羥基酪醇等7種食品添加劑新品種相關(guān)材料

1羥基酪醇等7種食品添加劑新品種相關(guān)材料一、擬征求意見(jiàn)的食品添加劑新品種名單（一）食品添加劑新品種1.中文名稱(chēng)：羥基酪醇英文名稱(chēng)：Hydroxytyrosol功能分類(lèi)：抗氧化劑用量及使用范圍序號(hào)名稱(chēng)食品分類(lèi)號(hào)食品名稱(chēng)使用量（g/kg）備注1羥基酪醇抗氧化劑02.01.01植物油脂0.05—質(zhì)量規(guī)格要求本質(zhì)量規(guī)格要求適用于以酪氨酸為原料，經(jīng)谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）培養(yǎng)發(fā)酵液催化轉(zhuǎn)化、分離純化工藝制得的食品添加劑羥基酪醇。2分子式、結(jié)構(gòu)式和相對(duì)分子質(zhì)量2C8H10O32.2結(jié)構(gòu)式2.3相對(duì)分子質(zhì)量154.165g/mol（按2022年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量）3技術(shù)要求感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。項(xiàng)目檢驗(yàn)方法色澤取本品少量液體，于潔凈白色容器內(nèi)，在良好的自然光線(xiàn)下，用肉眼觀(guān)察其色澤、狀態(tài)和檢查有無(wú)異物，嗅其氣狀態(tài)粘稠液體辛辣味，略苦味3.2理化指標(biāo)理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2理化指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)檢驗(yàn)方法羥基酪醇含量，w/%≥99.0水分，w/%≤GB5009.33鉛（Pb）/（mg/kg）<0.05GB5009.12<0.05GB5009.11/（mg/kg）<0.05GB5009.17鎘（Cd）/（mg/kg）<0.05GB5009.153.3微生物指標(biāo)微生物指標(biāo)應(yīng)符合表3的規(guī)定。表3微生物指標(biāo)檢驗(yàn)方法菌落總數(shù)/（CFU/g）<GB4789.2霉菌和酵母/（CFU/g）<GB4789.15大腸菌群/（MPN/g）<0.3GB4789.3金黃色葡萄球菌/25g不得檢出GB4789.10沙門(mén)氏菌/25g不得檢出GB4789.44附錄A羥基酪醇含量檢驗(yàn)方法試驗(yàn)方法規(guī)定的一些試驗(yàn)過(guò)程可能導(dǎo)致危險(xiǎn)情況。操作者應(yīng)采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?。A.2一般規(guī)定除非另有說(shuō)明，在分析中僅適用分析純?cè)噭┖虶B/T6682中規(guī)定的三級(jí)水或相應(yīng)純度的水。試驗(yàn)中所需標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑及制品，在沒(méi)有其他規(guī)定下，均按GB/T601、GB/T602、GB/T603的規(guī)定進(jìn)行制備。A.3羥基酪醇含量測(cè)定方法A.3.1.1電子天平：感量為0.01mg。A.3.1.2高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器。A.3.2試劑A.3.2.1甲醇（色譜純）。A.3.2.2三蒸水（含1‰甲酸）。A.3.2.3標(biāo)準(zhǔn)品：羥基酪醇（純度≥98.0%）。A.3.3液相色譜參考條件A.3.3.1色譜柱：Shim-packGISC18,5μm,4.6×250mm或等效色譜柱。A.3.3.2柱溫：30℃。5A.3.3.3流速：1mL/min。A.3.3.4波長(zhǎng)：280nm。A.3.3.5進(jìn)樣量：10μL。A.3.3.6流動(dòng)相：流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：三蒸水。采用梯度洗脫，見(jiàn)表A.1。表A.1梯度洗脫程序時(shí)間（min）A%B%02592525A.3.4操作方法A.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品100mg（精確至0.01mg），置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的參考高效液相色譜圖見(jiàn)附錄B.1。確至0.01mg），置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，采用0.22μm水相微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)行檢測(cè)。A.3.4.3測(cè)定方法：分別精密吸取羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液各10μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析。按外標(biāo)法6計(jì)算樣品中羥基酪醇含量。A.3.5結(jié)果計(jì)算羥基酪醇含量X按公式（A.1）計(jì)算：X=×100%(A.1)S1——樣品溶液色譜圖中羥基酪醇的峰面積；2——標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖中羥基酪醇的峰面積；m1——樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；m2——標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；P——標(biāo)準(zhǔn)品純度，%。7附錄B羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的參考高效液相色譜圖B.1羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的參考高效液相色譜圖82.中文名稱(chēng)：二氯甲烷英文名稱(chēng)：Methylenechloride功能分類(lèi)：食品工業(yè)用加工助劑用量及使用范圍1methylenechloride質(zhì)量規(guī)格要求本質(zhì)量規(guī)格要求適用于以甲醇和鹽酸為原料，在氯化鋅的催化下生成一氯甲烷，一氯甲烷與氯氣反應(yīng)生成不同的甲烷氯化物，再經(jīng)精餾制得的食品添加劑二氯甲烷。2化學(xué)名稱(chēng)、分子式、結(jié)構(gòu)式和相對(duì)分子質(zhì)量二氯甲烷2.2分子式CH2Cl22.3結(jié)構(gòu)式2.4相對(duì)分子質(zhì)量984.932（按2020年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量）3技術(shù)要求感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。項(xiàng)目檢驗(yàn)方法色澤取適量樣品置于清潔、干燥的具塞錐形觀(guān)察其色澤和狀態(tài)。