細胞生物學(xué)評價實驗手冊

生物材料細胞生物學(xué)評價實驗手冊細胞培養(yǎng)技術(shù)（一）試劑配制1.L-DMEM,H-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液700ml超純水溶解一包L-DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含10g粉末）或H-DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含13.4g粉末），并稱取2.2g碳酸氫鈉融入其中，攪拌后定容至1000ml。（調(diào)PH7.2-7.4）2.L-DMEM,H-DMEM完全培養(yǎng)液L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入10％的胎牛血清，0.22μm過濾器除菌，4℃3.25×PBS（儲液）稱?。郝然c50g，氯化鉀1.25g，磷酸氫二鈉18.1g，磷酸二氫鈉1.56g，加入約200ml水中，充分溶解后定容至250ml（調(diào)PH7.2-7.4），室溫保存。4.1×PBS（工作液）取40ml25×PBS稀釋25倍，即加超純水定容至1000ml，高溫滅菌。（調(diào)PH7.2-7.4）5.0.25％/0.02%胰酶/EDTA稱取2.5g胰酶，0.4gEDTA溶解于約900ml1×PBS中，攪拌充分溶解后，4℃過夜。第二天，調(diào)PH值至7.2，定容至1000ml，0.22μm過濾器除菌，46.細胞凍存液L-DMEM/H-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清和DMSO按照1：3：6的比例混和，0.22μm過濾器除菌。7.成脂誘導(dǎo)液（1）脂肪誘導(dǎo)液(AI)在H-DMEM完全培養(yǎng)液加入終濃度為1μmol/L地塞米松、0.5mmol/LIBMX、100mmol/L吲哚美辛和10μg/ml牛胰島素，0.22μm過濾器除菌，4℃（2）脂肪保持液(AM)在H-DMEM完全培養(yǎng)液加入終濃度為10μg/ml牛胰島素，0.22μm過濾器除菌，4℃8.成骨細胞誘導(dǎo)液（OS）在L-DMEM完全培養(yǎng)液加入終濃度為0.1μmol/L地塞米松、10mmol/L甘油磷酸鈉和50mg/mlVitC，0.22μm過濾器除菌，4℃9.成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液高糖DMEM＋10ng/mLTGF-β3+50ng/mLIGF-1+20%FBS10.油紅O染液的配制用蒸餾水稀釋異丙醇稀釋至60％，加入油紅O直至不再溶解，37℃11.茜素紅染液的配制茜素紅2g溶解于100ml蒸餾水中，用10％氫氧化氨調(diào)PH值至4.2，室溫保存。附：成骨分化培養(yǎng)基儲液的配制：1.AscorbidAcid(VitaminC)sigma公司產(chǎn)品（目錄號是A4544）儲液濃度是20mM，使用終濃度是0.2mM。配制方法是：秤取35.22mg溶解于10ml超純水中，分裝成1ml，－20℃2.β－glycerophosphatedisodiumsalt，pentahydrateCalbiochem公司產(chǎn)品，目錄號是35675儲液濃度是1M，使用濃度是10mM。配制方法是：秤取15.3g，溶解于40ml超純水中，溶解之后，定容至50ml，分裝成1ml，－20℃地塞米松(dexamethasone)sigma公司產(chǎn)品，目錄號是D4902或D1756。儲液濃度是1mM，使用濃度是0.1μM。配制方法是：秤取4mg，溶解于10ml無水乙醇中，分裝成1ml，－20℃成脂分化培養(yǎng)基儲液的配制：indomethacin（吲哚鎂辛），sigma公司產(chǎn)品，目錄號是I7378儲液濃度是100mM，使用濃度是0.2mM配制方法是：秤取358mg，用10mlDMSO（sigma公司產(chǎn)品，目錄號是D2650）溶解，分裝成0.4ml，－20℃insulin，sigma公司產(chǎn)品。目錄號是I6634儲液濃度是5mg/ml，使用濃度是10μg/ml。