紫外可見分析法

關于紫外可見分析法2概述紫外-可見分光光度法：根據(jù)物質(zhì)分子對200-800nm波長范圍的光選擇性吸收的特性，建立起來的定性、定量分析方法。分子吸收紫外可見光發(fā)生電子能級躍遷；產(chǎn)生紫外可見吸收光譜分子結(jié)構中有產(chǎn)生紫外可見吸收的能級躍遷類型-分子才能吸收紫外可見光。特點：靈敏度可達10-4-10-6g/ml準確度0.2%-0.5%可用于結(jié)構鑒定、定性和定量分析第2頁,共77頁，2024年2月25日，星期天3

紫外可見光譜是由分子中價電子在不同的分子軌道之間躍遷產(chǎn)生的。

一、電子躍遷類型第一節(jié)基本原理和概念飽和單鍵的

電子不飽和雙鍵的

電子未成鍵的n電子（弧對電子）軌道：電子圍繞原子或分子運動的幾率軌道不同，電子所具有能量不同第3頁,共77頁，2024年2月25日，星期天4反鍵軌道成鍵軌道原子軌道線性組合成分子軌道第4頁,共77頁，2024年2月25日，星期天5躍遷類型：分子軌道：第5頁,共77頁，2024年2月25日，星期天6

（1）σ→σ*躍遷飽和烴（甲烷，乙烷）

ε很高，λ<150nm（遠紫外區(qū)）（2）

→*躍遷處于

成鍵軌道上的電子躍遷到*反鍵軌道，不飽和有機化合物-C=C-,ε很大（＞104）為強吸收。共軛體系λmax↑（3）n→*躍遷

孤對n電子躍遷到*反鍵軌道,C＝O；C＝N；—N＝N—,ε較?。?0-100），吸收波長200~400nm

（4）n→

*躍遷孤對n電子躍遷到

*反鍵軌道，含雜原子的飽和有機化合物第6頁,共77頁，2024年2月25日，星期天7λmax<150nm200nm180-200nm200-400nmε摩爾吸收系數(shù)很高較大

>104

10_100按能量大?。害摇?>n→σ*>π→π*>n→π*

→

*n→

*

→*n→

*CH3—CH3—NH2—OHC=CC=OC=SN=N△E躍遷類型實例C=O第7頁,共77頁，2024年2月25日，星期天8（5）電荷遷移躍遷電磁輻射照射時，電子在分子內(nèi)從給予體向接受體相聯(lián)系的軌道上躍遷。特點：摩爾吸光系數(shù)較大。εmax>104,定量分析的檢測靈敏度比較高（6）配位場躍遷發(fā)生在過渡元素的配位化合物中。能量相等的d軌道或f軌道分裂成能量不等的軌道特點：摩爾吸光系數(shù)較小。εmax<102第8頁,共77頁，2024年2月25日，星期天91.吸收光譜（吸收曲線）：不同波長光對樣品作用不同，吸收強度不同以吸光度A為縱坐標，波長λ為橫坐標作圖所得到的曲線2.吸收光譜特征—定性依據(jù)

吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→飽和σ-σ*躍遷產(chǎn)生強吸收不成峰二、相關的基本概念第9頁,共77頁，2024年2月25日，星期天103.生色團（發(fā)色團）:能吸收紫外-可見光的基團有機化合物：具有不飽和鍵和未成對電子的基團具n電子和π電子的基團產(chǎn)生n→π*躍遷和π→π*躍遷例：

C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注：當出現(xiàn)幾個發(fā)色團共軛，則幾個發(fā)色團所產(chǎn)生的吸收帶將消失，代之出現(xiàn)新的共軛吸收帶，其波長將比單個發(fā)色團的吸收波長長，強度也增強二、相關的基本概念第10頁,共77頁，2024年2月25日，星期天114．助色團：本身無紫外吸收，但可以使生色團吸收峰加強同時使吸收峰長移的基團連有雜原子的飽和基團例：—OH，—OR，—NH—，—NR2，—X5．紅移和藍移：由于化合物結(jié)構變化（共軛、引入助色團取代基）或采用不同溶劑后

吸收峰位置向長波方向的移動，叫紅移（長移）

吸收峰位置向短波方向移動，叫藍移（紫移，短移）二、相關的基本概念第11頁,共77頁，2024年2月25日，星期天126.增色效應和減色效應增色效應：吸收強度增強的效應

