識別原發(fā)性和耐受性前列腺癌中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子

摘要前列腺癌是世界高發(fā)性男性癌癥，死亡率一直處于較高水平。然而，前列癌癥的發(fā)生并不是單一因素作用的結(jié)果，通常是多個因子相互作用，相互影響的。針對早期前列腺癌（Primary），臨床上采取內(nèi)分泌治療，用以抑制雄激素從而抑制癌癥的進(jìn)一步發(fā)展，但效果持續(xù)時間不長，經(jīng)過一段時間治療后，前列腺癌產(chǎn)生耐藥性，發(fā)展成去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)，在CRPC中，癌癥的發(fā)展并不依賴雄激素受體。在該論文中，我們利用生物信息學(xué)分析方法，通過分析與比較Primary和CRPC病人高通量測序的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出CRPC中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子ATF4和ETS2，對CRPC病人數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，利用基因富集分析方法，進(jìn)一步探究關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子潛在的功能。結(jié)果表明，PI3K-Akt信號通路和癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)功能在ATF4和ETS2高表達(dá)樣本中被激活。此外，我們通過分析表觀遺傳修飾數(shù)據(jù)，進(jìn)一步證明了CRPC中ATF4和ETS2啟動子區(qū)域具有很強(qiáng)的H3K4me3和H3K27ac修飾信號，該信號與基因激活有關(guān)，有較弱的H3K27me3修飾信號，該信號與抑制基因有關(guān)，因此證明了ATF4和ETS2在CRPC中高度活躍，是CRPC的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。通過高通量數(shù)據(jù)，對CRPC中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)分析，識別出ATF4和ETS2關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及其潛在功能，為深入理解前列腺癌的發(fā)病機(jī)制，耐藥機(jī)理提供了重要的方向，也為臨床上治療CRPC提供一個新的思路。關(guān)鍵詞：前列腺癌；CRPC；生物信息；關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；ATF4；ETS2IdentificationofrepresentativeTFsinPrimaryandCastrationResistantProstateCancers(CRPC)AbstractProstatecancerisoneofthemostaggressivemalignancyinthewholeworldwithhighmortality.Recentstudiesindicatethatmultiplefactorscantriggertoprostatecancer.Inclinical,androgen-deprivationtherapyiswidelyappliedinprimaryadenocarcinomatreatment,butasubsetofpatientscangotoresistanceandbecomeacastration-resistantprostatecancer(CRPC),whichshowsAndrogenReceptor(AR)independentstatus.Inthisstudy,wewillapplybioinformaticsanalysismethodstoidentifymastertranscriptionfactorsinCRPCandprimarysamplesbyusingpublishedCRPCandprimarypatientRNA-Seqdata.TheclassificationanalysisbasedontheexpressionofATF4andETS2,andgeneenrichmentanalysisfurtherrevealedthefunctionsofmasterregulators,ATF4andETS2.OurresultsshowedPI3K-AktsignalingpathwayandTranscriptionalmisregulationincancerarehighenrichedinATF4andETS2highsamples.Inaddition,strongH3K4me3andH3K27acsignalandweekH3K27me3signalatATF4andETS2promoterregionsfurtherconfirmedtheactivatedstatusofthesetwomasterregulatorsinCRPCsamples.Insummary,theidentificationofATF4andETS2inCRPCthroughbioinformaticsmethodsrevealedthepotentialmechanismbetweenCRPCprogressionandmasterregulators,whichalsoprovidenoveltreatmentdirectioninprostatecancerclinicalresearch.Keywords:Prostatecancer;CRPC;Bioinformatics;Masterregulator;ATF4;ETS2目錄TOC\o"1-3"\h\u前言 .11材料與方法 32.1數(shù)據(jù)的獲取 32.2方法 42結(jié)果與討論 53.1原發(fā)性和耐受性前列腺癌中差異基因的識別 53.2原發(fā)性和耐受性前列腺癌中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的識別與比較 63.3關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子激活的生物學(xué)通路的比較 73.4表觀修飾層面關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的比較 93.5原發(fā)性和耐受性前列腺癌中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的潛在機(jī)制 113結(jié)論 13參考文獻(xiàn) 14致謝 17前言前列腺癌是發(fā)生在前列腺上皮組織的惡性腫瘤，是男性最常見的惡性腫瘤之一，我國的前列腺癌的發(fā)病率較低與歐美國家，但隨著我國老齡化人口的增加，近幾年呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，成為了男性十大惡性腫瘤之一REF_Ref14657\r[1]。