放射免疫分析技術(shù)

關(guān)于放射免疫分析技術(shù)一、基本概念放射免疫測定（RAI）：根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，以放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)射線的多少定性或定量測定待檢標(biāo)本中抗體或抗原的量。同位素（isotope）：元素周期表中處于相同位置的某種元素所包含的若干種核素。放射性核素（radionuclide）：由于核內(nèi)中子數(shù)和質(zhì)子數(shù)的比例不適而自發(fā)地發(fā)生核衰變，在衰變過程中將放射出一種或幾種射線而轉(zhuǎn)變?yōu)閯e種核素的不穩(wěn)定核素。第2頁,共32頁，2024年2月25日，星期天1959年Yalow和Berson建立放射免疫測定（RIA）1960年競爭性蛋白結(jié)合分析（CPBA）1968年Miles和Hales建立免疫放射量度分析（IRMA）1968年放射受體分析法(RRA)1971年Addison和Hales建立雙位點或夾心IRMARIA方法學(xué)研究進(jìn)展第3頁,共32頁，2024年2月25日，星期天基本原理：放射性標(biāo)記的已知抗原（*Ag）和非標(biāo)記的待檢抗原（Ag）同時與限量的特異性抗體進(jìn)行競爭結(jié)合或競爭性抑制反應(yīng)，通過測定結(jié)合（*Ag-Ab）的或游離（*Ag）的放射性標(biāo)記抗原的量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算出被測物含量的一種超微量分析技術(shù)。RAI屬超微量分析技術(shù)，常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質(zhì)的測定。二、RIA原理第4頁,共32頁，2024年2月25日，星期天Ag

*AgAbBoundFree

BFB/F10.500.500.670.3320.50.330.670.20.170.83競爭放射分析原理示意圖第5頁,共32頁，2024年2月25日，星期天常用標(biāo)記放射性同位素及其性質(zhì)放射性元素半衰期射線種類及能量（百萬電子伏特）βγ

14C5720年0.155－

3H12.5年0.0189－

125I60天－0．035

131I8.05天0.608，0.335，0.2500.364，0.637，0.722第6頁,共32頁，2024年2月25日，星期天125I的優(yōu)點29種同位素，125I最為常用；