減色效應：吸收強度減小的效應

7.強帶和弱帶：

εmax>104→強帶

εmax<102→弱帶二、相關的基本概念第12頁,共77頁，2024年2月25日，星期天13

吸收帶：吸收峰在紫外-可見光譜中的位置

可分為：R帶、K帶、B帶、E帶、電荷轉(zhuǎn)移吸收帶、

配位體場吸收帶1．R帶：由n→π*躍遷產(chǎn)生含雜原子的不飽和基團:C＝O；C＝N；—N＝N—

E小，εmax<100;λmax250~400nm，溶劑極性增強，短移2．K帶：由共軛雙鍵的π→π*躍遷產(chǎn)生

(—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—

λmax>200nm;εmax>104共軛體系增長，λmax↑→紅移，εmax↑溶劑極性↑，λmax↑

→紅移（長移）三、吸收帶與分子結(jié)構的關系第13頁,共77頁，2024年2月25日，星期天143．B帶：芳香族化合物的主要特征吸收帶

苯λmax

～256nm，寬帶，具有精細結(jié)構；εmax=200極性溶劑中，或苯環(huán)連有取代基，其精細結(jié)構消失三、吸收帶與分子結(jié)構的關系第14頁,共77頁，2024年2月25日，星期天154．E帶：

芳香族化合物的特征吸收帶

E1180nmεmax>104

（常觀察不到）E2200nmεmax=7000

強吸收苯環(huán)被發(fā)色團取代且與苯環(huán)共軛時，E2帶與K帶合并一起紅移（長移），被助色團取代E2帶λmax

和ε都變大三、吸收帶與分子結(jié)構的關系第15頁,共77頁，2024年2月25日，星期天161.位阻影響共軛效應，吸收帶長移，吸光系數(shù)增加發(fā)色團在同一平面，易形成共軛位阻影響分子的平面性

λmax280nm(10500)λmax295.5nm(29000)順式二苯乙烯反式二苯乙烯四、影響吸收帶位置的因素第16頁,共77頁，2024年2月25日，星期天172.跨環(huán)效應有β、γ不飽和醛酮結(jié)構，適當?shù)牧Ⅲw排列使R帶長移，吸收強度增強

四、影響吸收帶位置的因素第17頁,共77頁，2024年2月25日，星期天183.溶劑效應（1）對λmax影響：

n-π*躍遷：溶劑極性↑，λmax↓藍移

π-π*躍遷：溶劑極性↑，λmax↑紅移

四、影響吸收帶位置的因素（2）對吸收光譜精細結(jié)構影響

溶劑極性↑，苯環(huán)精細結(jié)構消失第18頁,共77頁，2024年2月25日，星期天194.pH值的影響影響物質(zhì)存在型體，影響吸收波長λmax210.5nm,270nmλmax235nm,287nmOH-H+-四、影響吸收帶位置的因素：第19頁,共77頁，2024年2月25日，星期天20描述物質(zhì)對單色光吸收強弱與液層厚度和待測物濃度的關系五、朗伯-比爾定律1、Lambert定律：A∝l（吸收層厚度）2、Beer定律：A∝C（吸收物質(zhì)濃度）二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律，其數(shù)學表達式為：

A：吸光度E：吸光系數(shù)C：溶液濃度l：光路長度第20頁,共77頁，2024年2月25日，星期天211、適用條件：

1.單色光2.稀溶液（10-2～10-5M）2、吸收度的加和性：a、b、c三種物質(zhì)共存時3、該定律適用于固體、液體和氣體樣品公式討論：第21頁,共77頁，2024年2月25日，星期天224、吸光系數(shù)（E）：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時的

吸光度。根據(jù)濃度單位的不同，分為：（1）摩爾吸光系數(shù)ε在一定λ下，c=1mol/L，l=1cm時的吸光度（2）百分吸光系數(shù)在一定λ下，c=1g/100ml，l=1cm時的吸光度。（3）兩者關系公式討論：第22頁,共77頁，2024年2月25日，星期天23吸光系數(shù)的討論1、吸光系數(shù)不隨濃度和光程長度的改變而改變，