前列腺癌發(fā)病與家族遺傳，年齡，飲食，肥胖等原因相關(guān)，長期攝入脂肪含量高的食物也會增加前列腺癌的發(fā)病率，此外體內(nèi)脂肪含量過高可能會促進(jìn)機(jī)體分泌促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的因子REF_Ref14670\r[2]。臨床上將前列腺癌分為雄激素依賴型前列腺癌（ARdependentPCa）和去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）。雄激素依賴型前列腺癌是指癌細(xì)胞的增殖依賴于雄激素的刺激，機(jī)體內(nèi)分泌的雄激素與癌細(xì)胞表面的雄激素受體結(jié)合促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，采用內(nèi)分泌治療（有效時間是18-24個月）的手段阻斷雄激素的來源，從而抑制癌細(xì)胞的增殖REF_Ref15111\r[3]。CRPC是指經(jīng)過內(nèi)分泌治療以后，血清睪酮小于50ng/dL或小于1.7nmol/L，達(dá)到去勢水平，同時血清PSA持續(xù)升高的病癥。CRPC的生存期為12-18個月，當(dāng)前列腺癌進(jìn)展到CRPC時，癌細(xì)胞表面的雄激素受體發(fā)生突變，使其對低濃度的雄激素更為敏感。內(nèi)分泌治療雖然阻斷了機(jī)體內(nèi)雄激素的來源，但同時也使得癌癥自身的雄激素合成增加。幾乎所有經(jīng)過內(nèi)分泌治療的癌癥患者最后都會轉(zhuǎn)變?yōu)镃RPCREF_Ref15438\r[4]。臨床上采用口服Abiraterone，Docetaxel化療，enzaulatmide（我國還未上市）治療CRPC患者，Abiraterone是一種新型的雄激素合成抑制劑，作用于雄激素合成中的關(guān)鍵酶CYP17，從源頭上阻斷雄激素的合成，Docetaxel化療是指將抗腫瘤藥物注射到人體內(nèi)，干擾癌細(xì)胞的增長或者殺死癌細(xì)胞，進(jìn)而延長患者的生存時間REF_Ref16692\r[5]。CRPC病人中常見的基因突變是TP53和RB1缺失，其中TP53突變高達(dá)40%，RB1缺失達(dá)到了28%。40%-60%的前列腺癌患者存在AR，TP53，ETS和PTEN的突變，這些突變涉及到多種信號通路，如AR，DNA修復(fù)，PIK3，Wnt，細(xì)胞周期等。研究表明，89%的CRPC患者基因表達(dá)譜中均帶有一種突變，這一特征為明確篩選CRPC的靶點治療提供了強(qiáng)大的支持REF_Ref16829\r[6-REF_Ref16835\r7]。前列腺特異性抗原（PSA）作為前列腺癌的臨床診斷標(biāo)志物，正常情況下血液中PSA的濃度極低，濃度在0-4ng/ml之間，血清中PSA濃度增高意味著前列腺發(fā)生生理性變化，當(dāng)PSA增高時應(yīng)結(jié)合前列腺穿刺檢查獲取病理特征，進(jìn)而確定是否患有前列腺癌REF_Ref17312\r[8]。成纖維細(xì)胞激活蛋白（FAP）是判斷轉(zhuǎn)移的CRPC狀態(tài)的生物標(biāo)志物，在非正常的成纖維組織中高度表達(dá)，也是腫瘤免疫的靶點，同時FAP是成纖維細(xì)胞（CAF）的標(biāo)志物，具有促進(jìn)腫瘤活性的功能，通過影響FAP調(diào)節(jié)的相關(guān)信號通路，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)展以及相關(guān)表型的表達(dá)REF_Ref17413\r[9]。前列腺癌的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子有AR,FOXA1,ASCL1,ONECUT2等。AR是雄激素受體，刺激前列腺癌的增殖，與ARPC相比，CRPC中AR有著高表達(dá)量，增加了AR的活性，促進(jìn)癌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄，從而使得其增殖能力增強(qiáng)。當(dāng)AR大量激活時，一方面使得轉(zhuǎn)錄因子MYC結(jié)合處的轉(zhuǎn)錄共激活因子的表達(dá)能力下降，另一方面直接抑制自身的轉(zhuǎn)錄活性REF_Ref17577\r[10]。FOXA1是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子，在ARPC和CRPC中的突變率高達(dá)9%和13%。FOXA1作為AR的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，既可以促進(jìn)AR的表達(dá)也可以抑制，對AR的作用具有復(fù)雜性。在NEPC中，F(xiàn)OXA1基因上調(diào)會使癌細(xì)胞大量增殖并且在表觀修飾層面上發(fā)生重編程，成為NEPC的特異性調(diào)節(jié)元件，促進(jìn)NEPC相關(guān)基因的表達(dá)REF_Ref17691\r[11]。ASCL1作為癌細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)全基因組染色質(zhì)重塑導(dǎo)致ASCL1缺失將細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)變?yōu)榍粻顟B(tài)，ASCL1結(jié)合PRC2靶點并調(diào)節(jié)EZH2活性，這一特征為臨床治療提供了靶基因位點REF_Ref18311\r[12]。ONECUT2作為CRPC的關(guān)鍵調(diào)控因子和治療靶點，通過抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性，促使癌細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌譜系轉(zhuǎn)化，同時ONECUT2可以與缺氧效應(yīng)協(xié)同，使癌細(xì)胞缺氧抑制其轉(zhuǎn)化。ONECUT2基因的表達(dá)產(chǎn)物與雄激素受體相互作用，不依賴與雄激素的刺激，能夠使癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，抵抗內(nèi)分泌治療，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成具有更高侵襲性的癌癥。