狀態(tài)3.2理化指標(biāo)理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2理化指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)檢測(cè)方法99.2折光率(n200)GB/T614水分，w/%≤0.02GB5009.3蒸發(fā)殘?jiān)瑆/%≤0.015GB/T9740游離氯（Cl），w/%≤0.0002酸度（以HCl計(jì)mmoL/g≤0.0005GB/T9736堿度（以NaOH計(jì)mmoL/g≤0.0025GB/T97361GB5009.12附錄A檢驗(yàn)方法本質(zhì)量規(guī)格要求所用的試劑和水，在未注明其他要求時(shí)，均指分析純?cè)噭┖头螱B/T6682規(guī)定的一級(jí)水。試驗(yàn)中所用標(biāo)準(zhǔn)溶液、雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑和制品，在未注明其他要求時(shí)，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的規(guī)定制備。試驗(yàn)中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時(shí)，均指水溶液。A.2鑒別試驗(yàn)A.2.1鑒別原理二氯甲烷略溶于水，與乙醇和乙醚混溶。A.2.2溶解性試驗(yàn)A.2.2.1有機(jī)溶劑溶解性：取5mL樣品于100mL具塞比色管中，分別任取1～10倍體積比的乙醇、乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑與樣品混合，振搖1min，靜置10min，觀(guān)察是否分層。試樣應(yīng)與乙醇、乙醚、丙酮混溶。加入100倍以上體積比的水與樣品混合，振搖1min，靜置10min，觀(guān)察是否分層。試樣溶于約120倍體積的水。（二）食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑新品種1.中文名稱(chēng)：2’-巖藻糖基乳糖英文名稱(chēng)：2’-fucosyllactose，2’-FL功能分類(lèi)：食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑2’-巖藻糖基乳糖的用量、使用范圍及質(zhì)量規(guī)格要求按照國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)2023年第8號(hào)公告執(zhí)行（附錄C用于生產(chǎn)2’-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)菌信息除外），該營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑新品種的生產(chǎn)菌信息見(jiàn)下表。表1用于生產(chǎn)2’-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)菌信息營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑供體2’-巖藻糖基乳糖2’-fucosyllactose大腸桿菌BL21star（DE3）EscherichiacoliBL21star(DE3)大腸桿菌O126(EscherichiacoliO126)aa為α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶供體2.中文名稱(chēng)：3’-唾液酸乳糖鈉鹽英文名稱(chēng)：3’-Sialyllactosesodiumsalt，3’-SL功能分類(lèi)：食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑用量及使用范圍食品分類(lèi)號(hào)食品名稱(chēng)使用量備注嬰兒配方食品0.11~0.24g/L（以3’-唾液酸基乳糖、乳糖食品分類(lèi)號(hào)食品名稱(chēng)使用量備注較大嬰兒和幼兒配方食品乳糖計(jì)，以即食狀態(tài)計(jì)，粉狀產(chǎn)品按沖調(diào)倍數(shù)增加使用量）-N-新四糖、6’-唾液酸乳糖鈉鹽、低聚半乳該類(lèi)物質(zhì)總量不超過(guò)64.5g/kg。特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品質(zhì)量規(guī)格要求唾液酸乳糖鈉鹽的生產(chǎn)菌應(yīng)經(jīng)過(guò)安全性評(píng)估并符合附錄C2化學(xué)名稱(chēng)、分子式、結(jié)構(gòu)式和相對(duì)分子質(zhì)量O-(N-乙?；?α-神經(jīng)氨酸基)-(2→3)-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡萄糖單鈉鹽2.2分子式C23H38NNaO192.3結(jié)構(gòu)式2.4相對(duì)分子質(zhì)量655.53（按2022年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量）3技術(shù)要求感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。項(xiàng)目檢驗(yàn)方法色澤白色至類(lèi)白色取適量試樣置于清潔、干燥的白瓷盤(pán)或燒杯中，在自然光線(xiàn)下，觀(guān)察其色澤和狀態(tài)。狀態(tài)粉末3.2理化指標(biāo)理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2理化指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)檢驗(yàn)方法3’-唾液酸乳糖鈉鹽（以干基計(jì)），w/%≥N-乙酰D-神經(jīng)氨酸，w/%≤3’-唾液酸乳果糖和6’-唾液酸乳糖鈉鹽，w/%≤D-乳糖，w/%≤0.5項(xiàng)目指標(biāo)檢驗(yàn)方法水分，w/%≤GB5009.3卡鈉/（mg/100g）≤GB5009.91殘留蛋白含量/（mg/kg）≤內(nèi)毒素/（EU/mg）≤0.1GB5009.11鉛（Pb）/（mg/kg）≤0.05GB5009.123.3微生物指標(biāo)微生物指標(biāo)應(yīng)符合表3的規(guī)定。表3微生物指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)檢驗(yàn)方法菌落總數(shù)/（CFU/g）≤500GB4789.2腸桿菌科/（CFU/g）<GB4789.41沙門(mén)氏菌/25g不得檢出GB4789.4附錄A檢驗(yàn)方法A.1一般規(guī)定本質(zhì)量規(guī)格要求所用的試劑和水，在未注明其他要求時(shí)，均指分析純?cè)噭┖头螱B/T6682規(guī)定的一級(jí)水。試驗(yàn)中所用標(biāo)準(zhǔn)溶液、雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑和制品，在未注明其他要求時(shí)，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的規(guī)定制備。