浙江大學生物化學甲實驗實驗酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度省公開課一等獎全國示范課微

試驗七

用正交法測定幾個原因對蔗糖酶活性影響丁鳴（半自主性設計試驗）第1頁一、試驗目標和要求

1.初步掌握正交試驗設計法使用。2.利用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度和pH值這四種原因對酶活力影響。二、試驗基本原理酶催化作用是在一定條件下進行，它受各種原因影響，如酶濃度、底物濃度、溫度、pH值、抑制劑和激活劑等都能影響酶催化反應速度。通常在其它原因恒定條件下，經過某一原因在一系列改變條件下酶活性測定求得該原因影響，這是單原因試驗方法。對于多原因試驗能夠經過正交試驗設計法來完成。正交法是借助于正交表，簡化表格計算，正確分析結果，找到試驗最正確條件，分清原因主次，這么就能夠經過比較少試驗次數(shù)到達好試驗效果。實踐證實正交法是一個多、快、好、省方法。當前已廣泛用于工農業(yè)生產和科學試驗中。本試驗利用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度、pH值這四個原因對酶活性影響，并求得在什么樣底物濃度、酶濃度、溫度和pH值時酶活性最大。第2頁三、試驗材料與試劑1、試驗材料純化蔗糖酶（樣品Ⅳ）2、試驗試劑⑴5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）；⑵0.2mol/L乙酸緩沖液，pH3.6、4.6、5.6；⑶3,5－二硝基水楊酸試劑；甲液：溶解6.9g結晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。四、試驗器材與儀器1.試管及試管架；2.吸量管；3.恒溫水浴箱（37℃、50℃、65℃、100℃）；4．可見光分光光度計。第3頁五、試驗操作方法和步驟1、試驗設計⑴、確定試驗原因和水平本試驗取四個原因，即底物濃度[S]、酶濃度[E]、溫度、pH值。每個因素選三個水平，試驗原因和選取水平如表1。表1原因、水平表原因水平[S]（ml）[E]（ml）溫度（℃）pH10.51.0503.620.20.6375.630.80.2654.6

作原因、水平表時，各原因水平，最好不要按大小次序排列。按普通方法，如對四個原因三個水平各種搭配都要考慮，共需做34=81次試驗，而用正交表只需做9次試驗。第4頁⑵、選擇適當正交表

適當正交表，是指要考查原因自由度總和，應該小于所選正交表總自由度。正交表Ln（tq）L——正交表代號n——處理數(shù)（試驗次數(shù)）t——水平數(shù)q——原因數(shù)試驗次數(shù)n=q(t–1)+1=4（3－1）+1＝9總自由度V總=n-1各列自由度V列=K（該列水平數(shù)）–1比如本試驗選取四個原因，每個原因選三個水平，四個原因各占一列，那么四個原因自由度分別為：V1=3–1=2，V2=3–1=2，V3=3–1=2，V4=3–1=2。四個原因自由度總和=V1+V2+V3+V4=8因為各原因自由度總和是8，它沒有超出L9（34）總自由度=9–1=8。所以選擇正交表L9（34）是適合。第5頁3.在所選正交表上進行表頭設計因為本試驗是一項四原因各三水平試驗，這么將四個原因依次放在L9（34）第1，2，3，4列上，這項把原因放入正交表頭工作，叫做表頭設計。見表2。正交表都應含有以下兩個特征：（1）在每一列中，各水平出現(xiàn)次數(shù)相等。即在任何一列中，數(shù)字1和數(shù)字2和數(shù)字3都出現(xiàn)三次（幾個水平就均出現(xiàn)幾次）。（2）任何兩列中，橫行組成數(shù)對出現(xiàn)次數(shù)相等，均出現(xiàn)一次（這里有9個不一樣數(shù)對，均出現(xiàn)一次）（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出現(xiàn)一次。以上這些特點確保了用正交表安排試驗計劃是均衡搭配，所以分析數(shù)據比較方便，可進行綜合比較，結果比較可靠。在所選正交表上進行表頭設計，見表2。

第6頁水平原因試驗號1[S]2[E]3溫度4pH111112122231333421235223162312731328321393321L9表表2表頭設計第7頁2、試驗安排將本試驗四個原因依次填入L9表原因1，2，3，4中；再將各列水平數(shù)用該列原因對應水平寫出來，便可得到下面試驗安排表（表3）。表中試驗號共9個，表示要做9次試驗，每次試驗條件如每一縱行所表示。如做第一個試驗時[S]是0.5ml，[E]是1.0mL，溫度50℃，pH為3.6。第二個試驗[S]是0.5ml，[E]是0.6mL，溫度37℃，pH為5.6，余類推。第8頁試驗號試劑（ml）2491683575%蔗糖溶液[S]0.50.20.80.50.20.80.50.20.80.2mol/L乙酸緩沖溶液[pH]pH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0蒸餾水0.90.81.00.51.60.61.31.20.237℃預溫5min50℃預溫5min65℃預溫5min蔗糖酶（樣品Ⅳ）[E](作對應預溫）0.61.00.21.00.20.60.20.61.0[溫度]37℃反應10min50℃反應10min65℃反應10minDNS111111111100℃×5min蒸餾水555555555A520表3試驗安排表

另取試管一支作非酶對照，即加5%蔗糖溶液0.5ml，緩沖液1.9ml。先加DNS1ml搖勻室溫放置5分鐘后再加入蔗糖酶（樣品Ⅳ）0.6ml搖勻室溫放置10分鐘，100℃×5min，再加入蒸餾水5ml，混勻后在520nm處測光密度值。第9頁六、試驗結果及分析試驗做好后，把9個數(shù)據填入表4試驗結果欄內，按表中數(shù)據計算出各原因一水平試驗結果總和、二水平試驗結果總和、三水平試驗結果總和，再取平均值（各自被3除）。最終計算極差。極差是指這一列中最好與最壞之差，從極差大小就能夠看出那個原因對酶活力影響最大，那個影響最小。找出任何條件下酶活力最高。最終作一直觀分析結論。以OD值為縱座標，原因水平數(shù)為橫座標作圖。試驗經典結果與異常分析

試驗確定最正確條件與理論很吻合。如出現(xiàn)與理論顯著不一致現(xiàn)象可能是試驗過程中如加樣及時間控制等出現(xiàn)較大誤差所致。第10頁水平原因試驗號1[S](ml)2[E](ml)3溫度(℃)4pH值試驗結果A520110.511.015013.6210.520.623725.6310.530.236534.6420.211.023734.6520.220.636513.6620.230.215025.6730.811.036525.6830.820.615034.6930.830.223713.6Ⅰ(一水平試驗結果總和)Ⅱ(二水平試驗結果總和)Ⅲ(三水平試驗結果總和)Ⅰ/3Ⅱ/3Ⅲ/3級差表4試驗結果分析計算表第11頁七、注意事項

1、各試劑加樣一定要準確。2、保溫時間各管