半衰期適中(60天)，易于商品化和儲存，也利于廢物處理；發(fā)射低能35kV

γ線易于測量，井型閃爍效率高；不發(fā)射β粒子，標(biāo)記物自分解速度低；標(biāo)記過程中，標(biāo)記物免疫損傷?。换瘜W(xué)性質(zhì)活潑，標(biāo)記Ag和Ab容易，可得到多種標(biāo)記物而廣泛應(yīng)用。第7頁,共32頁，2024年2月25日，星期天放射性核素標(biāo)記物制備的主要方法氯胺T法活化NaI中放射性碘離子乳過氧化酶法催化過氧氣化氫釋放新生態(tài)氧，使125I離子活化雙酶標(biāo)記法葡萄糖氧化酶提供過氧化氫作為乳過氧化酶底物氯甘脲標(biāo)記法活化NaI中放射性碘離子第8頁,共32頁，2024年2月25日，星期天放射性同位素標(biāo)記化合物的純化方法凝膠過濾法分離標(biāo)記蛋白與無機(jī)碘離子交換法用于分離純化短肽標(biāo)記物透析法將標(biāo)記蛋白與小分子化合物很好地分離電泳法分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質(zhì)親和層析法利用特異抗體或受體結(jié)合分離、純化標(biāo)記蛋白質(zhì)高效液相層析法分離效果好、快速ConA吸附法分離標(biāo)記糖蛋白第9頁,共32頁，2024年2月25日，星期天二、RIA操作程序配制已知濃度系列標(biāo)準(zhǔn)抗原（Ag）加待測抗原（Ag）和抗體（Ab）--溫育加標(biāo)記抗原（*Ag）和抗體（Ab）--溫育分離復(fù)合物*AgAb（B）和游離*Ag（F）用γ計數(shù)器測量放射性計數(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算機(jī)直接算出第10頁,共32頁，2024年2月25日，星期天5.測量4.去上清分離立即1.加樣1.樣品或標(biāo)準(zhǔn)品2.標(biāo)記物3.抗血清混勻溫浴2.加分離劑分離劑混勻3.離心第11頁,共32頁，2024年2月25日，星期天動態(tài)平衡體系中:*Ag與Ag具有同樣的免疫活性和結(jié)合反應(yīng)能力*Ag和Ab的量恒定Ag+*Ag的分子數(shù)大于抗體的分子數(shù)*Ag與Ag相互競爭同Ab結(jié)合，彼此抑制，待測Ag與*AgAb呈負(fù)相關(guān)函數(shù)關(guān)系測抗原（Ag）和抗體（Ab）--溫育第12頁,共32頁，2024年2月25日，星期天沉淀法加涂有右旋糖酐的活性碳（DCC）吸附小分子F，離心吸附法調(diào)pH值于γ球蛋白等電點，加入適當(dāng)濃度PEG或中性鹽過濾法小分子游離的放射性物質(zhì)F被抽吸通過濾膜而分離雙抗體法固相法SPA法入第二抗體，形成第二抗體復(fù)合物，離心抗體或抗原固相化，免疫反應(yīng)在固相載體上完成后洗滌金黃色葡萄球菌A蛋白促使AgAb較快速度沉淀結(jié)合抗原(B)與游離抗原(F)分離方法第13頁,共32頁，2024年2月25日，星期天三、RIA法標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)記抗原與被測物質(zhì)間的數(shù)量關(guān)系可以用抑制曲線來表示。這種曲線表示了結(jié)合抑制的程度與抑制物濃度兩者之間的特定函數(shù)關(guān)系，也稱為劑量反應(yīng)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的手工繪制形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線的形態(tài)可因所用的反應(yīng)變量表達(dá)形式的不同，或所采用坐標(biāo)系統(tǒng)不同而有不同的形態(tài)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的基本數(shù)學(xué)函數(shù)式放射免疫分析從抗原抗體反應(yīng)動力學(xué)分析，反應(yīng)是雙向性的，服從質(zhì)量作用定律。第14頁,共32頁，2024年2月25日，星期天

7550301001101001000未標(biāo)記抗原濃度（ng/ml)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）待測Ag與*AgAb呈負(fù)相關(guān)函數(shù)關(guān)系第15頁,共32頁，2024年2月25日，星期天RIA競爭抑制曲線類型注：橫坐標(biāo)為標(biāo)記抗原（*Ag）的濃度第16頁,共32頁，2024年2月25日，星期天四、建立放射免疫分析方法的必備條件對標(biāo)準(zhǔn)抗原的基本要求(1)標(biāo)準(zhǔn)抗朱與待測抗原的免疫性必須一致。

(2)抗原必須純度高。

(3)標(biāo)準(zhǔn)抗原的量必須準(zhǔn)確。

(4)標(biāo)準(zhǔn)抗原應(yīng)有很好的穩(wěn)定性。對抗血清的要求抗血清中含有對其相應(yīng)抗原的特異性抗體。檢查抗血清質(zhì)量的指標(biāo)主要有親和常數(shù)(K)、免疫交叉反應(yīng)率及滴度(或抗體效價)。對標(biāo)記抗原的要求(1)標(biāo)記抗原的免疫活性與待測抗原及標(biāo)準(zhǔn)品必須一致。(2)標(biāo)記抗原要有適當(dāng)高的放射性比活度。(3)標(biāo)記抗原應(yīng)具有足夠高的放射化學(xué)純度第17頁,共32頁，2024年2月25日，星期天衡量抗體質(zhì)量的指標(biāo)親和力:抗體結(jié)合的強(qiáng)度是RIA的前提特異性:不受交叉反應(yīng)物質(zhì)影響的程度滴度:抗體的效價——抗體實際應(yīng)用時的稀釋倍數(shù)第18頁,共32頁，2024年2月25日，星期天斜率＝－KAB/F301Ag-Ab濃度親和力測定（Scatchard作圖）第19頁,共32頁，2024年2月25日，星期天

