生物技術(shù)與食品安全檢測

關(guān)于生物技術(shù)與食品安全檢測

第二節(jié)生物傳感器與食品安全檢測1生物傳感器的基本概念

生物傳感器通常是指由一種生物敏感部件和轉(zhuǎn)化器緊密結(jié)合,對特定種類化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。

它是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種先進(jìn)的檢測與監(jiān)控方法,也是對食品質(zhì)量在分子水平上進(jìn)行快速和微量分析的方法。第2頁,共65頁，2024年2月25日，星期天２生物傳感器工作原理待測物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入固定生物膜敏感層，經(jīng)分子識(shí)別而發(fā)生生物學(xué)作用，產(chǎn)生的信息如光、熱、音等被相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭啥亢吞幚淼碾娦盘?hào)，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，以電極測定其電流值或電壓值，從而換算出被測物質(zhì)的量或濃度。第3頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

２.1將化學(xué)變化轉(zhuǎn)變成電信號(hào)如酶傳感器,酶催化特定底物發(fā)生反應(yīng),從而使特定生成物的量有所增減。用能把這類物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置和固定化酶耦合,即組成酶傳感器,常用轉(zhuǎn)換裝置有氧電極、過氧化氫。第5頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

2.2將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)

固定化的生物材料與相應(yīng)的被測物作用時(shí)常伴有熱的變化。例如大多數(shù)酶反應(yīng)的熱焓變化量在25-100kJ/mol的范圍.這類生物傳感器的工作原理是把反應(yīng)的熱效應(yīng)借熱敏電阻轉(zhuǎn)換為阻值的變化,后者通過有放大器的電橋輸入到記錄儀中。第6頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

２.３將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)例如，過氧化氫酶,能催化過氧化氫/魯米諾體系發(fā)光,因此如設(shè)法將過氧化氫酶膜附著在光纖或光敏二極管的前端,再和光電流測定裝置相連,即可測定過氧化氫含量.

還有很多細(xì)菌能與特定底物發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生熒光.也可以用這種方法測定底物濃度.第7頁,共65頁，2024年2月25日，星期天上述三類傳感器原理的共同點(diǎn)：都是將分子識(shí)別元件中的生物敏感物質(zhì)與待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),將反應(yīng)后所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化再通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)進(jìn)行測量,這種方式統(tǒng)稱為間接測量方式.第8頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

２.4直接產(chǎn)生電信號(hào)方式這種方式可以使酶反應(yīng)伴隨的電子轉(zhuǎn)移、微生物細(xì)胞的氧化直接(或通過電子遞體的作用)在電極表面上發(fā)生。根據(jù)所得的電流量即可得底物濃度。第9頁,共65頁，2024年2月25日，星期天３生物傳感器發(fā)展歷程開端于

20世紀(jì)

60年代。1962年克拉克等人報(bào)道了用葡萄糖氧化酶與氧電極組合檢測葡萄糖的結(jié)果

,可認(rèn)為是最早提出了生物傳感器(酶傳感器)的原理。1967年Updike等人實(shí)現(xiàn)了酶的固定化技術(shù)

,研制成功酶電極

,這被認(rèn)為是世界上第一個(gè)生物傳感器。

第10頁,共65頁，2024年2月25日，星期天20世紀(jì)70年代中期后,生物傳感器技術(shù)的成功主要集中在對生物活性物質(zhì)的探索、活性物質(zhì)的固定化技術(shù)、生物電信息的轉(zhuǎn)換以及生物傳感器等研究

,并獲得了較快的進(jìn)展。1977年,鈐木周一等發(fā)表了關(guān)于對生化需氧量(BOD)進(jìn)行快速測定的微生物傳感器的報(bào)告

,

正式提出了對生物傳感器的命名。第11頁,共65頁，2024年2月25日，星期天４生物傳感器分類

4.1根據(jù)傳感器輸出信號(hào)的產(chǎn)生方式,可分為生物親合型生物傳感器、代謝型或催化型生物傳感器;*4.2根據(jù)生物傳感器的信號(hào)轉(zhuǎn)換器可分為電化學(xué)生物傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、測熱型生物傳感器、測光型生物傳感器、測聲型生物傳感器等

