蛋白質(zhì)組分析課件

第十三講

蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析

1本章內(nèi)容9.1二維凝膠電泳數(shù)據(jù)分析9.2蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析9.3蛋白質(zhì)互作生物信息學9.4分析細胞通路的生物信息學方法234Whyproteomics？5Proteomics1994年，澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams首先提出了蛋白質(zhì)組（Proteome）的概念，其定義為在一種細胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)?！?..theanalysisofcompletecomplementofproteins.

Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction."(StanleyFields,UniversityofWashington,Seattle,inScience,291,1221(2001))整體性、動態(tài)性和系統(tǒng)性6Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.7

從整體的角度,分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律的一個新的研究領(lǐng)域aeukaryoticCell蛋白質(zhì)組學(proteomics)891011Biology/Disease-drivenHPP

12蛋白質(zhì)組學研究范疇蛋白質(zhì)及其組成質(zhì)點的分離、分析、鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)--蛋白質(zhì)生理、病理或不同發(fā)育狀態(tài)下蛋白質(zhì)組表達差異蛋白質(zhì)信息庫13蛋白質(zhì)組學應(yīng)用舉例研究細胞結(jié)果功能和分子組成發(fā)現(xiàn)新的藥物靶位點發(fā)現(xiàn)新型生物學活性的分子和藥物差異蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)細菌、病毒感染和疾病監(jiān)測的分子標志物修飾蛋白質(zhì)組學遺傳或藥理學擾動的分子解剖病理生理學研究中藥機理相互作用蛋白質(zhì)組學研究藥物作用方式和毒性機理植物抗蟲抗旱抗逆遺傳育種和分子育種資源環(huán)境海洋生物141516尋找差異蛋白質(zhì)環(huán)孢素A處理前環(huán)孢素A處理后正常組織腫瘤組織細胞組織171819Initialgoalwastorapidlyidentifyalltheproteinsexpressedbyacellortissue–agoalthathasyettobeachievedforanyspecies!20蛋白質(zhì)組學比基因組學研究復(fù)雜蛋白質(zhì)數(shù)量大于基因數(shù)蛋白質(zhì)是動態(tài)的蛋白質(zhì)序列復(fù)雜，不能PCR擴增，不能自動化測序21GenomicDNAmRNABiologicalsystemFunctionalproteinProteinproductstechnologyemergingprototypematuresequencingExpressionprofileStructuraldeterminationProteinlinkagemap(catalog)QuantitativeproteinprofileProteinlinkagemap(dynamic)SubcellularlocationPosttranslationalModificationanalysisActivityprofileSystemsimulationDataintegrationcurrentstatus

ofproteomictechnologies22Basictechnologiesof

Proteomics2-Delectrophoresisofcomplexproteinmixtures：ThecoretechnologyofproteomicsIdentificationandstructureanalysisofproteinswithmassspectrometrymethods（生物質(zhì)譜：ESI-MS,MALDI-TOF-MS）酵母雙雜交Bioinformatics232425生物信息學在蛋白質(zhì)組學中的應(yīng)用26生物信息學在蛋白質(zhì)組學中的應(yīng)用272829

1二維凝膠電泳數(shù)據(jù)分析30

小鼠肝臟蛋白提取物2D凝膠電泳2-DelectrophoresisgelfromProf.Dr.A.G?rg,TechnicalUniversityMunich,Germany31

樣品制備（Samplepreparation）固相預(yù)制膠條的水化（IPGstriprehydration）第一向等電聚焦（IEF）膠條的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS電泳（SDSelectrophresis）凝膠的染色及檢測（Detection/Staining）PDQuest軟件分析（Softwareanalysis）質(zhì)譜鑒定（Proteinidentification）雙向電泳實驗流程

32細胞裂解勻漿預(yù)分級除雜質(zhì)濃縮定量差異分析雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染考染熒光蛋白標記樣品制備分離染色圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞2-DE/MS蛋白質(zhì)組學經(jīng)典工作流程33樣品制備細胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除核酸、脂類34差異分析圖像獲取圖譜分析銀染考染熒光蛋白標記染色圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞Separation雙向電泳第一向第二向細胞裂解勻漿預(yù)分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備2-DE/MS蛋白質(zhì)組學經(jīng)典工作流程3536雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS緩沖液中平衡PrincipleaccordingtoP.H.O’FarrellandJ.Klose(1975)pH10pH10pH3pH3垂直膠管中進行等電聚焦urea,NP-40一向:二向:SDS丙烯酰胺凝膠電泳非連續(xù)梯度膠按等電點分離（電荷）按分子量分離（質(zhì)量）37等電聚焦電泳原理38固相凝膠(支持膜上0.5mm厚凝膠)丙烯酰胺緩沖液:Immobiline?

CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相pH梯度39平衡過程40412-DE/MS蛋白質(zhì)組學經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析蛋白標記圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞分離細胞裂解勻漿預(yù)分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向銀染考染熒光染色42ProteinDetectionMethods43Coomassie?Blue-考馬斯亮藍染色靈敏度，低至0.01mg(“膠體”考染)非特異性染色染料與蛋白成比例結(jié)合線性化好擴散速度受限，膠的厚度影響跑膠速度純度不夠有限的動力學范圍44

膠體考馬斯亮藍染色1mgE.colistrainBIPGphor24cmpH4-7ColloidalCBBG250staining45銀染靈敏度，低至0.2ng在凝膠基質(zhì)中與蛋白交聯(lián)自動催化反應(yīng)染凝膠表面蛋白線性化程度比考染低一些大分子物質(zhì)也被染色步驟多，某些步驟時間控制嚴格46SilverstainedgelofE.coliLysate

IPG4-7SilverstainedwithPlusOne?KitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.47差異分析蛋白標記挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞分離細胞裂解勻漿預(yù)分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染考染熒光染色圖譜分析2-DE/MS蛋白質(zhì)組學經(jīng)典工作流程48凝膠的圖像處理分析掃描，圖像處理斑點檢測和定量數(shù)據(jù)分析2-DE數(shù)據(jù)庫建立ImageScannerIII圖像掃描系統(tǒng)492-DE/MS蛋白質(zhì)組學經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標記蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞分離細胞裂解勻漿預(yù)分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染考染熒光染色挖膠圖譜分析5051自動斑點切取——Spotpicker切點針頭膠盤522-DE的局限性53SWISS一2DPAGE數(shù)據(jù)庫是由日內(nèi)瓦大學附屬醫(yī)院臨床化學中心實驗室與瑞士生物信息協(xié)會合作創(chuàng)辦的人類維凝膠蛋白數(shù)據(jù)庫為在2D凝膠上預(yù)測蛋白質(zhì)遷移提供了許多標化的凝膠圖象和工具比較已知細胞類型或組織的凝膠和SWISS一2DPAGE的圖象即可以幫助識別關(guān)鍵標志物5455SWISS-2DPAGEstatistics

56MasterCreationLastmodifiedDetectedspotsIdentifiedspotsNo.ofEntriesARABIDOPSISDec-00May-0311117957DICTYSLUGSep-97Sep-9731642516ECOLI3.5-10Aug-95Jan-9823642061804-5Jun-99Dec-0044970334.5-5.5Oct-98Dec-00102597655-6Oct-99Mar-041536106815.5-6.7Dec-00Dec-0060516166-9Dec-00Dec-001100226-11Dec-00Dec-0012373431DIGE4.5-6.5May-03Mar-04858174153MOUSEISLETSSep-98May-0325286344BATDec-00Dec-0022428537WATSep-98Oct-01354013676LIVERSep-98Apr-002836200107NUCLEILIVERApr-00May-034000158MUSCLESep-98May-03265013671STAPHYLOCOCCUSMar-04Mar-04596250198YEASTFeb-95Mar-0419401016257HUMANCECJan-98Mar-0430775640CSFAug-93Mar-04166430930DLD1Jan-99Mar-04344010867ELCAug-93Mar-0421443519HEPG2Aug-93Mar-0428629845HEPG2SPAug-93Mar-04173415525HL60Sep-97Mar-0431642617KIDNEYSep-97Mar-0428964428LIVERAug-93Mar-04241313868NUCLEILIVERApr-00Mar-0414972714LYMPHOCYTEMar-04Mar-049267762LYMPHOMAAug-93Mar-0418906033NUCLEOLIHELA2-DPAGENov-01Mar-0412715144NUCLEOLIHELASDSNov-01Mar-0411598189PLASMAAug-93Mar-04196662670PLATELETAug-93Mar-0421934118RBCAug-93Mar-04180019033U937Aug-93Mar-048954232585960人類肝臟61？？？？？？626364652生物質(zhì)譜技術(shù)66

數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測接收器┗━━━━━╋━━━━━━┛

真空系統(tǒng)