配制方法是：秤取50mg，用10ml的0.01N的HCL溶解（將濃鹽酸稀釋1200倍），用一次性過濾器過濾除菌之后，分裝成0.5ml，－20℃注意：insulin使用時要注意保持insulin儲液的無菌，經(jīng)過除菌的insulin可在4℃IBMX，sigma公司產(chǎn)品，目錄號是I5879儲液濃度是250mM，使用中濃度是0.5mM配制方法是：秤取222mg，溶解于4mlDMSO，分裝成0.4ml，－20℃地塞米松(dexamethasone)sigma公司產(chǎn)品，目錄號是D4902或D1756。儲液濃度是1mM，使用濃度是1μM。配制方法是：秤取4mg，溶解于10ml無水乙醇中，分裝成1ml，－20℃（二）細胞原代培養(yǎng)1.人骨髓間質(zhì)干細胞原代（hMSCs）骨髓取自非造血系統(tǒng)、非遺傳性疾病且未累及骨髓的正常成人骨髓,一般20ml.（1）骨髓用1XPBS按1:1稀釋（2）用吸管將骨髓緩緩加入含F(xiàn)icoll-Hypaque（淋巴細胞分離液，1.077g/ml）的無菌離心管中，兩者體積之比是4：6。（3）離心，2000rpm×20min，緩緩減速（離心機降速設(shè)置為0）。（4）離心結(jié)束后，在淋巴分離液與上層血清之間可見一白色薄細胞層，即為有核細胞層。小心吸出細胞加入1×PBS中洗滌細胞一次后（5）用1mlL-DMEM完全培養(yǎng)液重懸細胞，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，標(biāo)記為P0。（20ml骨髓可接種3-4個25CM（6）3d后全量去除非貼壁細胞，此時可見單個或數(shù)個長梭形細胞形成的克隆。以后每3~4d全量換液一次。（8）10～20d，原代細胞達到80～90%融合后傳代培養(yǎng)2.大鼠骨髓間質(zhì)干細胞（RMSCs）的原代培養(yǎng)（1）四周齡SD鼠脫頸處死，75%酒精浸泡5min（2）無菌條件下分離剪取兩側(cè)大鼠股骨及脛骨近端（3）用1ml注射器吸取L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗分離的股骨及脛骨（4）骨髓沖洗液離心后接種到細胞培養(yǎng)皿中（5）3d后換液，倒置顯微鏡觀察克隆的形成（6）7～10d，原代細胞達到80～90%融合后傳代培養(yǎng)3.兔軟骨細胞的原代培養(yǎng)2-4周齡新西蘭大白兔苯巴比妥鈉麻醉后耳緣靜脈注射空氣迅速處死,剝皮后用大剪刀分離膝關(guān)節(jié)處肌肉等軟組織，暴露膝關(guān)節(jié)。無菌條件下用手術(shù)刀片仔細從兔膝關(guān)節(jié)表面削下軟骨組織片，收集在PBS中，充分剪成ｌmm3以下的組織塊，用PBS清洗3遍。加入軟骨體積10~15倍的0.25%胰蛋白酶37℃消化0.5-1小時，再用PBS沖洗兩遍，加入0.2%II型膠原酶的D-Hanks消化液，37℃消化4-6小時以上，每2小時收集細胞懸液一次，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變混濁為止，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,稀釋II型膠原酶,終止消化并將細胞團吹打成單個細胞后用200目濾網(wǎng)過濾,收集濾液,3000r/min離心5min。棄上清,收集濾液。計數(shù)細胞，以1×105～1×106個/ml的密度接種，置于37℃、5％CO2（三）細胞傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)至細胞約80－90%融合，用胰酶進行傳代。先將舊培養(yǎng)液棄去，1×PBS洗兩次后加入0.25%胰酶，于鏡下觀察。見細胞變圓即將脫壁時，拍打瓶底數(shù)次，加入3倍以上體積的完全培養(yǎng)液終止胰酶作用，并用吸管反復(fù)吹打使細胞脫壁。轉(zhuǎn)移細胞至離心管中，并用1×PBS將瓶底洗一次，盡可能搜集更多的細胞，離心，重懸，按1：2比例接種并標(biāo)記為第一代（P1），繼續(xù)培養(yǎng)。以后約每3~4d傳代一次。（四）細胞凍存和復(fù)蘇將約80~90%融合的細胞消化、離心棄去上清夜，加入1ml細胞凍存液重懸后，轉(zhuǎn)移細胞至無菌細胞凍存管中，密封。細胞放入凍存盒（或按4℃30min，－20℃2h將細胞轉(zhuǎn)移）至－80℃凍存的細胞取出后立即放入37℃水浴2-3分鐘內(nèi)融化，快速轉(zhuǎn)移至含4ml完全培養(yǎng)液的離心管中，混勻后離心，1100rpm/min,4min.