4.3根據(jù)生物傳感器中生物分子識(shí)別元件上的敏感材料可分為酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、組織傳感器、基因傳感器、細(xì)胞及細(xì)胞器傳感器。第12頁,共65頁，2024年2月25日，星期天每一類名稱又都包含許多種具體的生物傳感器例如，酶電極類:根據(jù)所用酶的不同就有幾十種，如葡萄糖電極、尿素電極、尿酸電極、膽固醇電極、乳酸電極、丙酮酸電極等等．葡萄糖電極也并非只有一種，有用pH電極或碘離子電極作為轉(zhuǎn)換器的電位型葡萄糖電極，有用氧電極或過氧化氫電極作為轉(zhuǎn)換器的電流型葡萄糖電極等．實(shí)際上還可再細(xì)分。第13頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

生物親合型傳感器被測物質(zhì)與分子識(shí)別元件上的敏感物質(zhì)具有生物親合作用，即二者能特異地相結(jié)合，同時(shí)引起敏感材料的分子結(jié)構(gòu)和/或固定介質(zhì)發(fā)生變化。例如：電荷、溫度、光學(xué)性質(zhì)等的變化。反應(yīng)式可表示為：

S（底物）+R（受體）=SR第15頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

代謝型傳感器底物（被測物）與分子識(shí)別元件上的敏感物質(zhì)相作用并生成產(chǎn)物，信號(hào)轉(zhuǎn)換器將底物的消耗或產(chǎn)物的增加轉(zhuǎn)變?yōu)檩敵鲂盘?hào)，這類傳感器稱為代謝型傳感器，其反應(yīng)形式可表示為

S（底物）＋R（受體）=SR→P（生成物）

第16頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共65頁，2024年2月25日，星期天生物傳感器優(yōu)點(diǎn)：由于具有較高的選擇性，因此不需對被測組分進(jìn)行分離，即不用對樣品進(jìn)行預(yù)處理。結(jié)構(gòu)簡單，體積小，使用方便，特別是便攜式的生物傳感器，非常有利干食品質(zhì)量的市場快速評價(jià)；第18頁,共65頁，2024年2月25日，星期天可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)的在線檢測，使食品加工過程的質(zhì)量控制變得簡便；響應(yīng)速度快，樣品用量少；與其他大型分析儀器相比，生物傳感器的制作成本低，且可反復(fù)使用。第19頁,共65頁，2024年2月25日，星期天6生物傳感器組成部分一是生物分子識(shí)別元件(感受器),是具有分子識(shí)別能力的生物活性物質(zhì)(如組織切片、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、酶、抗體、核酸、有機(jī)物分子等);二是信號(hào)轉(zhuǎn)換器(換能器),主要有電化學(xué)電極(如電位、電流的測量)、光學(xué)檢測元件、熱敏電阻、場效應(yīng)晶體管、壓電石英晶體及表面等離子共振器件等，當(dāng)待測物與分子識(shí)別元件特異性結(jié)合后,所產(chǎn)生的復(fù)合物(或光、熱等)通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘?hào)、光信號(hào)等,從而達(dá)到分析檢測的目的。第20頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（一）生物識(shí)別元件

