新基因功能研究的策略與方法

關(guān)于新基因功能研究的策略與方法隨著生命科學(xué)的發(fā)展及研究領(lǐng)域的不斷開(kāi)拓和生物醫(yī)學(xué)研究在分子水平上的不斷深入和推進(jìn)，越來(lái)越多的未知新基因和基因的新功能被發(fā)現(xiàn),越來(lái)越多的新基因被得以成功克隆，因此對(duì)新基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容和首要任務(wù)。第2頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天一.新基因的生物信息學(xué)及體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析;二.新基因的體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析三.功能獲得與功能失活策略研究;四.功能失活策略五.基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究基因功能的研究策略主要包括：第3頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天

目前，生物信息學(xué)分析已成為新基因功能研究首選和必用方法，其具有方便快捷和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。研究者往往可以從中得到與新基因功能有關(guān)的重要信息，初步推測(cè)基因的可能功能，進(jìn)而制定出進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室研究方案。（1）編碼產(chǎn)物預(yù)測(cè)分析（2）序列同源性分析（3）蛋白質(zhì)功能域分析一.新基因的生物信息學(xué)及體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析第4頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）mRNA水平的表達(dá)譜分析；（2）蛋白質(zhì)水平的表達(dá)分析。二.新基因的體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析要開(kāi)展新基因功能的研究工作，首要的研究任務(wù)摸清新基因在體內(nèi)的表達(dá)規(guī)律。包括從mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上來(lái)對(duì)其基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，即看其在各種不同的正?；虿B(tài)組織細(xì)胞中是否表達(dá)以及表達(dá)的水平高低等.新基因在某一特定的正常組織細(xì)胞中的表達(dá)水平高往往提示其在其中發(fā)揮著重要作用，而新基因在相應(yīng)的病態(tài)組織中的表達(dá)異常則提示與該病理過(guò)程相關(guān)的生物學(xué)意義。第5頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天三.功能獲得策略

新基因功能研究的功能獲得策略即通過(guò)將新基因直接導(dǎo)入到某一細(xì)胞或個(gè)體中，通過(guò)觀察細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體表型遺傳性狀的變化來(lái)鑒定基因的功能，常用的方法有：（1）基因轉(zhuǎn)染技術(shù)（2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)第6頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天四.功能失活策略

通過(guò)觀察某一細(xì)胞或個(gè)體在新基因的功能部分或全部失活后的細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體表型遺傳性狀變化來(lái)鑒定基因的功能。常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技術(shù)和基因敲除等（1）基因沉默技術(shù)（2）基因敲除第7頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天五.基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究

細(xì)胞各種基本功能的完成離不開(kāi)蛋白質(zhì)之間的相互作用以及通過(guò)相互作用而形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，確定能夠與新基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)終產(chǎn)物相互作用的上下游蛋白質(zhì)分子，也是研究新基因功能的一個(gè)十分重要的方面。目前常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)包括傳統(tǒng)的基親和分析而建立的免疫共沉淀技術(shù)和酵母雙雜交系統(tǒng).（1）免疫共沉淀技術(shù)（2）酵母雙雜交系統(tǒng)第8頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天

研究者往往最開(kāi)始得到有價(jià)值的EST序列，進(jìn)而通過(guò)電子延伸或和相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法獲取其全長(zhǎng)cDNA序列。這種情況下，首先要進(jìn)行即是進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA序列的開(kāi)放閱讀框查找，推導(dǎo)其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。然后，進(jìn)行信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)分析。初步判定其亞細(xì)胞定位，再進(jìn)行蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析，包括氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、親/疏水性等。最后，以已知的氨基酸序列的基礎(chǔ)，分析預(yù)測(cè)其高級(jí)結(jié)構(gòu)。編碼產(chǎn)物預(yù)測(cè)分析第9頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天規(guī)律分析Cs3亞基蛋白的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析第10頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天序列同源性分析