試驗(yàn)中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時(shí)，均指水溶液。A.23’-唾液酸乳糖鈉鹽（以干基計(jì)）、N-乙酰D-神經(jīng)氨酸、3’-唾液酸乳果糖和6’-唾液酸乳糖鈉鹽的測(cè)定A.2.1方法提要試樣用水溶解和稀釋后，在親水性相互作用色譜柱的液相色譜條件下分離，電霧式檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。A.2.2試劑和材料A.2.2.13’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品：純度＞98.5%。A.2.2.26’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品：純度＞98.5%。A.2.2.3N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品：純度＞98.0%。A.2.2.4乙腈：色譜純。A.2.2.5甲酸銨：色譜純。A.2.2.6稀釋溶劑：乙腈：25mmol/L甲酸銨水溶液=60:40A.2.3儀器和設(shè)備高效液相色譜儀：配備電霧式檢測(cè)器（CAD）或其他等效檢測(cè)器。A.2.4參考色譜條件A.2.4.1色譜柱：親水性相互作用色譜柱4.6mmol/L×150mmol/L，5μm或等效柱。A.2.4.2色譜保護(hù)柱：親水性相互作用色譜柱4.6mmol/L×10mmol/L，5μm或等效柱。A.2.4.3流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為25mmol/L甲酸銨水溶液。無(wú)需調(diào)整溶液的pH值。梯度洗脫條件見(jiàn)表A.1。表A.1梯度洗脫條件A%B%02428A.2.4.4柱溫：60℃。A.2.4.5檢測(cè)器：霧化器溫度：35℃;數(shù)據(jù)采集速率：10Hz；功率功能：1；過(guò)濾器：5。A.2.4.6流速：1mL/min。A.2.4.7進(jìn)樣量：10μL。A.2.4.8運(yùn)行時(shí)間：50min。A.2.5分析步驟A.2.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制A.2.5.1.13’-唾液酸乳糖鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的3’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品，轉(zhuǎn)移到合適的容量瓶中，用水溶解對(duì)照品。根據(jù)對(duì)照品的純度折算，配制成3’-唾液酸乳糖鈉鹽濃度約為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)原液。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中，用稀釋溶劑，配制成5個(gè)不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別約為20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL和60μg/mL。A.2.5.1.2N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品，轉(zhuǎn)移到合適的容量瓶中，用水溶解，配制成的N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)原液，根據(jù)對(duì)照品的純度折算，其濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取適量N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)原液，加入稀釋溶劑后配制成濃度為66μg/mL的N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.2.5.2試樣溶液配制精確稱(chēng)取550mg（精確到1mg）試樣，加入到50mL的容量瓶中，加水至約容量瓶刻度線(xiàn)2cm以下，振蕩溶解，然后加水定容至刻度；再取5mL定容后的溶液，移液后加入稀釋溶劑，定容至50mL；取2.5mL定容后的溶液，移液后加入稀釋溶劑，定容至50mL。A.2.5.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)A.2.5.3.1系統(tǒng)適用性測(cè)試溶液的制備系統(tǒng)適用性試驗(yàn)原液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量3’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品、6’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品和N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品，置于合適的容量瓶中，用水溶解。配制系統(tǒng)適用性測(cè)試原液，使每種對(duì)照物質(zhì)的濃度約為1.0mg/mL。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1：取適量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液原液，加入稀釋溶劑后配制成各標(biāo)準(zhǔn)品濃度約為50μg/mL的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2：取適量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液原液，加入稀釋溶劑后配制成各標(biāo)準(zhǔn)品濃度約為2μg/mL的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液3：取適量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1，加入稀釋溶劑后配制成各標(biāo)準(zhǔn)品濃度約為5μg/mL的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液3。A.2.5.3.