它是酶、抗原(體)、細(xì)胞器、組織切片和微生物細(xì)胞等生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對被測定的物質(zhì)有選擇性的分子識(shí)別能力.第21頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（二）換能器它能將識(shí)別元件上進(jìn)行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，在一定條件下，產(chǎn)生的電信號(hào)強(qiáng)度和反應(yīng)中物質(zhì)的變化量或光、熱等的強(qiáng)度呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。第22頁,共65頁，2024年2月25日，星期天換能器(信號(hào)轉(zhuǎn)換器)將分子識(shí)別元件進(jìn)行識(shí)別時(shí)所產(chǎn)生的化學(xué)的或物理的變化轉(zhuǎn)換成可用信號(hào)．生物傳感器的信號(hào)轉(zhuǎn)換器已有許多種，其中到目前為止用得最多的且比較成熟的是電化學(xué)電極，用它組成的生物傳感器稱為電化學(xué)生物傳感器．第23頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（三）信號(hào)處理放大裝置

主要負(fù)責(zé)信號(hào)的分析處理和放大輸出。它能將換能器產(chǎn)生的電信號(hào)進(jìn)行處理、放大和輸出。第24頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共65頁，2024年2月25日，星期天手掌型葡萄糖(glucose)分析儀第26頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

6.2傳感器類型

(1)酶傳感器(EnzymeSensor)第27頁,共65頁，2024年2月25日，星期天酶的活力單位（酶單位）標(biāo)準(zhǔn)酶單位國際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶委員會(huì)規(guī)定了酶單位的標(biāo)準(zhǔn)形式為：一個(gè)酶單位（U）是在特定的條件下lmin內(nèi)催化形成1μmol產(chǎn)物的酶量（或轉(zhuǎn)化1mo1底物的酶量）．特定條件一般是指選定的條件，如溫度為25℃，30℃，37℃，最適pH,底物為飽和溶液．第28頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

酶傳感器它將活性物質(zhì)酶覆蓋在電極表面,酶與被測的有機(jī)物或無機(jī)物反應(yīng),形成一種能被電極響應(yīng)的物質(zhì)。1967年Updick和Hicks將固定化的葡萄糖氧化酶膜結(jié)合在氧電極上,做成了第一支葡萄糖電極；此后,這類酶傳感器通常是通過檢測產(chǎn)物H2O2的濃度變化或氧的消耗量來檢測底物。第29頁,共65頁，2024年2月25日，星期天葡萄糖電極缺點(diǎn):(1)溶解氧的變化可能引起電極響應(yīng)的波動(dòng);(2)由于氧的溶解度有限,當(dāng)溶解氧貧乏時(shí),響應(yīng)電流明顯下降而影響檢測限;(3)傳感器響應(yīng)性能受溶液pH值和溫度影響較大第30頁,共65頁，2024年2月25日，星期天依據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換器的類型,酶傳感器大致可分為酶電極(主要包括離子選擇電極、氣敏電極、氧化還原電極等電化學(xué)電極)、酶場效應(yīng)晶體管傳感器(FET-酶)和酶熱敏電阻傳感器等第31頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

(2)組織傳感器(TissueSensor)組織傳感器是以動(dòng)植物組織薄片中的生物催化層與基礎(chǔ)敏感膜電極結(jié)合而成,該催化層以酶為基礎(chǔ),基本原理與酶傳感器相同.與酶傳感器比較，組織傳感器具有如下優(yōu)點(diǎn)：1.酶活性較離析酶高.2.酶的穩(wěn)定性增大.3.材料易于獲得.第32頁,共65頁，2024年2月25日，星期天肝組織電極動(dòng)物肝組織中含有豐富的H2O2酶，可與氧電極組成測定H2O2及其它過氧化物的組織電極．1981年Mascini等研究了數(shù)種哺乳動(dòng)物和其它動(dòng)物（鳥、魚、龜）的肝組織電極，翌年，報(bào)道了基于牛肝組織的H2O2電極．第33頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

若向溶液中通以氮?dú)?，以降低氧的溶解度，減少空氣平衡溶液中氧的殘余電流（約10μA）至十分之幾微安，檢測下限可降低至1X10-5mol／L，相關(guān)系數(shù)R=0.997(n＝9)第34頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