有研究報告指出CSRM617能夠起著阻斷Onecut2的作用，能夠顯著地降低小鼠中的前列腺癌轉(zhuǎn)移瘤的大小。此外，研究發(fā)現(xiàn)ONECUT2與前列腺癌的格里森得分（Gleasonscore）成正相關(guān)，這說明ONECUT2是前列腺癌發(fā)展進(jìn)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子。CSRM617化合物能夠抑制Onecut2的作用，降低前列腺癌轉(zhuǎn)移瘤的大小，為臨床提供了新治療手段REF_Ref18406\r[13-REF_Ref17942\r14]。1材料與方法1.1數(shù)據(jù)的獲取利用GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE120741和GSE118435數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)分別是primary和CRPC的數(shù)據(jù)，兩者分別包含了92和41個樣本數(shù)據(jù)，通過R語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行整合處理，構(gòu)建基因表達(dá)矩陣。利用R語言中的函數(shù)包dorothea，dplyr，Seurat，pheatmap等進(jìn)行基因TF活性的計算。dorothea是利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子活性的函數(shù)包，主要基于TF靶基因的表達(dá)，來衡量TF的活性。dplyr是用于數(shù)據(jù)清洗的R包。Seurat是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析常用的R包。pheatmap函數(shù)包用于繪制熱圖。GSE118435是對CRPC個體的轉(zhuǎn)移進(jìn)行的RNA測序，通過高通量測序進(jìn)行表達(dá)譜分析。GSE120741是原發(fā)性前列腺癌的RNA測序數(shù)據(jù)，用于研究AR與表觀遺傳的關(guān)系，該研究數(shù)據(jù)提出了一個關(guān)于前列腺癌轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳控制的豐富資源，揭示了AR對三種亞型的基因調(diào)控的嚴(yán)格控制。表1數(shù)據(jù)信息Table1CohortsinformationGEOID類型生物來源樣本數(shù)量數(shù)據(jù)來源研究內(nèi)容GSE118435CRPC人41對CRPC轉(zhuǎn)移的個體進(jìn)行RNA測序測定疾病的進(jìn)展，核AR的表達(dá)，以及對治療藥物產(chǎn)生的反應(yīng)GSE120741Primary人92利用高通量對RNA-seq測序，進(jìn)行表達(dá)譜分析用于研究AR與表觀遺傳的關(guān)系，揭示AR對癌癥亞型的基因調(diào)控1.2方法1.2.1數(shù)據(jù)處理GSE118435數(shù)據(jù)是單個樣本的表達(dá)，通過R語言處理提取每個樣本的FPKM數(shù)據(jù)合并成基因表達(dá)矩陣。首先對GSE118435數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，消除數(shù)據(jù)間特征的差異性。處理后的GSE118435與GSE120741進(jìn)行合并，進(jìn)行批次化效應(yīng)處理，減少不同批次化之間的差異，獲得基因表達(dá)矩陣。最后，我們得到的矩陣中有113個樣本，38952個基因數(shù)據(jù)。1.2.2差異表達(dá)基因的篩選limma包是生物信息中進(jìn)行差異基因篩選常用的R包，通過設(shè)置閾值P<0.05且|log2FC|>1進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，繪制火山圖呈現(xiàn)結(jié)果，上調(diào)的基因有3390個，下調(diào)的基因有2152個。1.2.3關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的篩選利用R語言的dorothea包，基于CRPC和Primary樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子活性的計算與分析。通過dorothea包的處理，對dorothea_regulon_human進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，1表示與轉(zhuǎn)錄因子正相關(guān)的，-1表示與轉(zhuǎn)錄因子呈負(fù)相關(guān)。通過正相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)減去負(fù)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)，分別計算CRPC和Primary的TF，分別對兩數(shù)據(jù)的TF進(jìn)行中位數(shù)排序，各取其前20個作為CRPC和Primary中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。2結(jié)果與討論2.1原發(fā)性和耐受性前列腺癌中差異基因的識別當(dāng)log2FC>1時，上調(diào)的基因有3390個，其中ETS2（log2FC=1.035969364）和EZH2（log2FC=3.19239817）等基因明顯上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，ETS2轉(zhuǎn)錄因子家族促進(jìn)了CRPC的發(fā)生與進(jìn)展，ETS基因或ETS轉(zhuǎn)錄因子與AR的啟動子融合是前列腺癌中最常見的改變，與此同時，ERG融合基因是ETS基因家族中最常見的融合類型。臨床研究表明，有ETS重排的腫瘤要比沒有ETS重排的腫瘤更具侵蝕性REF_Ref18909\r[15]。EZH2基因編碼一種組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶，通過使DNA甲基化從而抑制其它基因的轉(zhuǎn)錄，EZH2突變或者過度表達(dá)會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，異常激活的EZH2抑制抑癌基因的表達(dá)，抑制EZH2的活性可以抑制腫瘤的發(fā)展，因此臨床上常常采用EZH2的抑制劑，抑制CRPC的發(fā)展REF_Ref18916\r[16]。