離心后細胞用完全培養(yǎng)液重懸二、細胞與支架復(fù)合培養(yǎng)支架在培養(yǎng)液預(yù)濕過夜，接種前在無菌超凈臺吹至半干，用無菌鑷子夾取至孔板，每孔一個支架。將已消化好的一定體積高濃度細胞懸液接種到每個支架表面，在37℃，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3h，然后每孔加入相應(yīng)培養(yǎng)液三、細胞形態(tài)檢測（掃描電鏡）細胞材料復(fù)合物培養(yǎng)1d后，取出用2.5%戊二醛固定4h，1%四氧化鋨后固定，梯度酒精脫水10min，臨界點干燥，噴金后在掃描電鏡下觀察細胞形態(tài)。四、細胞黏附增殖（MTT法）（一）原理MTT(噻唑蘭)，可透過細胞膜進入細胞內(nèi)，活細胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苡谒乃{紫色結(jié)晶并沉積在細胞內(nèi)，結(jié)晶物能被二甲基亞楓（DMSO）溶解，用分光光度計或酶標(biāo)儀檢測490nm波長的吸光度，可間接反應(yīng)細胞的數(shù)量。（二）試劑配制工作濃度：0.5g/l，可用1XPBS或未加酚紅的培養(yǎng)基配制，宜現(xiàn)配先用（或半月內(nèi)），4℃(三)實驗步驟（1）在各時間點，細胞材料復(fù)合物用PBS洗兩次，加入1mlMTT（0.5g/l）溶液，避光放入37°C,5%CO2培養(yǎng)箱孵育3h；（2）將復(fù)合結(jié)構(gòu)移入新的Eppendorf管（避光），加入300ulDMSO,（混合器）震蕩5min，離心5min（2000rpm）；（3）紫外分光光度計（或酶標(biāo)儀）檢測上清液490nm波長的吸光度（OD值）（1mlMTT工作液DMSO。（四）注意事項MTT及結(jié)晶溶解產(chǎn)物見光會快速分解，因此每一步均應(yīng)避光。五．堿性磷酸酶活性測定（骨）（1）樣本獲取：細胞支架復(fù)合物在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3，7，14，21d時，用PBS洗兩次，加入300μl堿性磷酸酶裂解液，超聲裂解4min，離心2min（13,000rpm），將上清液分裝至4-5個EP管，凍存于-20℃（2）堿性磷酸酶測定：樣品解凍后離心，取20μl加入200μl5mM對硝基苯酚（p-nitrophenol），立即放入37℃水浴中，15min以后，加入1ml0.02mMNaOH終止反應(yīng)，紫外分光光度計檢測反應(yīng)物在405nm波長的吸光度（3）總蛋白測定：取30μl樣品，加入150μl試劑A(一種堿性酒石酸鹽溶液)，混勻后加入試劑B(一種稀釋的蛋白定量試劑)，孵育15min，紫外分光光度計檢測反應(yīng)物在750nm波長的吸光度（總蛋白濃度）。（4）堿性磷酸酶活性計算為酶濃度與總蛋白濃度之比。六、糖胺多糖合成量測定（軟骨）BMSCs接種至酰胺化PHBV支架誘導(dǎo)成軟骨培養(yǎng)時，同時設(shè)置BMSCs及軟骨細胞復(fù)合酰胺化PHBV支架培養(yǎng)作對照，將BMSCs及軟骨細胞1×107cells/mL接種至相同大小的支架上。單純BMSCs培養(yǎng)以低糖DMEM＋10%FBS液，軟骨細胞以高糖DMEM＋20%FBS液進行復(fù)合培養(yǎng)。接種1周、2周及3周，分別收集三組細胞，裂解后以二甲基亞甲藍分光法測定糖胺多糖(GAG)含量。方法如下：取500μL細胞裂解液,加入2.5mL二甲基亞甲藍溶液(二甲基亞甲藍16mg、甘氨酸3.04g、氯化鈉2.37g、0.1mol/L鹽酸95mL，加水配成1000mL溶液，調(diào)pH值為3.0)，充分混勻，用紫外分光光度儀(λ=七、冰凍切片及染色技術(shù)（一）冰凍切片技術(shù)冰凍切片是利用物理降溫的方法將組織標(biāo)本冷凍使其產(chǎn)生一定硬度進行切片的技術(shù)方法，是脂肪染色、酶組織化學(xué)染色（如堿性磷酸酶染色和阿新藍染色等）及免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點是制片簡單，且能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細胞表面抗原更應(yīng)采用冰凍切片。新鮮組織和已固定組織均可作冰凍切片。