質(zhì)譜儀包含了五個主要的系統(tǒng)：1、進樣系統(tǒng)(sampleintroduction)2、離子源系統(tǒng)(ionizationsource)3、質(zhì)量分析儀(massanalyzer)4、離子探測器(detector)5、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(datasystem)

質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)67離子源電離：：

質(zhì)譜進行分析時，首先要做的就是離子化，也就是將待測物處理過后產(chǎn)生氣相的離子，并帶有電荷。離子源:

使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置,并對離子進行加速使其進入分析器，根據(jù)離子化方式的不同,分為硬電離和軟電離。68對離子源的貢獻—軟電離方式目前有兩種做法能使得蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)離子而不會改變其結(jié)構(gòu)與形態(tài)。由JohnB.Fenn所發(fā)展的方法是運用一個很強的電場將樣品噴灑出去(ESI)，而產(chǎn)生一個個帶電荷并能自由飛翔的離子。運用一個強烈的激光脈沖，在適當?shù)臈l件下(視能量，與樣品的結(jié)構(gòu)和化學環(huán)境而定)運作，樣品可接受激光脈沖的能量而被釋放成為自由的離子(MALDI)，由KoichiTanaka最先提出的技術(shù)。69諾貝爾獎的提示70ESI電離機制RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets試樣離子準分子離子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他離子71電噴霧電離產(chǎn)生多電荷離子72多電荷離子的有關(guān)計算對于蛋白質(zhì)，產(chǎn)生的多電荷離子為：[M+nH]n+，系列離子假設(shè)某一質(zhì)譜峰(m/z)1對應(yīng)的離子為[M+nH]n+,另一相鄰質(zhì)譜峰(m/z)2對應(yīng)的離子為[M+(n+1)H](n+1)+,且兩個峰均為同一蛋白質(zhì)產(chǎn)生，則可通過建設(shè)聯(lián)立方程組來得到M和n的具體數(shù)值:解方程組得到M和n。可以編制程序?qū)⑺邢嚓P(guān)的峰進行計算并取平均值，則可得到較精確的分子量信息。這一過程稱作解卷積(Deconvolution)。73肌紅蛋白電噴霧質(zhì)譜圖帶10~30個電荷的系列分子離子74基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)

(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization，MALDI)試樣溶解或懸浮于基質(zhì)中，激光束輻射到基質(zhì)和試樣分子上?；|(zhì)吸收激光束能量后汽化，部分試樣分子伴隨基質(zhì)的汽化而解吸?；|(zhì)吸收大部分激光能量，減少了試樣分子被激光能量破壞及過度電離成碎片離子。75關(guān)于基質(zhì)：極性化合物溶解樣品芳環(huán)吸收激光易結(jié)晶均勻分散樣品分子

MALDI常用基質(zhì)基質(zhì)性狀適用波長應(yīng)用煙酸固體266nm,2.94

m,10.6

m蛋白質(zhì)2,5-二羥基苯甲酸固體266nm,2.94

m,10.6

m蛋白質(zhì)芥子酸固體266nm,337nm,355nm,2.94

m蛋白質(zhì)-氰基-4-羥基肉桂酸固體337nm,355nm蛋白質(zhì)3-羥基吡啶甲酸固體337nm,355nm核酸、配糖體2-(4-羥基苯偶氮)苯甲酸固體266nm,337nm蛋白質(zhì)、配糖體琥珀酸固體2.94

m,10.6

m蛋白質(zhì)、核酸間硝基芐醇液體266nm蛋白質(zhì)甘油液體2.94

m,10.6

m蛋白質(zhì)鄰硝苯基辛基醚液體266nm,337nm,355nm合成高分子76質(zhì)量分析器Massanalysis質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心,它將離子源產(chǎn)生的離子按其質(zhì)荷比(m/z)的不同﹑在空間的位置﹑時間的先后或軌道的穩(wěn)定與否進行分離,以便得到按m/z大小順序排列而成的質(zhì)譜圖。77兩組四極桿分別加上+(u+Vcont)和–(u+Vcont)，其中u直流電壓部分，Vcont為射頻電壓部分=2f,f為頻率。四極桿質(zhì)量分析器(QuadrupoleMassAnalyser)在場的中心和兩條對角線上的任何一點電位為零。通過直流和射頻電壓的改變來控制不同荷質(zhì)比的離子通過；可以允許單一荷質(zhì)比的離子通過；也可以進行荷質(zhì)比掃描78massscanningmodem1m3m4m2m3m1m4m2singlemasstransmissionmodem2m2m2m2m3m1m4m2四級桿模式79飛行時間質(zhì)量分析器(TimeOfFlightMassAnalyser,TOF)離子源中的離子經(jīng)加速電壓獲得的速度為：其中