EZH2抑制劑除了影響基因表達(dá)之外，還下調(diào)了一組DNA損傷修復(fù)（DDR）的基因，特別是參與堿基切除修復(fù)（BER）的基因途徑，利用EZH2抑制劑處理CRPC的細(xì)胞可提高對其基因毒性應(yīng)激的敏感性REF_Ref19115\r[17-REF_Ref19121\r18]。當(dāng)log2FC<1時，下調(diào)的基因有2152個，F(xiàn)OS（log2FC=-3.71163257）和TP63（log2FC=-4.411347236）等一些基因明顯下調(diào)。FOS基因家族編碼亮氨酸拉鏈蛋白與Jun家族蛋白形成二聚體，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1，AP-1對前列腺癌轉(zhuǎn)化成CRPC至關(guān)重要REF_Ref19121\r[19]。TP63基因是P53基因家族的一個成員，控制著hub基因的表達(dá)，TP63的表達(dá)的缺失促進(jìn)了癌基因的表達(dá)，使正常的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞，差異基因的火山圖如下：圖1A.CRPC與Primary的差異基因B.CRPC上調(diào)基因與已知的CRPC高表達(dá)TF交集C.Primary上調(diào)基因與已知的Primary高表達(dá)TF交集Figure1A.DifferentiallyexpressedgenesbetweenCRPCandPrimarysamplesB.Overlapofup-regulatedgenesinCRPCandwell-knowntop20TFsinCRPCC.Overlapofup-regulatedgenesinPrimaryandwell-knowntop20TFsinPrimary2.2原發(fā)性和耐受性前列腺癌中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的識別與比較要找到關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，就要使其在基因表達(dá)上和轉(zhuǎn)錄上都呈現(xiàn)較高的活性，通過對CRPC中上調(diào)的基因與CRPC中轉(zhuǎn)錄因子活性排名前20個轉(zhuǎn)錄因子求交集，結(jié)果顯示，只有ATF4和ETS2既在CRPC中顯著高表達(dá)，又在CRPC中具有較高的TF活性，通過對Primary中上調(diào)的基因與其前20個轉(zhuǎn)錄因子活性中位數(shù)較高的轉(zhuǎn)錄因子求交集，最后得到五個基因分別為TP63，F(xiàn)OS，STAT1，CEBPA，GATA2。我們展示了這7個基因在CRPC和Primary樣本中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，這些基因在各自組別內(nèi)的表達(dá)模式基本一致。與Primary樣本相比，ATF4和ETS2在CRPC中的表達(dá)顯著上調(diào)，而TP63，F(xiàn)OS，STAT1，CEBPA，GATA2在Primary中表達(dá)較高。ATF4基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在CRPC中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的缺氧耐受，促進(jìn)腫瘤的生長以及血管生成因子的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的相關(guān)過程REF_Ref19392\r[20-REF_Ref19396\r21]。在前列腺癌中，ETS2基因與AR的啟動子融合促進(jìn)癌癥的發(fā)展進(jìn)程，ETS相關(guān)基因的融合導(dǎo)致表觀遺傳改變，進(jìn)而導(dǎo)致前列腺癌異質(zhì)性。STAT1活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長，胞質(zhì)中的STSA1在信號分子的刺激下磷酸化形成同源或者異源二聚體，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。但是STAT1基因的過度活化并不能抑制腫瘤的生長，反而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和耐藥性REF_Ref19494\r[22]。CRPC和Primary樣本中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及其在樣本中的表達(dá)見圖2.圖2CRPC中上調(diào)和下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子Figure2Up-andDown-regulatedTFsinCRPCcomparedwithPrimarysamples2.3關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子激活的生物學(xué)通路的比較研究表明，在CRPC中ATF4和ETS2基因表達(dá)顯著上調(diào)，所以針對ATF4和ETS2基因，利用R語言的clusterProfile包來獲取ATF4和ETS2基因涉及的信號通路，結(jié)果如圖3和4所示。在所有信號通路中受到ATF4和ETS2基因上調(diào)效果影響較為明顯的是PI3K?Akt信號通路和癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)。有研究已經(jīng)證明，在CRPC中PI3K?Akt信號通路的激活較為普遍，PI3K?Akt信號通路與幾種關(guān)鍵的致癌信號通路發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，特別是AR，wnt，MAPK信號通路，可以促進(jìn)腫瘤的形成，影響前列腺癌的發(fā)展進(jìn)程，甚至使其產(chǎn)生耐藥性REF_Ref19631\r[23-REF_Ref19637\r24]。在CRPC的臨床治療上，采用AZD8186抑制PI3K?Akt信號通路，AZD8186是PI3K的抑制劑，可以有效的選擇性抑制PI3KCB和PI3KCD，影響癌細(xì)胞的形成REF_Ref22475\r[25]。此外，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（MET）與其配體的異常表達(dá)與前列腺癌的產(chǎn)生耐藥性密切相關(guān)。MET依賴藥物濃度在DU145和PC3細(xì)胞中高度表達(dá)，且容易影響PARP抑制劑的敏感性。