試劑及配制：0.01MPBS:4%多聚甲醛：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500～800ml0.1mol/L磷酸緩沖液（PhosphateBuffer以下簡稱PB），加熱至60℃步驟：（1）細胞支架復(fù)合物從培養(yǎng)基中取出（或新鮮組織），PBS洗兩次，用包埋劑覆蓋后快速凍存（減少冰晶形成）在-80℃或液氮中（2）載玻片上涂少量多聚賴氨酸，干片后備用（3）組織塊快速轉(zhuǎn)移至冰凍切片機內(nèi)，將組織切成5-10μm厚的切片，貼到準備好的載玻片上（4）干片后用4%多聚甲醛在4℃固定20min，0.01MPBS洗三次，每次5-10min。（隨后進行后續(xù)的酶組織化學(xué)染色或免疫組化染色，如果暫時不染色必須吹干后放（二）冰凍切片堿性磷酸酶染色續(xù)上（5）加入BCIP/NBT染色液20min，用雙蒸水洗去浮色，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。(三)冰凍切片熒光免疫組織化學(xué)染色（1）切片用4％PFA室溫固定20min，PBS洗三遍，每次10min。（2）0.2%TritonX-100/PBS室溫處理30min。（3）山羊血清封閉30～50min。（4）去除山羊血清，不洗，直接加1:200一抗，4℃（5）PBS洗三遍，10min/次。（6）加入1：200CY3偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育45min。（7）PBS洗三遍，10min/次。（8）Hoechst33342襯染細胞核10～30min。（9）熒光顯微鏡觀察。八、石蠟切片及染色技術(shù)（一）石蠟切片制作基本技術(shù)組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。教學(xué)中，光鏡下觀察切片標(biāo)本多數(shù)是石蠟切片法制備的?；畹募毎蚪M織多為無色透明，各種組織間和細胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區(qū)別出；組織離開機體后很快就會死亡和產(chǎn)生組織腐敗，失去原有正常結(jié)構(gòu)，因此，組織要經(jīng)固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞組織死亡，而能清晰辨認其形態(tài)結(jié)構(gòu)。石蠟切片法包括取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與粘片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟。一般的組織從取材固定到封片制成玻片標(biāo)本需要數(shù)日，但標(biāo)本可以長期保存使用，為永久性顯微玻片標(biāo)本。1.取材應(yīng)根據(jù)要求選取材料來源及部位。材料必須新鮮，擱置時間過久則產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解變性，導(dǎo)致細胞自溶及細菌的滋生，而不能反映組織活體時的形態(tài)結(jié)構(gòu)。2.固定用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)藥液——固定液浸漬切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細胞和組織中的物質(zhì)成分、終止細胞的一切代謝過程、防止細胞自溶或組織變化，盡可能保持其活體時的結(jié)構(gòu)。固定能使組織硬化，有利于切片的進行，而且也有媒浸作用，有利于組織著色。10％福爾馬林（4％甲醛）或10％磷酸緩沖福爾馬林是病理切片常規(guī)使用的固定液，不僅適用于常規(guī)HE（蘇木精-伊紅）染色，還可以用于組織學(xué)有關(guān)的其他技術(shù)的切片染色。固定液的用量通常為材料塊的20倍左右，固定時間則根據(jù)材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以從1小時至數(shù)天，通常為數(shù)小時至24小時。3.洗滌與脫水固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會影響以后的染色效果。