僅與物質(zhì)本身的性質(zhì)有關，與待測物濃度無關；2、（1）不同物質(zhì)，對同一λ，ε一般不同；（ε↑，吸光能力↑）（2）同一物質(zhì)，對不同λ，ε一般不同（εmax）第23頁,共77頁，2024年2月25日，星期天24例：氯霉素（323.15），λmax=278nm，C=2.00mg/100mlT%=24.3%求：,ε第24頁,共77頁，2024年2月25日，星期天25六、偏離Beer定律的因素第25頁,共77頁，2024年2月25日，星期天26（一）化學因素Lambert-Beer定律適用范圍：稀溶液（＜10-2mol/L）當溶液中濃度改變時，溶液可能產(chǎn)生離解，締合與溶劑間的作用等而產(chǎn)生偏離。a.6.36×10-6mol/Lb.1.27×10-4mol/Lc.5.79×10-4mol/L亞甲藍陽離子水溶液的吸收光譜六、偏離Beer定律的因素例：亞甲藍陽離子水溶液單體吸收峰在660nm，二聚體吸收峰在610nm。隨濃度增大660nm吸收峰減弱，610nm處吸收峰增強，從而使吸收度與濃度關系發(fā)生偏離。第26頁,共77頁，2024年2月25日，星期天27（二）光學因素a.非單色光

理論要求：平行單色光，實際：光源復合光

六、偏離Beer定律的因素照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過光對檢測器的響應，必須保證一定的狹縫寬度這就使分離出來的光具一定的譜帶寬度第27頁,共77頁，2024年2月25日，星期天28b.雜散光的影響：

雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長相距較遠雜散光來源：儀器本身缺陷；光學元件污染造成雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值c.反射光和散射光的影響：

反射光和散射光均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光可使透射光減弱，A↑，一般可用空白對比校正消除d．非平行光的影響：使光程↑，l↑，A↑六、偏離Beer定律的因素第28頁,共77頁，2024年2月25日，星期天29（三）透光率的測量誤差——ΔT

影響測定結(jié)果的相對誤差兩個因素：T和ΔT

六、偏離Beer定律的因素第29頁,共77頁，2024年2月25日，星期天30ΔT影響因素：

1）暗噪音：與檢測器和放大電路等各部件的不確切性有關，與光訊號無關，可視為一個常量。其在A為0.2～0.7范圍內(nèi)，造成相對誤差較小，為測量最適宜范圍。

0.4343第30頁,共77頁，2024年2月25日，星期天31

訊號噪音亦稱訊號散粒噪音。光敏元件受光照射時的電子遷移，每一單位時間中電子遷移數(shù)量是不相等的，而是在某一均值周圍的隨機數(shù)，形成測量光強時的不確定性。隨機數(shù)變動的幅度隨光照增強而增大，與光的波長及光敏元件的品質(zhì)有關。2）訊號噪音：與光訊號有關第31頁,共77頁，2024年2月25日，星期天32

第二節(jié)紫外-可見分光光度計第32頁,共77頁，2024年2月25日，星期天33第33頁,共77頁，2024年2月25日，星期天34一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源

鎢燈或鹵鎢燈——可見光源350~1000nm氫燈或氘燈——紫外光源200~400nm2．單色器：包括狹縫、準直鏡、色散元件第34頁,共77頁，2024年2月25日，星期天35

棱鏡——對不同波長的光折射率不同色散元件分出光波長不等距光柵——衍射和干涉分出光波長等距第35頁,共77頁，2024年2月25日，星期天363．吸收池：玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英——不吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)要求：匹配性（對光的吸收和反射應一致）4．檢測器：將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置5．記錄裝置：訊號處理和顯示系統(tǒng)光電池光電管光電倍增管二極管陣列檢測器第36頁,共77頁，2024年2月25日，星期天37二、分光光度計的類型1．單光束分光光度計：特點：使用時來回拉動吸收池→移動誤差對光源要求高比色池配對(一)幾種光路類型第37頁,共77頁，2024年2月25日，星期天382．雙光束分光光度計：