MET抑制劑使ATM?ATR信號通路下調(diào)，抑制PI3K?Akt信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)CRPC對PARP抑制劑的敏感性，進(jìn)而增強(qiáng)PARP誘導(dǎo)的細(xì)胞抗腫瘤性，并為臨床治療提供新的靶點目標(biāo)REF_Ref19843\r[26]。CRPC的發(fā)生還與癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)有關(guān)。ATF4和ETS2基因不僅影響了信號通路而且影響癌細(xì)胞的代謝，ATF4和ETS2通過影響PI3K?Akt信號通路調(diào)節(jié)與代謝有關(guān)的酶，抑制糖原合成途徑。PI3K-Akt通過翻譯后修飾途徑對代謝酶進(jìn)行糖基化和磷酸化等化學(xué)修飾，使癌細(xì)胞糖酵解途徑加快，谷氨酰胺和脂肪酸代謝加快REF_Ref19856\r[27]。因此，抑制PI3K?Akt信號通路的治療為臨床上治療CRPC提供了有效的替代方案。圖3ATF4基因涉及的信號通路Figure3SignificantfunctionsofATF4targetedgenes圖4ETS2基因涉及的信號通路Figure4SignificantfunctionsofETS2targetedgenes2.4表觀修飾層面關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的比較研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)的重塑、小分子RNA干擾等表觀層面的修飾，在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展上發(fā)揮了重要作用。這些表觀修飾通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中控制基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，對其進(jìn)行重編程，驅(qū)動細(xì)胞惡性增長，逐步發(fā)展成癌細(xì)胞REF_Ref20026\r[28-REF_Ref20029\r29]。在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的功能異常與癌癥的轉(zhuǎn)移和耐藥具有密切的關(guān)系，特別是在患者接受過雄激素受體治療后，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在癌細(xì)胞不同亞型的發(fā)展中起到了推動的作用REF_Ref20114\r[30]。例如，在早期前列腺癌中，PSA（基因是KLK3）作為衡量AR活性的標(biāo)志物，常常被用在臨床上檢測患者是否可接受雄激素受體的治療。在患者發(fā)生耐藥后，研究發(fā)現(xiàn)AR在表觀修飾層面發(fā)生了明顯的全基因組范圍的重新編程，啟動子附近的組蛋白修飾的變化進(jìn)一步說明了重編程的存在，進(jìn)而引起了一些新的前列腺癌亞型的出現(xiàn)REF_Ref20251\r[31]。這些研究都說明了識別前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子對理解和揭示前列腺癌的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要，開發(fā)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的抑制劑是治療前列腺癌的重要方向。為了探究本文識別的CRPC中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子啟動子附近的組蛋白修飾情況，我們下載了公共數(shù)據(jù)庫中的CRPC病人來源的（PDX：PatientDerivedXenografts）樣本，包括其H3K27me3、H3K4me3和H3K27acChIP-Seq數(shù)據(jù)REF_Ref20343\r[32]。下載原始數(shù)據(jù)后，我們進(jìn)行了如下的數(shù)據(jù)處理步驟：(1)數(shù)據(jù)質(zhì)量矯正-fastqc。(2)去接頭-Trimgalore。(3)去除重復(fù)序列-picardtools。(4)將序列排序以便于比對-samtools。(5)序列比對到hg38版本的參考基因組上-bowtie2。(6)去除hg38參考基因組上的所有樣本中測序深度普遍偏高的基因組區(qū)域，將其定義為blacklistregion。-bedtools。(7)識別修飾信號的位點-Macs2。(8)獲取基因組上每個位點的修飾信號文件-deeptools。最終，我們得到了修飾位點的峰的位置和信號可視化文件，進(jìn)一步導(dǎo)入IGV軟件，得到ATF4和ETS2位置的信號，見圖5所示。結(jié)果顯示，在ATF4和ETS2啟動子區(qū)域具有很強(qiáng)的H3K4me3和H3K27ac修飾信號，這兩種組蛋白修飾表示基因的活性。由于較高的H3K27me3修飾信號表示基因被抑制的狀態(tài)，所以ATF4和ETS2啟動子區(qū)域較低的H3K27me3證明了這個基因并沒有被抑制。這些結(jié)果在表觀修飾層面進(jìn)一步證明了ATF4和ETS2是CRPC樣本中高度活躍的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的研究中，motifs分析能夠預(yù)測某些區(qū)域是否顯著地被其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，即能預(yù)測關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的上游，因此，我們對ATF4和ETS2轉(zhuǎn)錄起始位點2kb附近的區(qū)域進(jìn)行了motifs分析，見圖6所示，我們發(fā)現(xiàn)，ETS2的motifs中有ATF3，與ATF4同屬于一個家族的轉(zhuǎn)錄因子，我們推測，ATF4和ETS2在CRPC中的功能存在一定程度的重合或者互作。其他motifs結(jié)果也為ATF4和ETS2的上游研究提供了潛在的信息。圖5ATF和ETS2在10對PDX樣本中的組蛋白修飾信號Figure5HistonemodificationofATF4andETS2in10pairedCRPCPDXsamples圖6ATF4和ETS2轉(zhuǎn)錄起始位點上下游2kb的motifs分析（前5個motifs）Figure6ATF4andETS2motifsanalysisbasedonTSSup/down2kb(top5)2.5原發(fā)性和耐受性前列腺癌中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的潛在機(jī)制ATF4基因與氨基酸代謝、細(xì)胞氧化還原狀態(tài)和抗應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，特別是參與缺氧、氨基酸缺失、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激反應(yīng)。