多數(shù)用流水沖洗；固定后或洗滌后的組織內(nèi)充滿水分，如不除去水分就無法進行以后的透明、浸蠟與包埋，因為透明劑多數(shù)是苯類，苯類和石蠟均不能與水相融合，水分不脫盡，苯類不能浸入。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混，為了減少組織材料的急劇收縮，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行，通常從30％或50％酒精開始，經(jīng)70％、85％、95％直至純酒精（無水乙醇），每次時間為1～數(shù)小時，如不能及時進行各級脫水，材料可以放在70％酒精中保存，因高濃度酒精易使組織收縮硬化，不宜處理過久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環(huán)等也可做脫水劑。4.透明純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。通常組織先經(jīng)純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1～2小時，再轉(zhuǎn)入純透明劑中浸漬。透明劑的浸漬時間則要根據(jù)組織材料塊大小及屬于囊腔抑或?qū)嵸|(zhì)器官而定。如果透明時間過短，則透明不徹底，石蠟難于浸入組織；透明時間過長，則組織硬化變脆，就不易切出完整切片，最長為數(shù)小時。5.浸蠟與包埋用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時，再先后移入2個熔化的石蠟液中浸漬3小時左右，浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點3℃左右的溫箱中進行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。浸蠟后的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中（擺好在蠟中的位置），待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷卻，即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框盒。如果包埋的組織塊數(shù)量多，應(yīng)進行編號，以免差錯。石蠟熔化后應(yīng)在蠟箱內(nèi)過濾后使用，以免因含雜質(zhì)而影響切片質(zhì)量，且可能損傷切片刀。通常石蠟采用熔點為56～58℃或60～62℃6.切片包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的方形或長方形，以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于小木塊上，夾在輪轉(zhuǎn)式切片機的蠟塊鉗內(nèi)，使蠟塊切面與切片刀刃平行，旋緊。切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可用熱水或冷水等方法適當(dāng)改變蠟塊硬度。通常切片厚度為4～7微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。7.貼片與烤片用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步驟中二者滑脫開。粘附劑是蛋白甘油。首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油，再將一定長度蠟帶（連續(xù)切片）或用刀片斷開成單個蠟片于溫水（45℃左右）中展平后，撈至玻片上鋪正，或直接滴兩滴蒸餾水于載玻片上，再把蠟片放于水滴上，略加溫使蠟片鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入45℃溫箱中干燥，也可在378.切片脫蠟及水化干燥后的切片需脫蠟及水化才能在水溶性染液中進行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。如果染料配制于酒精中，則將切片移至與酒精近似濃度時，即可染色。9.染色（石蠟切片蘇木精-伊紅HE）染色的目的是使細胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色以便于觀察。