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)當(dāng)滿(mǎn)足以下條件時(shí)，可進(jìn)行試樣溶液的測(cè)定：——在測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液1-3時(shí)，每個(gè)樣品中3’-唾液酸乳糖鈉鹽的峰面積與濃度的相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.995；——在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1的色譜圖中，3’-唾液酸乳糖鈉鹽、6’-唾液酸乳糖鈉鹽與N-乙酰D-神經(jīng)氨酸的分離度——系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1重復(fù)測(cè)量6次，3’-唾液酸乳糖鈉鹽峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤2.0%；——系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2色譜圖中3’-唾液酸乳糖鈉鹽的信噪比≥150；——系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液3中3’-唾液酸乳糖鈉鹽和N-乙酰D-神經(jīng)氨酸的峰面積為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1峰面積的在此色譜條件下3’-唾液酸乳糖鈉鹽、6’-唾液酸乳糖鈉鹽和N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品的參考色譜圖譜見(jiàn)附錄B.1。A.2.6結(jié)果計(jì)算A.2.6.13’-唾液酸乳糖鈉鹽含量的測(cè)定以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中3’-唾液酸乳糖鈉鹽的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，建立校準(zhǔn)曲線(xiàn)，并根據(jù)試樣溶液的峰面積確定測(cè)試樣品中3’-唾液酸乳糖鈉鹽的濃度。3’-唾液酸乳糖鈉鹽含量（以干基計(jì)）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X1按……C1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到試樣溶液中3’-唾液酸乳糖鈉鹽的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）；V1——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；m1——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；ω1——試樣的水分，單位為%；((100-ω1)/100)——水分校正；f——稀釋因子。A.2.6.2N-乙酰D-神經(jīng)氨酸含量的測(cè)定A1——試樣溶液中N-乙酰D-神經(jīng)氨酸的峰面積；A2——標(biāo)準(zhǔn)溶液中N-乙酰D-神經(jīng)氨酸的峰面積；m2——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；m3——標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；ω2——標(biāo)準(zhǔn)品的水分，單位為%；((100-ω2)/100)——水分校正；P1——N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品純度，單位為%；(P1/100)——純度校正；V2——試樣的定容體積，單位為mL；V3——標(biāo)準(zhǔn)品的定容體積，單位為mL；f——稀釋因子。A.2.6.33’-唾液酸乳果糖和6’-唾液酸乳糖鈉鹽含量的測(cè)定3’-唾液酸乳果糖和6’-唾液酸乳糖鈉鹽含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X3按（式A.3）計(jì)算。A3——試樣溶液中3’-唾液酸乳果糖的峰面積；A4——試樣溶液中6’-唾液酸乳糖鈉鹽的峰面積；A5——標(biāo)準(zhǔn)溶液中3’-唾液酸乳糖鈉鹽的峰面積；m4——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；m5——標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；ω3——標(biāo)準(zhǔn)品的水分，單位為%；((100-ω3)/100)——水分校正；P2——3’-唾液酸乳糖鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品純度，單位為%；(P2/100)——純度校正；V4——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；V5——標(biāo)準(zhǔn)品的定容體積，單位為（mL）；f——稀釋因子。A.3D-乳糖的測(cè)定A.3.1方法提要試樣用水溶解后，在陰離子交換色譜柱的液相色譜條件下分離，電化學(xué)脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。A.3.2試劑和材料A.3.2.13’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品：純度＞98.5%。A.3.2.2D-乳糖一水合物對(duì)照品：無(wú)水D-乳糖含量≥95%或標(biāo)明含量的等同物。A.3.2.350%氫氧化鈉溶液：濃度47.0%~53.0%；A.3.2.4醋酸鈉：純度＞99.0%。A.3.3儀器和設(shè)備液相色譜儀：配備電化學(xué)脈沖安培檢測(cè)器（PAD）。A.3.4參考色譜條件A.3.4.1色譜柱：陰離子交換色譜柱4.0mmol/L×250mmol/L，10μm或等效柱。A.3.4.2色譜保護(hù)柱：陰離子交換色譜柱4.0mmol/L×50mmol/L，10μm或等效柱。A.3.4.3流動(dòng)相：A相為水；B相為0.5M氫氧化鈉溶液；C相為0.28M醋酸鈉溶液+0.03M氫氧化鈉溶液。梯度洗脫條件見(jiàn)表A.2。表A.2梯度洗脫條件A%B%C%0.0280280282220.0282238.0050.0050.028055.0280A.3.4.4柱溫：30℃。A.3.4.5流速：1.2mL/min。A.3.4.6檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器A.3.4.6.1參比電極：銀/氯化銀電極。A.3.4.6.2工作電極：金電極。A.3.4.7進(jìn)樣體積：10μL。A.3.4.8運(yùn)行時(shí)間：55min。A.3.5分析步驟A.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的乳糖一水合物對(duì)照品，置于同一個(gè)合適的容量瓶中，用水溶解，配制成濃度約為10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)A.3.5.2試樣溶液制備精確稱(chēng)取100mg試樣，加入到100mL的容量瓶中，加水至約容量瓶刻度線(xiàn)2cm以下，振蕩溶解，然后加水定容至A.3.5.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)A.3.5.3.1系統(tǒng)適用性測(cè)試溶液制備系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1：準(zhǔn)確稱(chēng)取乳糖一水合物對(duì)照品，置于一個(gè)合適的容量瓶中，用水溶解，制備得到系統(tǒng)適用性溶液1，使標(biāo)準(zhǔn)品參考濃度約為25μg/mL。