細(xì)胞中ATF4可以在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平上受到調(diào)節(jié)，進(jìn)而維持在一定水平濃度，但在大多數(shù)腫瘤中ATF4表達(dá)上調(diào)，大量ATF4表達(dá)的產(chǎn)物能增強(qiáng)腫瘤的缺氧耐受，促進(jìn)腫瘤的生長及血管生成因子的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)過程REF_Ref20503\r[33]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，ATF4與果糖代謝通路中的兩個關(guān)鍵基因SLC2A5和ALDOB的啟動子結(jié)合并激活基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行果糖代謝。利用基因編輯技術(shù)破壞SLC2A5和ALDOB啟動子區(qū)域與ATF4結(jié)合的DNA序列能有效抑制整合應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的果糖代謝REF_Ref20633\r[34-35]。ATF4信號通路能夠促進(jìn)細(xì)胞收集必要的氨基酸來維持腫瘤生長和生存。在細(xì)胞核內(nèi)，ATF4基因可通過C/EBP-ATF反應(yīng)元件結(jié)合靶向啟動子，從而參與氨基酸合成、蛋白質(zhì)正確折疊及降解、氧化還原平衡、自噬和凋亡等相關(guān)基因激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。ETS2是一種編碼參與細(xì)胞的發(fā)育與凋亡的轉(zhuǎn)錄因子基因，能夠調(diào)控與干細(xì)胞發(fā)育，細(xì)胞衰老，死亡及腫瘤形成有關(guān)的許多基因，ETS2基因與AR基因融合導(dǎo)致表觀遺傳的改變，使前列腺癌發(fā)生異質(zhì)性，促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展的進(jìn)程，同時，ETS基因融合體是前列腺癌中最常見的體細(xì)胞畸變，與脂質(zhì)代謝和細(xì)胞遷移有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ETS2是前列腺中主要基礎(chǔ)表達(dá)的基因，在普通型腺癌中表達(dá)低，在表達(dá)p63的癌中高水平表達(dá)。ETS2通過激活PI3K?Akt信號通路，進(jìn)而與AR，wnt，MAPK等幾種重要的信號通路發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成，使其產(chǎn)生耐藥性REF_Ref18916\r[27]。通過對這兩種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的研究，ATF4和ETS2均在CRPC的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用，該轉(zhuǎn)錄因子通過影響脂質(zhì)代謝和細(xì)胞遷移促進(jìn)癌癥的發(fā)生，對此臨床治療上可針對這兩種轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行靶向治療，進(jìn)而提高前列腺癌的生存率。本研究在大范圍的病人基因表達(dá)數(shù)據(jù)中識別到ATF4和ETS2作為CRPC中異?；钴S的轉(zhuǎn)錄因子，并且在表觀修飾層面進(jìn)行了進(jìn)一步驗證，揭示了ATF4和ETS2作為CRPC中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，潛在的致病機(jī)制。3結(jié)論本研究通過對前列腺癌數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，結(jié)合已被研究證實的前列腺癌關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可知TP63，F(xiàn)OS，STAT1，CEBPA，GATA2等基因在PCa中過表達(dá)。ATF4和ETS2在CRPC中過表達(dá)。上調(diào)的基因除了調(diào)控細(xì)胞的生長和增殖，控制細(xì)胞周期外，還影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)，改變細(xì)胞的表觀遺傳。ATF4和ETS2基因影響信號通路和癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝，ATF4和ETS2通過影響PI3K?Akt信號通路調(diào)節(jié)與代謝有關(guān)的酶，抑制細(xì)胞合成糖原。此外，PI3K?Akt信號通路與AR，Wnt，MAPK信號通路等幾種關(guān)鍵的致癌信號通路發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的形成，影響前列腺癌的發(fā)展進(jìn)程，使其產(chǎn)生耐藥性。臨床上最初采用切除睪丸，剝奪雄激素的治療手段對早期前列腺癌進(jìn)行治療，但到后期內(nèi)分泌治療對CRPC的作用微乎其微，而Abiraterone，Docetaxel化療，enzaulatmide對CRPC的抑制作用較為顯著，本文在高通量數(shù)據(jù)中，對CRPC中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)分析，識別出ATF4和ETS2關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的潛在功能，為深入理解前列腺癌的發(fā)病機(jī)制，耐藥機(jī)理提供了重要的方向，也為臨床治療CRPC上提供一個新的思路。參考文獻(xiàn)韓蘇軍.中國前列腺癌發(fā)病及死亡現(xiàn)狀和流行趨勢分析[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2015.ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina[J].