未經(jīng)染色的細胞組織其折光率相似，不易辨認。經(jīng)染色可顯示細胞內(nèi)不同的細胞器及內(nèi)含物以及不同類型的細胞組織。染色劑種類繁多，應(yīng)根據(jù)觀察要求及研究內(nèi)容采用不同的染色劑及染色方法，還要注意選用適宜的固定劑才能取得滿意的結(jié)果。經(jīng)典的蘇木精（Hematoxylin）和伊紅（曙紅，Eosin）染色法是組織學(xué)標(biāo)本及病理切片標(biāo)本的常規(guī)染色，簡稱HE染色。經(jīng)HE染色后，細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數(shù)細胞質(zhì)及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。由于蘇木精是帶陽離子的染料，染液呈堿性，核內(nèi)染色質(zhì)及胞質(zhì)內(nèi)核糖體等物質(zhì)對這種染料有親和性，稱嗜堿性；而帶陰離子的染料伊紅配制的染液呈酸性，對這種染料的親和性，稱嗜酸性。有時不同的組織結(jié)構(gòu)還需要用特殊的染料及染色方法加以顯示，稱特殊染色。有些細胞組織經(jīng)硝酸銀浸潤后，可使溶液中銀離子還原成金屬銀或銀粒附著在細胞組織上，呈棕黑色，這種性質(zhì)稱親銀性，而有些細胞組織本身不能使硝酸銀的銀離子還原成金屬銀，還需加還原劑才能將銀離子還原，稱嗜銀性。步驟：（1）切片在二甲苯中脫蠟5～10分鐘。（2）移入二甲苯和純酒精（1∶1）混合液中5分鐘左右（如經(jīng)二次二甲苯脫蠟，此步可略）。（3）入100％、95％、85％、70％酒精，各級為2～5分鐘。最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液。（4）蘇木精染液染色5～15分鐘。（5）水洗玻片上多余染液，0.5～1％鹽酸酒精（70％酒精配制）分色片刻。鏡檢控制，直至細胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，約數(shù)10秒鐘。（6）流水沖洗15～30分鐘，或者在碳酸鋰飽和液中短時間堿化或藍化，即細胞核呈藍色。（7）蒸餾水短洗。（8）0.1～0.5％伊紅染液染色1～5分鐘，若著色困難，可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易著色且不易脫色。（9）依次經(jīng)70％、85％、95％、100％酒精脫水，各級為2～3分鐘，在95％以下濃度的酒精中伊紅易脫色，應(yīng)適當(dāng)縮短時間。（10）二甲苯透明（二次），共約10分鐘。（11）封片：擦去切片周圍多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固阿利新藍染色（檢測軟骨）：=1\*GB3①切片脫蠟至水洗；=2\*GB3②蒸餾水洗；=3\*GB3③1%阿利新藍染液染色10~20分鐘；=4\*GB3④水洗2~3分鐘；=5\*GB3⑤用1%中性紅染液復(fù)染胞核；=6\*GB3⑥水洗2~3分鐘；=7\*GB3⑦逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。番紅O染色（檢測軟骨）：①切片脫蠟，乙醇浸洗，水洗；②Weigert's蘇木素中浸染3分鐘，水沖洗；③鹽酸乙醇液(1%鹽酸加70%乙醇)中分化15秒；④水洗3分鐘，0.02%水溶性孔雀綠中浸染3分鐘；⑤1%醋酸中擺動洗滌；⑥0.1%的番紅O中浸染不超過3分鐘；⑦乙醇浸洗，梯度脫水，干燥，中性樹膠封片，光鏡觀察。石蠟切片Ⅰ型膠原免疫組化染色（檢測骨）（1）石蠟切片在65℃烘烤（2）二甲苯脫蠟（3）梯度酒精水化（4）微波中低火抗原修復(fù)20min（5）0.2%TritonХ-100室溫下5min（6）1%H2O2室溫下15min（7）血清封閉20min（8）滴加1：200一抗，4℃濕盒孵育過夜，PBS洗滌5min×3（9）滴加生物化二抗，室溫20min，PBS洗滌5min×3次（10）滴加三抗，室溫20min，PBS洗滌5min×3次（11）滴加DAB顯色，光鏡下觀察，反應(yīng)時間3min，蒸餾水沖洗（12）蘇木素復(fù)染（13）中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。干細胞成骨誘導(dǎo)后的染色方法和步驟

