能性也很小。3）在不同組織、細胞、細胞器中，蛋白的表達豐度差異很大，傳統(tǒng)的pulldown等實驗很難發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白，人類蛋白組芯片上的蛋白是酵母純化表達的蛋白，可以保證每種蛋白的豐度，芯片實驗容易發(fā)現(xiàn)潛在的結合蛋白。4）利用人類蛋白組芯片實驗篩選互作蛋白，從蛋白質層面分析互作數據，避免了pulldown后質譜鑒定時，從多肽水平跨層分析互作蛋白的不確定性和復雜性。6.DARTS藥物處理的濃度是單個濃度么，為什么不按照藥效設置濃度梯度進行實驗？DARTS實驗我們設置的是一個偏飽和的藥物處理濃度，進行3次重復實驗可以盡量避免因為實驗操作帶來的假陽性。多濃度其實更建議在驗證的時候設置，可以得到實驗結果與藥物濃度的關系（例如SPR）。DARTS這類以篩選為主要目的的實驗若進行多濃度會不利于閾值的設置，因為藥物結合降解的蛋白量與藥物濃度并不一定呈梯度關系。7.前期藥物的表型驗證用的是小鼠模型，后續(xù)靶點篩選實驗可以用20K芯片嘛？我們20k芯片篩選出的是與藥物相互作用的蛋白，小鼠模型只是一個與人同源性較好的模型工具，最終大部分藥物是服務于人的，這兩者并不沖突。如果您擔心物種的問題，我們芯片也有一些人和鼠之間同源性的數據供您參考，大部分蛋白在人和鼠中同源性都是比較強的。8.Pulldown篩選出來的藥物結合蛋白用SPR驗證的話有沒有可能得到陰性的結果，怎么做才能提高陽性的概率？直接做SPR驗證是會有陰性結果的，因為SPR是驗證兩者之間直接結合的金標準，而pulldown會篩選到很多間接結合的蛋白。在指標選擇上，可以挑選與您研究方向密切