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2：取適量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1，加入稀釋溶劑后配制成標(biāo)準(zhǔn)品濃度約為1.25μg/mL的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2。A.3.5.3.2系統(tǒng)適用性測(cè)試系統(tǒng)適用性應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足以下條件：——在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2中得到的D-乳糖的峰面積為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1峰面積的3.5%~6.5%?！到y(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1中D-乳糖的色譜圖分辨率應(yīng)——當(dāng)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1重復(fù)測(cè)量6次，D-乳糖峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤2.0%。依據(jù)前述分析條件測(cè)定，D-乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的參考色譜圖譜見(jiàn)A.3.6D-乳糖結(jié)果計(jì)算根據(jù)下式（A.4），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中D-乳糖的峰面積計(jì)算并確定了D-乳糖含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X4。A6——試樣溶液中D-乳糖的峰面積；A7——標(biāo)準(zhǔn)溶液中D-乳糖的峰面積；m6——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；m7——標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；ω4——標(biāo)準(zhǔn)品的水分，單位為%；((100-ω4)/100)——水分校正；V6——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；V7——標(biāo)準(zhǔn)品的定容體積，單位為毫升（mL）；342.30——D-乳糖的分子量（無(wú)水）；360.31——乳糖一水化合物的分子量；f——稀釋因子。A.4殘留蛋白含量的測(cè)定A.4.1方法提要考馬斯亮藍(lán)染色試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)，在595nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度用于蛋白質(zhì)測(cè)定。為了防止樣品基質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)的干擾，樣品溶液與不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液混合后顯色，繪制二次標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量。A.4.2試劑和材料A.4.2.1牛血清白蛋白對(duì)照品：純度≥99%或標(biāo)明含量的等同A.4.2.2考馬斯亮藍(lán)試劑：市售，適用于0.1mg/mL~1.4mg/mL蛋白含量的測(cè)定。A.4.3儀器和設(shè)備A.4.3.1紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。A.4.3.2分析天平：感量0.0001g。A.4.4分析步驟A.4.4.1牛血清白蛋白儲(chǔ)備溶液的制備稱(chēng)取20.0mg牛血清白蛋白對(duì)照品10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.4.4.2牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取100μL上述儲(chǔ)備溶液10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.4.4.3試樣溶液的制備稱(chēng)取200mg樣品于5mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.4.4.4測(cè)定按表A.3直接在比色皿中依次加入試樣溶液、水、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和考馬斯亮藍(lán)試劑，混勻，室溫下靜置10min。然后以水作為參比，在595nm波長(zhǎng)下依次測(cè)定混合溶液的吸光值。表A.3測(cè)試試樣溶液制備蛋白濃度（mg/L）水(μL）牛血清標(biāo)準(zhǔn)溶液(μL）考馬斯試劑(μL）空白溶液1000200空白溶液2000200混合溶液006002000200混合溶液11600200混合溶液22600200混合溶液346000200200A.4.4.5結(jié)果計(jì)算以混合溶液的吸光值減去空白吸光值的平均值得到校準(zhǔn)吸光值。以校準(zhǔn)吸光值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制通過(guò)橫坐標(biāo)左半軸交點(diǎn)的二次標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與橫坐標(biāo)左半軸交點(diǎn)對(duì)應(yīng)濃度值的絕對(duì)值即為試樣中蛋白的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的示意圖見(jiàn)圖A.1。圖A.1蛋白含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖試樣中蛋白含量X5按式（A.5）計(jì)算，單位為mg/kg。=××C2——標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與橫坐標(biāo)左半軸交點(diǎn)對(duì)應(yīng)濃度值，數(shù)值為負(fù)值，單位為毫克每升（mg/L）；2——通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的測(cè)定混合溶液中蛋白的濃度，單位為毫克每升（mg/L）；V8——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；f——稀釋因子；m8——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；0.6——1mL混合溶液中試樣溶液的體積為0.6mL；1000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。該方法的定量限為17mg/kg。若結(jié)果低于定量限，則結(jié)果表示為＜17mg/kg。結(jié)果保留整數(shù)位。