堿性磷酸酶（ALP）是成熟成骨細胞的標(biāo)志性酶，同時成骨細胞形成的鈣結(jié)節(jié)也是成骨細胞的標(biāo)記物。

以ALP為目標(biāo)物的檢測方法：

1

Gomori鈣鈷法

【染色原理】

ALP在pH值9.4的環(huán)境下，以鎂離子作為激活劑，能夠把β-甘油磷酸鈉水解出磷酸，磷酸與高濃度的鈣鹽結(jié)合形成無色的磷酸鈣，再與硝酸鈷作用形成磷酸鈷，經(jīng)硫化胺處理形成黑色的硫化鈷沉淀在酶活性處。

【孵育液配制】

3%β-甘油磷酸鈉5ml

2%巴比妥鈉5ml

蒸餾水10ml

2%

CaCl2

10ml

2%

MgSO4

1ml

【步驟】

（1）將無菌的玻片放入培養(yǎng)皿中，傳代時加入適量的細胞懸液，作細胞爬片，呆細胞長滿玻片后取出。

（2）PBS沖洗后用冷丙醇固定10min，蒸餾水沖洗數(shù)次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自來水沖洗數(shù)次。

（4）2%硝酸鈷中浸3-5min，蒸餾水洗數(shù)次。

（5）1%的硫化銨中2min，自來水沖洗，自然干燥，封固。

【結(jié)果】胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀。

2

偶氮偶聯(lián)法：

【孵育液配制】

萘酚AS-BI磷酸鹽

20mg

DMSO

0.5ml

0.2mol/L巴比妥醋酸緩沖液（PH

9.2）

50ml

六偶氮副品紅0.5ml

1mol/L

NaOH調(diào)PH

9-10，混合后過濾使用。

（六偶氮副品紅：副品紅400mg，濃鹽酸2ml，雙蒸水8ml混合過濾；臨用前與等體積4%亞硝酸鈉混合）

【步驟】

（1）細胞爬片成功后，PBS沖洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。

（2）蒸餾水沖洗。

（3）將過濾孵液直接滴加于玻片上，室溫下作用45min。

（4）流水沖洗，晾干。

（5）甘油明膠封固。

【結(jié)果】成骨細胞胞質(zhì)中可見紅色ALP陽性顆粒。

3

堿性磷酸酶染色試劑盒法：

【作用原理】

細胞內(nèi)堿性磷酸酶在Ph9.4-9.6條件下水解磷酸萘酚AS-MX產(chǎn)生萘酚，后者被重氮鹽捕獲，生成不溶性有色沉淀。

【作用液配制】

取2號儲備液10ml，加3號液200ul，再加4號粉劑10mg，振搖速溶，立即過濾到細胞爬片上。

【步驟】

（1）細胞爬片滴加數(shù)滴1號液，室溫固定一分鐘（不可以延長），流水漂洗2分，晾干。

（2）滴加作用液數(shù)滴，置濕盒內(nèi)于37℃孵育2小時，流水沖洗2分鐘。

（3）滴加5號液數(shù)滴，復(fù)染5分鐘，流水沖洗2分鐘，晾干。

【結(jié)果】陽性結(jié)果是胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍色沉淀。

針對鈣沉積物“鈣結(jié)節(jié)”的染色方法：

4

茜素紅法

【作用原理】利用沉積的鈣于茜素紅發(fā)生顯色反應(yīng)，得到紅色的染色效果。

【步驟】

誘導(dǎo)液成分：DMEM完全培養(yǎng)基+地塞米松10-7mol/L+抗壞血酸50μg/ml+β-甘油磷酸鈉10mmol/L，每2d換液一次。誘導(dǎo)第21天做茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)的生成。90%乙醇固定10分鐘，去離子水漂洗3次。

（1）培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10min，雙蒸水沖洗3次。

（2）0.1%茜素紅-Tris-Hcl（PH

8.3）37℃，30min。

（3）蒸餾水沖洗，干燥，封片。

【結(jié)果】染料品種的不同，礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)不同的紅色。

5

von

Kossa法

【作用原理】

Von

Kossa’s礦化結(jié)節(jié)染色法原理是將礦化基質(zhì)中的磷酸鹽(鈣)、碳酸鹽(鈣)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿徙y、碳酸銀，然后用日光、紫外線或強還原劑使其還原為黑色的金屬銀。本試驗染色過程中未作細胞襯染。

【步驟】

（1）培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，4％多聚甲醛固定5分鐘，雙蒸水沖洗3次。

（2）培養(yǎng)皿中加入5％硝酸銀溶液1ml，將培養(yǎng)板開蓋在紫外燈下照射1小時。

（3）倒出殘留的硝酸銀溶液，蒸餾水沖洗3遍。

（4）培養(yǎng)皿中加入5％硫代硫酸鈉溶液1ml，中和殘留的硝酸銀溶液，吸出殘液。

（5）室溫下晾干，封固。

1、VONKOSSA染色中脫水，是否仍是梯度酒精？

2、能否介紹一下茜素紅S法鈣染色的詳細方法

謝謝?。。。?！方法：1：切片常規(guī)入水。

2：茜素紅染2min。

3：蒸餾水洗5-10s。

4：分化液洗15s。

5：常規(guī)脫水，透明，封固。

結(jié)果：鈣

橙紅，無機鐵

紫色。

試劑：1茜素紅S(alizarinredS)液：茜素紅S0.5g加蒸餾水45ml,充分攪拌，同時加入

5ml稀釋1:100的28%NH4OH,pH應(yīng)為6.3-6.5，此液需保存至少一個月，方可使用。

2分化液：取10~3mol/LHCl混入到95%乙醇之中（即濃HCl1份，95%乙醇10000份）軟骨細胞鑒定染色1%甲苯胺藍配制：原液：1g甲苯胺藍粉末+10ml70%酒精溶解（據(jù)說可保存6個月）