CACancerJClin,2016,66(2):115-132.曾浩,種鐵,賀大林,等.去勢抵抗性前列腺癌最新指南解讀——暨中國西部專家共識[J].現(xiàn)代泌尿外科,2017,22(2):85-94.劉博,張慶皎.去勢抵抗性前列腺癌的研究及治療進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)學(xué),2022,46(1):125-127.管考鵬.去勢抵抗性前列腺癌藥物治療現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床,2020,47(8):384-387.祁峰,李瀟,徐維章,等.TP53基因突變在前列腺癌患者中的臨床特征及預(yù)后價值[J].臨床泌尿外科,2022,37(12):906-910.范耀.抑癌基因RB1通過調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)阻止前列腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制[D].重慶:重慶醫(yī)科大學(xué),2021.牟睿宇,劉昭,王亮,等.去勢抵抗性前列腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2021,27(17):3401-3406.FitzgeraldAA,WeinerLM.Theroleoffibroblastactivationproteininhealthandmalignancy[J].

CancerMetastasisRev,2020,39(3):783-803.DaiC,HeemersH,SharifiN,etal.AndrogenSignalinginProstateCancer[J].

ColdSpringHarbPerspectMed,2017,7(9):430-452.SongB,ParkSH,ZhaoJC,etal.TargetingFOXA1-mediatedrepressionofTGF-βsignalingsuppressescastration-resistantprostatecancerprogression[J].