植物組織膜電極結(jié)構(gòu)圖解

b一果皮,c-中果皮,d-內(nèi)果皮1-中果皮組織薄片2-固定化骨架3-透氣健,4-墊圈5-內(nèi)電解質(zhì)6-復(fù)合PH電極7-塑料電極體二氧化碳?xì)饷綦姌O結(jié)構(gòu)第35頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

(3)微生物傳感器微生物傳感器分為兩類：一類是利用微生物在同化底物時(shí)消耗氧的呼吸作用；另一類是利用不同的微生物含有不同的酶。第36頁,共65頁，2024年2月25日，星期天裝置：由適合的微生物電極與氧電極組成。原理：利用微生物的同化作用耗氧,通過測量氧電極電流的變化量來測量氧氣的減少量,從而達(dá)到測量底物濃度的目的.第37頁,共65頁，2024年2月25日，星期天例如,熒光假單胞菌,能同化葡萄糖；蕓苔絲孢酵母可同化乙醇,因此可分別用來制備葡萄糖和乙醇傳感器，這兩種細(xì)菌在同化底物時(shí),均消耗溶液中的氧,因此可用氧電極來測定基于不同類型的信號(hào)轉(zhuǎn)換器,常見的微生物傳感器有電化學(xué)型、光學(xué)型、熱敏電阻型、壓電高頻阻抗型和燃料電池型，第38頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

(4)核酸傳感器依據(jù)生物體內(nèi)核苷酸順序相對穩(wěn)定,核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理而設(shè)計(jì)出核酸探針傳感器,即基因傳感器?；騻鞲衅饕话阌?0~30個(gè)核苷酸的單鏈核酸分子,能夠?qū)Ｒ坏嘏c特定靶序列進(jìn)行雜交從而檢測出特定的目標(biāo)核酸分子。根據(jù)換能器種類不同可分為電化學(xué)型、光學(xué)型、壓電免疫傳感器及表面等離子體共振型基因傳感器，這種傳感器可用于檢測食品中的病原體,為食品中病原體的鑒定提供了新的手段。第40頁,共65頁，2024年2月25日，星期天7生物傳感器的應(yīng)用在食品分析中的應(yīng)用在發(fā)酵工程中的應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用在軍事上的應(yīng)用第41頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

7.1在食品分析的應(yīng)用食品成分分析食品添加劑的分析農(nóng)藥和抗生素殘留量分析微生物和生物毒素的檢驗(yàn)食品鮮度的檢測第42頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（一）食品鮮度的測定1、魚鮮度傳感器魚鮮度傳感器在日本、拿大等國廣泛用于魚類鮮度的測定。魚死后體內(nèi)ATP經(jīng)酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黃嘌呤和尿酸、鮮度可用K值表示：第46頁,共65頁，2024年2月25日，星期天K=肌苷+次黃嘌呤/(ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+次黃嘌呤+尿酸)當(dāng)K＜20時(shí)，魚極新鮮，可供生食。K在20～40之問為新鮮，必須熟食。K大于40，不新鮮，不宜食用，這與嗅覺檢驗(yàn)結(jié)果相一致。第47頁,共65頁，2024年2月25日，星期天由于大多數(shù)魚死后5～20h，ATP，ADP

和AMP已分解盡，超過24h，鮮度主要取決于IMP-肌苷-次黃嘌呤-尿酸。基于此，Karube等催化將這3個(gè)步驟的三種酶（5’－核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶）固定在氧電極上，制成魚鮮度測定儀。第48頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2.肉鮮度傳感器