ze為電荷，V為加速電壓，m為質(zhì)量。飛行管長度L，到達檢測器的時間為：質(zhì)量越大，飛行時間越長，實現(xiàn)分離。m1和m2兩個離子：用已知樣品進行校正，得到未知離子的質(zhì)量。80質(zhì)譜鑒定蛋白的一般方法ArtificialspectrabuiltArtificiallytrypsinatedDatabaseofsequences(i.e.SwissProt)SpotremovedfromgelFragmentedusingtrypsinSpectrumoffragmentsgeneratedMATCHLibrary基于肽質(zhì)量指紋譜（PMF）81現(xiàn)行的PMF軟件工具名稱網(wǎng)址特點第一類PepSeaPeptIdent/MultIdenthttp://www.ch/tools/peptident.html根據(jù)譜圖中m/z值與數(shù)據(jù)庫中給定誤差范圍內(nèi)m/z值相匹配的數(shù)目給出得分第二類MOWSEMS-Fithttp://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgibn/mowse使用的得分算法考慮到蛋白質(zhì)大小和肽片段長度對匹配幾率的影響第三類ProFoundMascothttp://prowlrockefeller.edu/cgi-bin/ProFound使用基于概率的得分，提供得分的統(tǒng)計基礎(chǔ)，估計某些匹配可能反映隨機事件而不是真實特性的概率82以相關(guān)的質(zhì)譜實驗數(shù)據(jù)從序列數(shù)據(jù)庫中進行發(fā)掘的蛋白質(zhì)MSFit83質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入框翻譯后修飾種類的選擇可選的質(zhì)譜儀酶選擇可選的物種可選的序列數(shù)據(jù)庫84MOWSEscore:MOlecularWeightSearch,ScoringbasedonpeptidefrequencydistributionfromtheOWLnonredundantDatabase%cov:totalaacoverage%tic:fragmentscoverage85863蛋白質(zhì)相互作用分析

（protein–proteininteractions，PPIs)

Itisbeyondanydoubtthatproteinsandtheirinteractionsplayanessentialroleinmostcomplexbiologicalprocesses.分析蛋白質(zhì)間的相互作用及方式,認識與特定生理活動相關(guān)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò),繪制蛋白質(zhì)相互作用圖譜Schizophrenia-associatedproteins

87typesofprotein–proteininteractions(PPIs)

Homo-oligomersvs.hetero-oligomersStableinteractionsvs.transientinteractionsCovalentvs.non-covalentObligatevsnon-obligateproteincomplexFuzzyproteincomplexesPPIsinterfacesexhibitbothshapeandelectrostaticcomplementarity883.1研究PPIs的實驗方法yeasttwo-hybridsystemsaffinitypurification/massspectrometry89建立的基礎(chǔ)：真核細胞的轉(zhuǎn)錄因子：

DNA結(jié)合域：DNAbindingdomain,BD

轉(zhuǎn)錄激活域：Activationdomain,AD當兩者獨立存在時,無轉(zhuǎn)錄激活功能,但兩者只要相互接近,即可激活轉(zhuǎn)錄3.1.1酵母雙雜交技術(shù)

yeasttwo-hybridsystem90酵母雙雜交系統(tǒng)的組成與BD融合的蛋白表達載體，表達的蛋白稱誘餌蛋白(bait)與AD融合的蛋白表達載體，表達的蛋白稱靶蛋白(prey或target)帶報告基因(reportgene)的宿主細胞baittargettargetbait9192酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用篩選、鑒定蛋白質(zhì)間的相互作用：驗證預(yù)測的蛋白間相互作用、鑒定突變對蛋白與蛋白結(jié)合的影響、篩選蛋白的級聯(lián)底物。篩選、鑒定小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用：鑒定干擾相互作用的分子、篩選藥物作用位點及藥物對蛋白相互作用影響。93酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用94酵母雙雜交技術(shù)的特點優(yōu)點：不需要抗體胞內(nèi)實驗缺點：篩選工作需要構(gòu)建基因文庫對于不能進入核內(nèi)的蛋白質(zhì)(如分泌蛋白、膜蛋白)和存在比較復(fù)雜的翻譯后修飾作用的高等生物蛋白質(zhì),該技術(shù)尚不適用假陽性結(jié)果比例較高95雙報告基因963.1.2Affinitypurificationcoupledtomassspectrometry97Co-IP:Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYWesternblot鑒定PAGE質(zhì)譜鑒定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，結(jié)合位點分析；篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔983.2PPIspredictionEffortstoexperimentallydeterminetheinteractomeofnumerousspeciesareongoing,andanumberofcomputationalmethodsforinteractionpredictionhavebeendevelopedinrecentyears.