在重復(fù)性測(cè)定條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)其算術(shù)平均值20%。A.5內(nèi)毒素的測(cè)定（凝膠法）A.5.1一般規(guī)定本測(cè)定所用的水應(yīng)符合滅菌注射用水標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)所用器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性?xún)?nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、至少30min）去除，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器具。試驗(yàn)中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時(shí)，均指水溶液。A.5.2方法提要利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷試樣中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。鱟試劑是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可以與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)，通過(guò)凝膠法進(jìn)行限度檢測(cè)或半定量檢測(cè)內(nèi)毒A.5.3試劑和材料A.5.3.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品。A.5.3.2鱟試劑：帶有靈敏度標(biāo)示值λ。A.5.3.3細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：內(nèi)毒素含量<0.015EU/mL。A.5.4儀器和設(shè)備A.5.4.1旋渦混合器。A.5.4.2恒溫水浴箱。A.5.5分析步驟A.5.5.1試樣溶液配制樣品加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解。必要時(shí)，可調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，一般試樣溶液和鱟試劑混合堿溶液或緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。所用溶劑、酸堿溶液及緩沖液應(yīng)不含內(nèi)毒素和干擾因子。A.5.5.2鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/mL表示。當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(λ),將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15min或參照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30s或參照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作。取不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別與等體積的鱟試劑溶液混合，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外取2管加入等體積的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的恒溫水浴緩緩倒轉(zhuǎn)180°,若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)，造成假陰性結(jié)果。當(dāng)最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc）按式（A.6）計(jì)算，單位為EU/mL。X——為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)，反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度；n——為每個(gè)濃度的平行管數(shù)。當(dāng)λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。A.5.5.3干擾試驗(yàn)按表A.4制備溶液A、B、C和D，使用的試樣溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是指在試驗(yàn)中試樣溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)，MVD按式（A.7）計(jì)算：c——為試樣溶液的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL如需計(jì)算在MVD時(shí)的試樣濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=λ/L；L——試樣的細(xì)胞內(nèi)毒素限量，單位為內(nèi)毒素單位每毫克（EU/mg）；λ——鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，單位為內(nèi)毒素單位每毫升（EU/mL）。表A.4干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的平行管數(shù)A無(wú)/試樣溶液———2B2λ/試樣溶液試樣溶12λ4液248λ0.5λ0.25λ444C2λ/內(nèi)毒素檢查用水檢查用水12482λλ0.5λ0.25λ2222D無(wú)/內(nèi)毒素檢查用水———2注：A為試樣溶液；B為干擾試驗(yàn)溶液；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度對(duì)照系列；D為陰性對(duì)照。只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，試驗(yàn)有效。當(dāng)系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，認(rèn)為試樣在該濃度下無(wú)干擾作用。其他情況則認(rèn)為試樣在該濃度下存在干擾作用。若試樣溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將試樣溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD的進(jìn)一步稀釋?zhuān)俅沃貜?fù)干擾試驗(yàn)?？赏ㄟ^(guò)對(duì)試樣進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過(guò)其他適宜的方法（如過(guò)濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過(guò)處理的試樣溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)行樣品的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。