肉類在腐敗過程中會(huì)產(chǎn)生各種胺類，故胺類測定也能反映肉類的新鮮程度。用腐胺氧化酶與過氧化氫電極構(gòu)成多胺生物傳感器，測定肉在貯藏過程中的鮮度，反應(yīng)時(shí)間40s，測定腐胺線性范圍為0.03～3×10-4mol／L。用單胺氧化酶膜和氧電極組成的酶傳感器測定可以豬肉新鮮度，響應(yīng)時(shí)間為4min，單胺測定線性范圍為50～20×10-4mol／L。第49頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3.食品添加劑的分析過量的食品添加劑通常會(huì)對人體造成危害，因此對食品中添加劑含量進(jìn)行分析和監(jiān)測是非常必要的。亞硫酸鹽是常用的食品防腐劑和漂白劑，但是亞硫酸鹽容易引起哮喘，因此美國FDA規(guī)定了其在新鮮水果和蔬菜等食品中的含量不得超過1×10-6mol/L。第50頁,共65頁，2024年2月25日，星期天Groom等人將亞硫酸氧化酶固定于玻璃電極上，制成了測定亞硫酸鹽的生物傳感器，其靈敏度（檢出下限）達(dá)到5nmol/L，線形范圍為0-5mmol/L，電極在3mol/L的硫酸鹽溶液中4oC保存2個(gè)月活性不變。第51頁,共65頁，2024年2月25日，星期天天冬酰苯丙氨酸甲酯，又稱甜味素，是人工合成的低熱量甜味劑。Guilbault等將天冬氨酸酶固定于氨電極上，制成生物傳感器，其檢測線性范圍為0.4-0.8mmol/L。第52頁,共65頁，2024年2月25日，星期天4.污染微生物的檢測

1）腐敗菌的檢測Matssunage等人開發(fā)出一種基于微生物在代謝過程中能產(chǎn)生電子，電子直接在陽極上放電產(chǎn)生電流，通過測定電流大小從而測定微生物濃度的傳感器。用該傳感器能很好地檢測釀酒酵母和乳酸菌等微生物的數(shù)量第53頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2

病原菌的檢測

常見的污染食品的病原菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌等。采用生物傳感器則能迅速地測定它們的數(shù)量。用來測定病原菌的生物傳感器主要是光纖生物傳感器、免疫生物傳感器和DNA生物傳感器。第54頁,共65頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵罐主機(jī)計(jì)算機(jī)7.2在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用

-為發(fā)酵自動(dòng)控制提供了新的基礎(chǔ)平臺(tái)第55頁,共65頁，2024年2月25日，星期天1)、發(fā)酵中葡萄糖測定

過去用操作繁瑣時(shí)間長的還原糖方法只能近似地估計(jì)葡萄糖的變化?，F(xiàn)在提供了快速而準(zhǔn)確的固定化酶的測定方法，發(fā)酵中可根據(jù)糖消耗確定微生物的生長速率，觀察是否染菌，隨時(shí)與產(chǎn)物的產(chǎn)生一起估算轉(zhuǎn)化率，確定補(bǔ)料效果和及時(shí)判斷發(fā)酵結(jié)束的時(shí)間。發(fā)酵過程或設(shè)備異?，F(xiàn)象通過葡萄糖分析得到及時(shí)預(yù)報(bào)。

第56頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2)、谷氨酸發(fā)酵液的分析在谷氨酸發(fā)酵中，隨時(shí)跟蹤目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生?？焖佾@得主控參數(shù)的變化信息，使時(shí)間縮短了幾十倍。在發(fā)酵前期及時(shí)知道產(chǎn)酸出現(xiàn)時(shí)間在發(fā)酵中期可根據(jù)谷氨酸產(chǎn)生速率，預(yù)知最終的產(chǎn)量，并獲得補(bǔ)氨是否均勻的信息在發(fā)酵后期，可根據(jù)谷氨酸產(chǎn)生速率變慢情況確定放罐時(shí)間和今后配料的調(diào)整第57頁,共65頁，2024年2月25日，星期天在我國發(fā)酵工廠普及應(yīng)用的谷氨酸-葡萄糖雙功能分析儀工廠發(fā)酵車間化驗(yàn)員正在分析樣品第58頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3、乳酸傳感器在發(fā)酵上的應(yīng)用乳酸測定是生物