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文檔簡介

關(guān)于游離DNA提取原理和方法游離DNA介紹提取原理提取流程各緩沖液介紹第2頁,共12頁,2024年2月25日,星期天血中游離DNA簡稱循環(huán)核酸指循環(huán)血中游離于細(xì)胞外的部分降解了的機(jī)體內(nèi)源性DNA。游離DNA大部分都是雙鏈DNA分子,血中游離DNA片段遠(yuǎn)小于基因組DNA,片段長度集中在0.18~21kb之間。疾病的早期診斷,預(yù)后,檢測。游離DNA介紹第3頁,共12頁,2024年2月25日,星期天提取DNA總的原則:

1保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性;2其他生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度;3核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子;4其他核酸分子,如RNA,也應(yīng)盡量去除。第4頁,共12頁,2024年2月25日,星期天方法比較第5頁,共12頁,2024年2月25日,星期天第6頁,共12頁,2024年2月25日,星期天破壞紅細(xì)胞,通常利用紅細(xì)胞與白細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的差異,先使紅細(xì)胞裂解,經(jīng)離心后收集白細(xì)胞白細(xì)胞裂使膜蛋白和核蛋白變性,游離DNA,通常是采用離子型表面活性劑使蛋白質(zhì)變性除去變性蛋白質(zhì):通常采用蛋白沉淀劑沉淀變性蛋白質(zhì),使DNA留在上清液中在高鹽環(huán)境下使DNA從有機(jī)溶劑如無水乙醇中析出

原理本試劑盒采用離心吸附柱和緩沖液系統(tǒng)。樣品裂解后,DNA在高鹽條件下與硅膠膜結(jié)合,在低鹽,高PH值時(shí)從硅膠膜上洗脫下來。第7頁,共12頁,2024年2月25日,星期天外周血細(xì)胞裂解上層溶液血清抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液提取流程第8頁,共12頁,2024年2月25日,星期天各緩沖液介紹第9頁,共12頁,2024年2月25日,星期天2.SDS:十二烷基硫酸鈉3.Tris-HCl和NaCl:緩沖液4.EDTA

作用:細(xì)胞裂解時(shí),調(diào)節(jié)溶液的PH,維持一定的離子濃度作用:a.溶解細(xì)胞膜、核膜上脂質(zhì)成分

b.使蛋白質(zhì)變性,與蛋白質(zhì)結(jié)合成為復(fù)合物而沉淀下來

作用:是二價(jià)金屬螯合劑,使影響DNA的DNA酶中的鈣離子和鎂離子和EDTA結(jié)合,使酶失去活性,有利于提取完整DNA。1.ProteinaseK:作用:能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性,降解蛋白質(zhì),將DNA游離

主要試劑介紹5.酒精

作用:任意比和水相混溶,奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合第10頁,共12頁,2024年2月25日,星期天DNA以弱堿性的Tris或者TE溶解。不存在金屬離子的干擾,故在提取或保存DNA時(shí),大都采用Tris-HCl系統(tǒng),而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的保存:吸附柱:結(jié)構(gòu):特殊硅基質(zhì)吸附材料,特異性吸附DNA,而RNA與蛋白質(zhì)穿過。特點(diǎn):高鹽低pH值結(jié)合核酸,低鹽高pH值洗脫。

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