A.5.5.4測(cè)定A.5.5.4.1凝膠限度試驗(yàn)按表A.5制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過(guò)MVD并且已經(jīng)排除干擾的試樣溶液來(lái)制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表A.5凝膠限度試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無(wú)/試樣溶液2B2λ/試樣溶液2C2λ/內(nèi)毒素檢查用水2D無(wú)/內(nèi)毒素檢查用水2注：A為試樣溶液；B為試樣陽(yáng)性對(duì)照；C為陽(yáng)性對(duì)照；D為陰性對(duì)照。保溫60min±2min后觀(guān)察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，試樣陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照溶液C的平行管均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定試樣符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽(yáng)性，判定試樣不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定試樣符合規(guī)定，否則判定試樣不符合規(guī)定。若試樣的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A結(jié)果出現(xiàn)不符合規(guī)定時(shí)，可將試樣稀釋至MVD重新實(shí)驗(yàn)，再對(duì)結(jié)果進(jìn)行判A.5.5.4.2凝膠半定量試驗(yàn)通過(guò)確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來(lái)量化試樣中內(nèi)毒素的含量。按表A.6制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表A.6凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的平行管數(shù)A無(wú)/試樣溶液檢查用水1248 2222B2λ/試樣溶液—12λ2C2λ/內(nèi)毒素檢查用水檢查用水12482λλ0.5λ0.25λ2222D無(wú)/內(nèi)毒素檢查用水———2注：A為不超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾試驗(yàn)的試樣溶液。從通過(guò)干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開(kāi)始用內(nèi)毒素檢查用水稀釋如1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MVD；B為含2λ溶度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的溶液A（試樣陽(yáng)性對(duì)照）；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度對(duì)照系列；D為陰性對(duì)照。若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，試樣陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何A.5.5.5結(jié)果判定系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ,為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度。如果檢驗(yàn)的是經(jīng)稀釋的試樣，則將終點(diǎn)濃度乘以試樣進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列內(nèi)毒素濃度c。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定試樣符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為試樣溶液的內(nèi)毒素濃度[按公式CE=antilg(Σlgc/2)]。若試驗(yàn)中試樣溶液的所有平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗(yàn)的是稀釋過(guò)的試樣，則記為小于λ乘以試樣進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)）。若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值時(shí)，則判定試樣不符合規(guī)定。當(dāng)試樣溶液的所有平行管均為陽(yáng)性，可記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘附錄B3’-唾液酸乳糖鈉鹽、3’-唾液酸乳果糖、6’-唾液酸乳糖鈉鹽、N-乙酰D-神經(jīng)氨酸和D-乳糖對(duì)照品參考高效液相色譜圖譜B.1液相色譜-電霧式檢測(cè)器色譜條件下3’-唾液酸乳糖鈉鹽、3’-唾液酸乳果糖、6’-唾液酸乳糖鈉鹽和N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品的色譜圖20.378：3’-唾乳果20.378：3’-唾鈉鹽和N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品的色譜圖表B.1液相色譜-電霧式檢測(cè)器色譜條件下各物質(zhì)保留時(shí)間化合物保留時(shí)間（min）N-乙酰D-神經(jīng)氨酸3’-唾液酸乳果糖*20.43’-唾液酸乳糖鈉鹽21.36’-唾液酸乳糖鈉鹽22.5*注：3’-唾液酸乳果糖為本質(zhì)量規(guī)格中需要控制的雜糖，其純對(duì)照品難以獲取，檢測(cè)時(shí)利用HPLC-CAD濃度相同、峰面積相同的原理，使用3’-唾液酸乳糖鈉鹽的峰面積計(jì)算濃度，圖B.1及表B.1分別提供該物質(zhì)的譜圖及保留時(shí)間。B.2液相色譜-脈沖安培檢測(cè)器色譜條件下D-乳糖對(duì)照品色譜圖4.400D-葡萄糖8.084D-D-乳糖24.61724.6173’-唾液酸乳糖鈉鹽24.617-3’-唾液酸乳糖鈉鹽24.617-圖B.2D-乳糖對(duì)照品的色譜圖表B.2液相色譜-脈沖安培檢測(cè)器色譜條件下各物質(zhì)的保留化合物保留時(shí)間（min）D-葡萄糖4.4D-乳糖3’-唾液酸乳糖鈉鹽24.6附錄C用于生產(chǎn)3’-唾液酸乳糖鈉鹽的生產(chǎn)菌信息C.1用于生產(chǎn)3’-唾液酸乳糖鈉鹽的生產(chǎn)菌信息用于生產(chǎn)3’-唾液酸乳糖鈉鹽的生產(chǎn)菌信息見(jiàn)表C.1。