包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析，這也是目前生物信息學(xué)技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的基本技術(shù)之一。主要采用BLAST和FASTA程序進(jìn)行，即從已知的各種核酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與新基因?qū)?yīng)的功能已知的高度同源基因和蛋白質(zhì)，從這些已知基因和蛋白質(zhì)的功能信息中來(lái)初步推測(cè)和判斷新基因的功能。同時(shí)，因?yàn)槿祟惾蚪M測(cè)序已經(jīng)完成，所以以新基因的cDNA序列來(lái)對(duì)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，則可很方便地獲得與其完全同源基因組DNA

第11頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天序列及其染色體定位信息，而無(wú)需進(jìn)行熒光原位雜交等基因染色體定位技術(shù)，進(jìn)而還可通過(guò)分析其內(nèi)含子、外顯子序列及其調(diào)節(jié)位點(diǎn)，推測(cè)其可能的基因表達(dá)調(diào)控方式。即通過(guò)此法確定了富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白新基因的基因組DNA序列及其染色體定位。用expay軟件分析氨基酸序列同源性第12頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天

主要是通過(guò)聯(lián)網(wǎng)或數(shù)據(jù)庫(kù)行蛋白質(zhì)是基因功能的體現(xiàn)者和施行者，而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)則是蛋白質(zhì)執(zhí)行生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，因此對(duì)新基因所編碼蛋白質(zhì)的功能域分析將對(duì)推測(cè)新基因功能提供極其有價(jià)值的信息。目前，已經(jīng)有大量被發(fā)現(xiàn)的蘊(yùn)藏于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的與特定生物學(xué)活性相關(guān)的所謂保守模體。蛋白質(zhì)功能域分析第13頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域分析第14頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天mRNA水平的表達(dá)譜分析

對(duì)新基因在mRNA水平上的表達(dá)分析涉及到的技術(shù)有半定量RT-PCR、實(shí)時(shí)定量RT-PCR和NorthernBlot等。半定量RT-PCR方法具有簡(jiǎn)便、快捷和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，但其存在著精確度不高和不能進(jìn)行絕對(duì)定量等缺點(diǎn)，多用于基因表達(dá)水平的快速初步分析。實(shí)時(shí)定量RT-PCR是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種mRNA定量分析技術(shù)，因具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染和自動(dòng)化程度高等的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，但其成本相對(duì)較高。NorthernBlot歷來(lái)是在mRNA水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析的經(jīng)典技術(shù)，被各實(shí)驗(yàn)室廣泛采用其不僅可以進(jìn)行定量分析，而且還能夠檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄本的大小及種類，這也是RT-PCR技術(shù)所不具備的優(yōu)勢(shì)但NorthernBlot操作較為繁瑣，采用放射性標(biāo)記時(shí)也存在放射性污染的問(wèn)題。在實(shí)際工作中，需結(jié)合這兩類方法同時(shí)進(jìn)行，互為補(bǔ)充。另外，必要時(shí)也應(yīng)考慮使用原位雜交技術(shù)來(lái)對(duì)新基因的mRNA在特定組織細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行定位觀察。第15頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的水平表達(dá)分析確定新基因在哪些組織細(xì)胞被轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)一步的工作則是制備相應(yīng)的抗體來(lái)檢測(cè)其蛋白質(zhì)終產(chǎn)物的表達(dá)情況，如該蛋白質(zhì)表達(dá)的亞細(xì)胞定位、分子質(zhì)量大小、聚體形式等。這種在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)分析涉及到的常用技術(shù)主要是WesternBlot和免疫組化等。