100

500123456復(fù)合物放射性Log競爭劑濃度特異性的測定－－交叉反應(yīng)檢測交叉反應(yīng)率＝A50/B50×100％ABC第20頁,共32頁，2024年2月25日，星期天B%

100806040200100100010000100000抗血清稀釋度抗體滴度測定第21頁,共32頁，2024年2月25日，星期天五、放射免疫分析的設(shè)計方法◆標(biāo)譏抗原和抗體用量最佳化設(shè)計:1、標(biāo)記抗原用量選擇。2、抗血清的使用滴度選擇及其方法?！魳?biāo)準(zhǔn)抗原劑量設(shè)計1、標(biāo)準(zhǔn)抗原劑量范圍2、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍◆加樣順序設(shè)計◆反應(yīng)介質(zhì)◆反應(yīng)容積與溫度及時間1、縮小反應(yīng)容積可相應(yīng)減少抗體和標(biāo)記抗原的絕對用量，使非標(biāo)記抗原的競爭力相應(yīng)增強(qiáng)，有利于提高靈敏度。

2、抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的平衡結(jié)合常數(shù)K與溫度有關(guān)，必須通過實驗來確定最佳工作條件?！襞cF分離方法選擇◆樣品采集與保存第22頁,共32頁，2024年2月25日，星期天六、放射免疫分析的質(zhì)量控制◆誤差和放射免疫誤差的來源(1)誤差及其分類

(2)放射免疫分析誤差來源◆掌握質(zhì)量控制與質(zhì)控樣品(1)放射免疫分析的質(zhì)量控制內(nèi)容

(2)質(zhì)量控制樣品◆質(zhì)量控制指標(biāo)：靈敏度、精密度、偏倚和準(zhǔn)確度、特異性、穩(wěn)定性、臨床有效性。◆實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制：精密度的評價、批內(nèi)偏倚的評價和批間重現(xiàn)性評價?！魧嶒炇议g的外部質(zhì)量評價。第23頁,共32頁，2024年2月25日，星期天(一)、液相法已知放射標(biāo)記抗原待檢非標(biāo)記抗原+抗原抗體抗原抗體結(jié)合+分離沉淀物抗原抗體復(fù)合物上清液中游離抗原七、RIA技術(shù)類型和應(yīng)用第24頁,共32頁，2024年2月25日，星期天1.直接法IRMA示意圖標(biāo)記抗體抗原固相抗原離心測定（二）、固相法第25頁,共32頁，2024年2月25日，星期天2.雙位點法IRMA示意圖測定標(biāo)記抗體洗滌抗體抗原第26頁,共32頁，2024年2月25日，星期天八、免疫放射分析（IRMA）基本原理：用過量的核素標(biāo)記抗體與待測抗原形成復(fù)合物，并用固相免疫吸附劑作為B或F的分離手段除去多余的游離抗體，測量抗原抗體復(fù)合物的放射性。Ag

*Ab

Ag*Ab第27頁,共32頁，2024年2月25日，星期天固相抗體抗原過量的標(biāo)記抗體抗原固相抗原過量標(biāo)記的抗體雙位點IRMA

單位點IRMA

第28頁,共32頁，2024年2月25日，星期天結(jié)合率（%）Ag劑量RIAIRMA和RIA曲線形態(tài)比較結(jié)合率（%）Ag劑量IRMA第29頁,共32頁，2024年2月25日，星期天IRMA與RIA的工作原理的主要區(qū)別項目RIAIRMA反應(yīng)機(jī)制競爭性反應(yīng)非競爭性全量反應(yīng)靈敏度提高（10-100倍）反應(yīng)試劑三種標(biāo)記抗原二種標(biāo)記抗體分離方法抗原只需一個抗原決定簇一般需單抗作分離劑，抗原需兩個或兩個以上決定簇待測抗原復(fù)合物放射性與待測抗原呈負(fù)相關(guān)與待測抗原呈正相關(guān)非特異性結(jié)合主要影響高劑量反應(yīng)主要影響低劑量反應(yīng)待檢抗原性質(zhì)半抗原及大分