工作液：取上述原液1ml+9ml1%NaCl溶解，濾紙過濾（用時新鮮配制）

1%NaCl：1gNaCl+100ml蒸餾水（用時新鮮配制）

染色步驟：（1）爬片用PBS洗2次，直接用4%多聚甲醛固定于6孔板中1h或更長時間（4度）

（2）自來水洗15分鐘，最好不要直接沖爬片，易脫片

（3）蒸餾水洗5分鐘

（4）加1%甲苯胺藍浸染2h

（5）去除多余染液，我覺得可以用注射器從6孔板中吸走。有人說用90%酒精的，但一定要慎重。否則時間稍長，就會將顏色洗脫。當(dāng)然洗脫后仍然可以從（4）開始重復(fù)。

（6）鏡下觀察，滿意后晾干，中性樹膠封片。請教甲苯胺藍多糖染色的原理甲苯胺藍是一種異染染料，可將多糖類（粘液）染成紅色，而其余組織呈不同程度的藍色，這樣增加了對比度。

當(dāng)然其還可以染軟骨、肥大細胞中的顆粒等。（紅色）3、枸櫞酸鹽緩沖液(Citratebuffer)：

3.1儲存液：

A.0.1M枸櫞酸溶液：稱取21.01g枸櫞酸(C6H8O7·H20)溶于1000ml蒸餾水中。

B.0.1M

RT-PCR實驗方法總結(jié)大全RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。

要求：做RT前必需測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。

2.RT按要求做，一般不會出太大問題。

3.PCR，按常規(guī)。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。

Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化淋巴細胞和淋巴母細胞(一)原理

Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm／kgH２O),粘度也很小，可形成高達1.3g／ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時可在低離心力(200～1000g)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達到滿意的細胞分離結(jié)果。由于Percoll擴散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。

(二)操作方法及注意事項

1.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備:先用9份Percoll與1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15MPBS)稀釋到所需濃度。

Percoll濃度(％)706050403020

比重g／ml

1.090

1.077

1.067

1.056

1.043

1.031

2.不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備:先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。

3.裝樣：樣品體積和細胞濃度根據(jù)不同細胞而異，一般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高，否則會影響細胞的分離和回收。

4.離心：一般采用離心力為400g，時間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機加速、降速時要慢，要平穩(wěn)。

5.取樣：當(dāng)所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測用。

(三)分離純化細胞舉例

1.富含NK活性大顆粒淋巴細胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml試管(或塑料管)分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從外周血中分離的PBMC細胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。

2.純化淋巴母細胞和除去死細胞：分別疊加50％和30％Percoll液。收取經(jīng)PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者)，按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞；兩層Percoll之間為淋巴母細胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結(jié)構(gòu)以及功能的研究。

(四)人不同血細胞的漂浮密度

表人不同血細胞的漂浮密度

──────────────┬──────────────────

細胞漂浮密度│細胞漂浮密度

──────────────┼──────────────────

紅細胞1.09-1.11│淋巴細胞1.052-1.077

粒細胞

│B淋巴細胞1.062-1.075

嗜酸性1.09-1.095

│T淋巴細胞1.065-1.077

嗜中性1.080-1.085│淋巴母細胞1.065-1.077

單核細胞1.050-1.066│自然殺傷細胞1.050-1.070

血小板1.030-1.060│

──────────────┴──────────────────

(五)問與答

問：請問percoll連續(xù)梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll連續(xù)梯度?

答：根據(jù)你需要的具體密度梯度決定的，根據(jù)要分離的不同細胞種類，數(shù)量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。