特點：不用拉動吸收池，可以減小移動誤差對光源要求不高可以自動掃描吸收光譜第38頁,共77頁，2024年2月25日，星期天393．雙波長分光光度計特點：利用吸光度差值定量消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差第39頁,共77頁，2024年2月25日，星期天404．光多道二極管陣列檢測分光光度計第40頁,共77頁，2024年2月25日，星期天41第41頁,共77頁，2024年2月25日，星期天42(二)光學性能1.波長范圍：190-1100nm2.波長準確度：儀器顯示波長與實際波長之差≤±0.3nm3.波長重現(xiàn)性：≤±0.2nm4.透光率范圍：0-300%5.吸光度測量范圍：-0.447～+3.006.光度準確度：≤±0.3%7.光度重復性：≤±0.3%8.分辨率：單色器分辨兩條靠近的譜線的能力.260nm，△λ=0.3nm9.雜散光：220nm處（1%NaI）≤0.1%第42頁,共77頁，2024年2月25日，星期天43(三)儀器的校正1.波長的校正氫燈或氘中的較強譜線486.13nm(F線)和656.28nm（C線）稀土玻璃（鐠釹、鈥）、某些元素（汞、鉀、銫）苯蒸汽檢查和校正波長讀數(shù)。第43頁,共77頁，2024年2月25日，星期天442.吸光度的校正60mg重鉻酸鉀用0.005mol/L的硫酸溶液稀釋至1000ml，在規(guī)定波長處測定并計算吸收系數(shù)，與規(guī)定值比較。規(guī)定值：235nm123.0～126.0257nm142.8～146.2313nm47.0～50.3350nm105.5～108.53.吸收池校正

兩吸收池測定的差值小于1%第44頁,共77頁，2024年2月25日，星期天45一、定性分析二、定量分析定性鑒別純度檢查和雜質(zhì)限量測定單組分的定量方法多組分的定量方法第三節(jié)紫外－可見分光光度分析方法三、結(jié)構分析第45頁,共77頁，2024年2月25日，星期天46一、定性分析（一）定性鑒別定性鑒別的依據(jù)→吸收光譜的特征吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目吸收峰的位置（波長）吸收峰的強度相應的吸光系數(shù)結(jié)構完全相同的化合物應有完全相同的吸收光譜但吸收光譜相同的化合物卻不一定結(jié)構相同第46頁,共77頁，2024年2月25日，星期天471.對比吸收光譜的特征值一、定性分析第47頁,共77頁，2024年2月25日，星期天482.對比吸光度或吸光系數(shù)的比值：例：一、定性分析第48頁,共77頁，2024年2月25日，星期天493.對比吸收光譜的一致性同一測定條件下,與標準對照物譜圖或標準譜圖進行對照比較一、定性分析第49頁,共77頁，2024年2月25日，星期天50（二）純度檢查和雜質(zhì)限量測定1．純度檢查（雜質(zhì)檢查）1）主成分無吸收，雜質(zhì)有吸收直接考察雜質(zhì)

例如：測乙醇中是否含有少量苯。苯在256nm處有吸收峰，乙醇沒有2）主成分強吸收，雜質(zhì)無吸收/弱吸收與純品比較，E↓3）雜質(zhì)強吸收>>主成分吸收→與純品比較

E↑，光譜變形一、定性分析第50頁,共77頁，2024年2月25日，星期天512．雜質(zhì)限量的檢測：例：腎上腺素中微量雜質(zhì)——腎上腺酮含量計算制成2mg/ml的HCl溶液，λ＝310nm下測定規(guī)定A310≤0.05.求雜質(zhì)限量？腎上腺酮值為435一、定性分析第51頁,共77頁，2024年2月25日，星期天52（一）單組分的定量方法

1．吸光系數(shù)法

2．標準曲線法

3．對照法：外標一點法注意:1）選擇吸收光譜中的吸收峰對應的波長

2）多個吸收峰，選擇無干擾的、較高的峰

3）測定波長大于溶劑的截止波長二、定量分析第52頁,共77頁，2024年2月25日，星期天531．吸光系數(shù)法（絕對法）例：維生素B12

的水溶液在361nm處的百分吸光系數(shù)為207，用1cm比色池測得某維生素B12溶液的吸光度是0.414，求該溶液的濃度?解：二、定量分析第53頁,共77頁，2024年2月25日，星期天例：精密稱取B12樣品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm處測定吸光度為0.507，求B12的百分含量？