JClinInvest,2019,129(2):569-582.NouruziS,GanguliD,TabrizianN,etal.ASCL1activatesneuronalstemcell-likelineageprogrammingthroughremodelingofthechromatinlandscapeinprostatecancer[J].

NatCommun,2022,13(1):2282-2300.QianC,YangQ,FreedlandSJ,etal.activationofONECUT2byRB1lossincastration-resistantprostatecancer[J].

AmJClinExpUrol,2022,10(6):397-407.RotinenM,YouS,YangJ,etal.ONECUT2isatargetablemasterregulatoroflethalprostatecancerthatsuppressestheandrogenaxis[J].

NatMed,2018,24(12):1887-1898.曾紅,楊洋,安輸,等.Ets轉(zhuǎn)錄因子的生理作用研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報,2017,33(12):1645-1650.GrassoCS,WuYM,RobinsonDR,etal.Themutationallandscapeoflethalcastration-resistantprostatecancer[J].

Nature,2012,487(7406):239-243.LiaoY,ChenCH,XiaoT,etal.InhibitionofEZH2transactivationfunctionsensitizessolidtumorstogenotoxicstress[J].

ProcNatlAcadSciUSA,2022,119(3):2105-2119.MosqueraMJ,KimS,BarejaR,etal.ExtracellularMatrixinSyntheticHydrogel-BasedProstateCancerOrganoidsRegulateTherapeuticResponsetoEZH2andDRD2Inhibitors[J].

AdvMater,2022,34(2):2100-2126.KavyaK,KumarMN,PatilRH,etal.DifferentialexpressionofAP-1transcriptionfactorsinhumanprostateLNCaPandPC-3cells:roleofFra-1intransitiontoCRPCstatus[J].

MolCellBiochem,2017,433(1-2):13-26.WortelIMN,MeerLT,KilbergMS,etal.SurvivingStress:ModulationofATF4-MediatedStressResponsesinNormalandMalignantCells[J].

TrendsEndocrinolMetab,2017,28(11):794-806.TameireF,VerginadisII,LeliNM,etal.ATF4couplesMYC-dependenttranslationalactivitytobioenergeticdemandsduringtumourprogression[J].

NatCellBiol,2019,21(7):889-899.ZhangY,LiuZ.STAT1incancer[J].

DiscovMed,2017,24(130):19-29.ChenH,ZhouL,WuX,etal.ThePI3K/AKTpathwayinthepathogenesisofprostatecancer[J].

FrontBiosci,2016,21(5):1084-1091.ShorningBY,DassMS,SmalleyMJ,etal.ThePI3K-AKT-mTORPathwayandProstateCancer:AttheCrossro