其中，WesternBlot與NorthernBlot類似，不僅可以進(jìn)行定量分析，而且還能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小及其聚體形式。而免疫組化技術(shù)的優(yōu)勢(shì)則在于其能夠確定蛋白質(zhì)是在特定組織中的哪些細(xì)胞以及在特定細(xì)胞的哪個(gè)部位中表達(dá)。Westernblot第16頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天另外，對(duì)于病態(tài)組織細(xì)胞而言，在mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上的新基因的表達(dá)分析，還可以提供其基因表達(dá)調(diào)控的大致規(guī)律，譬如是主要在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平上被調(diào)控的。不少研究表明，細(xì)胞內(nèi)特定基因的mRNA水平變化和蛋白質(zhì)水平變化的一致性很差。第17頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因轉(zhuǎn)染技術(shù)通過(guò)基因轉(zhuǎn)染，即將目的基因轉(zhuǎn)入某一細(xì)胞中通過(guò)觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化來(lái)認(rèn)識(shí)基因的功能，是目前應(yīng)用最多、技術(shù)最成熟的基因功能研究方法。第18頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天如經(jīng)典的RAS癌基因的功能即通過(guò)轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞而得以鑒定目前常用的基轉(zhuǎn)染系統(tǒng)分為非病毒性表達(dá)系統(tǒng)和病毒性表達(dá)兩種，非病毒性表達(dá)載體目前主要采用質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)、電穿孔等方法使目的基因被宿主細(xì)胞攝取，然而，盡管這類表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，其也有不少局限性，主要問(wèn)題是，不同細(xì)胞類型對(duì)外源DNA的攝取能力有所不同，尤其在初級(jí)未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中幾乎是無(wú)效的，而初級(jí)細(xì)胞對(duì)于觀察基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性等行為恰恰非常有用。然而，病毒性載體，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用卻能夠很好的解決此問(wèn)題，這類以病毒為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移因其具有轉(zhuǎn)染效率高、目的基因可穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。第19頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)基因技術(shù)

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，則可將外源基因引入動(dòng)物體內(nèi)，建立攜帶并且能夠遺傳給子代的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表型分析研究外源基因的功能，目前已經(jīng)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立了數(shù)千種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并且還可以通過(guò)在攜帶外源基因的載體上加上組織特異性啟動(dòng)子等手段，從而控制外源基因在特定的時(shí)間或特定的組織器官表達(dá)。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)研究基因功能的優(yōu)勢(shì)在于它是一個(gè)在活體水平上的多維的研究體系，可以從分子到個(gè)體水平進(jìn)行多層次、多方位的研究。

第20頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因沉默技術(shù)

這類技術(shù)中最常用的主要為反義寡核苷酸（ASON）、核酶和RNA干擾（RNAi）技術(shù)。然而，包括這3種技術(shù)在內(nèi)的該類技術(shù)均具有誘導(dǎo)干擾素和其它細(xì)胞因子表達(dá)等非特異性效應(yīng)，另外，它們也會(huì)因?yàn)樽饔门c和靶分子序列相近的分子而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，其中，ASON因使用劑量大，其非特異性效應(yīng)最大；而RNAi的這兩種副效應(yīng)最小。第22頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因敲除

或稱基因打靶，是建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上的一種方法。既可以在細(xì)胞水平上進(jìn)行，從而建立新的細(xì)胞系，也可以在整體水平進(jìn)行以建立基因敲除動(dòng)物，通過(guò)觀察個(gè)體的表型變化而推測(cè)基因在體內(nèi)的可能功能。利用基因敲除技術(shù)獲得的基因敲除動(dòng)物已成為目前研究基因功能最直接和最有效的方法之一。但因技術(shù)條件和費(fèi)用較高、僅限于小鼠等缺點(diǎn)，且在胚胎期消除了目的基因的功能，可能只反映一部分基因功能；或者某些重要基因被剔除后可導(dǎo)致小鼠在胚胎期凋亡，無(wú)法檢測(cè)對(duì)各發(fā)育階段的影響，使基因剔除技術(shù)的應(yīng)用受到限制。同時(shí)很多情況下，其結(jié)果也是不明朗的。第23頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因敲除小鼠技術(shù)第24頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀技術(shù)第25頁(yè),共28頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，所處的環(huán)境條件也是接近天然狀態(tài)的，能夠反映體內(nèi)的相互作用情況，也可以分離到天然狀態(tài)的相互