已知361nm處的百分吸光系數(shù)為207解：第54頁,共77頁，2024年2月25日，星期天552．標準曲線法配制一系列濃度不同的標準溶液，在一定波長下分別測定吸光度A。以A為縱坐標，濃度c為橫坐標，繪制A-c標準曲線。完全相同的條件下，測定被測溶液的吸光度，并從標準曲線上找出對應的被測溶液濃度或含量。BlankStandardSampleSample二、定量分析第55頁,共77頁，2024年2月25日，星期天56示例

蘆丁含量測定0.710mg/25mL第56頁,共77頁，2024年2月25日，星期天573．對照法

相同條件下配制樣品溶液和標準溶液，在同一波長處測二者吸光度例：精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀釋至10.00mL；另配制對照液，精密稱定對照品25.00mg，加水稀釋至1000mL。在361nm處，用1cm吸收池，分別測定吸光度為0.508和0.518，求B12注射液注射液的濃度？二、定量分析第57頁,共77頁，2024年2月25日，星期天58注：當樣品溶液與標準品溶液的稀釋倍數(shù)相同時第58頁,共77頁，2024年2月25日，星期天59

（二）多組分的定量方法三種情況：

1．兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）

2．兩組分吸收光譜部分重疊

3.兩組分吸收光譜完全重疊二、定量分析第59頁,共77頁，2024年2月25日，星期天601．兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）兩組分在各自λmax下測定→分別按單組分定量二、定量分析第60頁,共77頁，2024年2月25日，星期天612．兩組分吸收光譜部分重疊

λ1→測A1→b組分不干擾→可按單組分定量測caλ2→測A2→a組分干擾→不能按單組分定量測cb

定量Ca定量Cb二、定量分析第61頁,共77頁，2024年2月25日，星期天623．兩組分吸收光譜完全重疊——混合樣品測定

（1）解線性方程組法二、定量分析第62頁,共77頁，2024年2月25日，星期天63（2）等吸收雙波長法測定a，消除b的影響步驟：1.選擇λ1和λ2

對于干擾組分b，λ1和λ2是等吸收波長；對于a，兩波長的吸光度之差足夠大；3．兩組分吸收光譜完全重疊——混合樣品測定二、定量分析第63頁,共77頁，2024年2月25日，星期天64步驟2.a的對照品溶液在λ1和λ2處測定吸光度，得二、定量分析b的對照品溶液在λ1和λ2處測定吸光度，得樣品溶液在λ1和λ2處測定吸光度，得E1a和E2a第64頁,共77頁，2024年2月25日，星期天65二、定量分析第65頁,共77頁，2024年2月25日，星期天66同理消除a的影響，測b二、定量分析第66頁,共77頁，2024年2月25日，星期天67（一）有機物的紫外吸收光譜從紫外吸收光譜推斷：

a.分子骨架

b.發(fā)色團之間的共軛關系

c.取代基的種類、位置和數(shù)目1.飽和碳氫化合物躍遷類型：σ→σ*,需很大能量

吸收峰位置：遠紫外區(qū)，200～400nm無吸收

三、結(jié)構分析第67頁,共77頁，2024年2月25日，星期天682.含孤立助色團和生色團的有機化合物

1）含有孤立助色團電子類型：σ和n電子躍遷類型：n→σ*

2）含有孤立生色團電子類型：σπ和n電子躍遷類型：n→σ*(190nm)

π→π*（150-180nm）

n→π*(275-295nm)3.共軛烯烴兩個雙鍵只隔一個單鍵成共軛大π鍵躍遷類型及吸收峰位置：

π→π*較孤立雙鍵能級差減少，吸收長移三、結(jié)構分析第68頁,共77頁，2024年2月25日，星期天694.αβ-不飽和醛、酮、酸、酯

1）分子特點：C=O與C=C共軛

2）躍遷類型及吸收峰位置：

π→π*200～260nmε約10000n→π*310～350nmε<1003）一般溶劑極性增加使π→π*吸收紅移（長移）使n→π*吸收藍移（短移）

三、結(jié)構分析第69頁,共77頁，2024年2月25日，星期天705.芳香族化合物

（1）苯和取代苯分子特點：環(huán)狀共軛體系躍遷類型和吸收峰位置：

π→π*E1，E2，B三個吸收帶，有取代基長移，

B帶精細結(jié)構簡化

助色團取代基：產(chǎn)生n→π*，E2，B吸收帶長移，ε增大，溶劑極性增加，B精