993.2.1Textmining-basedPPIspredictiontext-miningbasedcomputationalmethodologies,aimingtoextractinformationforproteinsandtheirinteractionsfrompublicrepositoriessuchasliteratureandvariousbiologicaldatabases.100Left:SumofGoogle-Scholarcitationsforthetext-miningtools.Right:Google-Scholarcitationtrendsforeachtextminingtoolindividually.101

3.2.2ThemethodofphylogeneticprofilesbasedpredictionThismethodisbasedonthehypothesisthatpotentiallyinteractingproteinsshouldco-evolveandshouldhaveorthologsincloselyrelatedspecies.Asimilarmethodcanbeappliedtoproteindomains,whereprofilesareconstructedfordomainstodetermineiftherearedomaininteractions.

102一個基因組中不同的蛋白質(zhì)編碼基因，在另外一個基因組中，卻融合成了一個基因，這表明基因融合或分裂事件的發(fā)生。從功能的角度看，基因的融合可能導致它們具有相關(guān)的生物學功能，例如它們可能在同一個蛋白質(zhì)復(fù)合物（complex）、通路（pathway）或過程（process）中發(fā)揮功能。這種方法還可以預(yù)測可能存在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用3.2.3ThedomainfusionorRosettaStonemethodforPPIsprediction1033.2.4InferenceofinteractionsfromhomologousstructuresChenXW,LiuM(2005)Predictionofprotein–proteininteractionsusingrandomdecisionforestframework.Bioinformatics21:4394–4400.AloyP.,andR.B.Russell.(2003)"InterPreTS:proteinInteractionPredictionthroughTertiaryStructure".Bioinformatics,19(1),161-162.Fukuhara,Naoshi,andTakeshiKawabata.(2008)"HOMCOS:aservertopredictinteractingproteinpairsandinteractingsitesbyhomologymodelingofcomplexstructures"NucleicAcidsResearch,36(S2):185-.KittichotiratW,MGuerquin,REBumgarner,andRSamudrala(2009)"ProtinfoPPC:awebserverforatomiclevelpredictionofproteincomplexes"NucleicAcidsResearch,37(WebServerissue):519-25.ShoemakerBA,ZhangD,ThanguduRR,TyagiM,FongJH,Marchler-BauerA,BryantSH,MadejT,PanchenkoAR(2010)InferredBiomolecularInteractionServer--awebservertoanalyzeandpredictproteininteractingpartnersandbindingsites.NucleicAcidsRes.2010Jan;38(Databaseissue):D518-24.url:/pubmed/19843613EsmaielbeikiR,NebelJ-C(2014)Scoringdockingconformationsusingpredictedproteininterfaces.BMCBioinformatics,15:171.104Inferenceofinteractionsfromhomologousstructuresemployingasequencebasedmethod(e.g.Interolog)tosearchforproteincomplexstructuresthatarehomologoustothequerysequencesTheseknowncomplexstructuresarethenusedastemplatestostructurallymodeltheinteractionbetweenquerysequencestheadvantage：inferringproteininteractions;suggestsmodelsofinteractstructurallyBut,limitednumberofknownproteincomplexstructures105InterologbasedpredictionAninterologisaconservedinteractionbetweenapairofproteinswhichhaveinteractinghomologsinanotherorganism.

SupposethatAandBaretwodifferentinteractinghumanproteins,andA'andB'aretwodifferentinteractingdogproteins.ThentheinteractionbetweenAandBisaninterologoftheinteractionbetweenA'andB'ifthefollowingconditionsallhold:A

isahomologof

A'BisahomologofB'A

andBinteractA'

andB'interact106InterologbasedpredictionInterPreTS:proteinInteractionPredictionthroughTertiaryStructureDBID:homologuesinadatabaseofinteractingdomains107InterologbasedpredictionHOMCOS(HomologyModel