表C.1用于生產(chǎn)3’-唾液酸乳糖鈉鹽的生產(chǎn)菌信息營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑供體鈉鹽3’-SialyllactosesodiumsaltNEO3EscherichiacoliWNEO3cerevisiae)a；集胞藻(Synechocystissp.)b；莢膜紅細(xì)菌(Rhodobactercapsulatus)c；(Pasteurellamultocida)d；lactamica)ea為葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶供體b為N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶供體c為N-乙?；窠?jīng)氨酸合成酶供體d為胞苷5’-單磷酸酯-N-乙?；窠?jīng)氨酸合成酶供體e為α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶供體3.中文名稱(chēng)：6’-唾液酸乳糖鈉鹽英文名稱(chēng)：6’-Sialyllactosesodiumsalt，6’-SL功能分類(lèi)：食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑用量及使用范圍食品分類(lèi)號(hào)食品名稱(chēng)使用量備注嬰兒配方食品0.14~0.40g/L（以6’-唾液酸乳糖計(jì)，以即食狀態(tài)計(jì)，粉狀產(chǎn)品按沖調(diào)倍數(shù)增加使用量）基乳糖、乳糖-N-新四糖、3’-唾液酸乳糖鈉鹽、低聚半乳該類(lèi)物質(zhì)總量不超過(guò)64.5g/kg。較大嬰兒和幼兒配方食品特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品質(zhì)量規(guī)格要求本質(zhì)量規(guī)格要求適用于以乳糖、葡萄糖為原料，經(jīng)發(fā)酵、唾液酸乳糖鈉鹽的生產(chǎn)菌應(yīng)經(jīng)過(guò)安全性評(píng)估并符合附錄C的2化學(xué)名稱(chēng)、分子式、結(jié)構(gòu)式和相對(duì)分子質(zhì)量O-(N-乙?；?α-神經(jīng)氨酸基)-(2→6)-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡萄糖單鈉鹽2.2分子式C23H38NNaO192.3結(jié)構(gòu)式2.4相對(duì)分子質(zhì)量655.53（按2022年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量）3技術(shù)要求感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。項(xiàng)目檢驗(yàn)方法色澤白色至類(lèi)白色取適量試樣置于清潔、干燥的白瓷盤(pán)或燒杯中，在自然光線(xiàn)下，觀(guān)察其色澤和狀態(tài)。狀態(tài)粉末3.2理化指標(biāo)理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2理化指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)檢驗(yàn)方法項(xiàng)目指標(biāo)檢驗(yàn)方法6’-唾液酸乳糖鈉鹽（以干基計(jì)），w/%≥90.0N-乙酰D-神經(jīng)氨酸，w/%≤2.06’-唾液酸乳果糖和3’-唾液酸乳糖鈉鹽，w/%≤D-乳糖，w/%≤0.5水分，w/%≤GB5009.3卡鈉/（mg/100g）≤GB5009.91殘留蛋白含量/（mg/kg）≤內(nèi)毒素/（EU/mg）≤0.1GB5009.11鉛（Pb）/（mg/kg）≤0.05GB5009.123.3微生物指標(biāo)微生物指標(biāo)應(yīng)符合表3的規(guī)定。表3微生物指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)檢驗(yàn)方法菌落總數(shù)/（CFU/g）≤500GB4789.2腸桿菌科/（CFU/g）<GB4789.41沙門(mén)氏菌/25g不得檢出GB4789.4附錄A檢驗(yàn)方法A.1一般規(guī)定本質(zhì)量規(guī)格要求所用的試劑和水，在未注明其他要求時(shí)，均指分析純?cè)噭┖头螱B/T6682規(guī)定的一級(jí)水。試驗(yàn)中所用標(biāo)準(zhǔn)溶液、雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑和制品，在未注明其他要求時(shí)，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的規(guī)定制備。試驗(yàn)中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時(shí)，均指水溶液。A.26’-唾液酸乳糖鈉鹽（以干基計(jì)）、N-乙酰D-神經(jīng)氨酸、6’-唾液酸乳果糖和3’-唾液酸乳糖鈉鹽的測(cè)定A.2.1方法提要試樣用水溶解和稀釋后，在親水性相互作用色譜柱的液相色譜條件下分離，電霧式檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。A.2.2試劑和材料A.2.2.16’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品：純度＞98.5%。A.2.2.23’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品：純度＞98.5%。A.2.2.3N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品：純度＞98.0%。A.2.2.4乙腈：色譜純。A.2.2.5甲酸銨：色譜純。A.2.2.6稀釋溶劑：乙腈：25mmol/L甲酸銨水溶液=60:40A.2.3儀器和設(shè)備高效液相色譜儀：配備電霧式檢測(cè)器（CAD）或其他等效檢測(cè)器。A.2.4參考色譜條件A.2.4.1色譜柱：親水性相互作用色譜柱4.6mmol/L×150mmol/L，5μm或等效柱。A.2.4.2色譜保護(hù)柱：親水性相互作用色譜柱4.6mmol/L×10mmol/L，5μm或等效柱。A.2.4.3流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為25mmol/L甲酸銨水溶液。無(wú)需調(diào)整溶液的pH值。梯度洗脫條件見(jiàn)表A.1。表A.1色譜梯度洗脫條件A%B%02428A.2.4.4柱溫：60℃。A.2.4.5檢測(cè)器：霧化器溫度：35℃;數(shù)據(jù)采集速率：10Hz；功率功能：1；過(guò)濾器：5。A.2.4.6流速：1mL/min。A.2.4.7進(jìn)樣量：10μL。A.2.4.8運(yùn)行時(shí)間：50min。A.2.5分析步驟A.2.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制A.2.5.1.16’-唾液酸乳糖鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的6’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品，轉(zhuǎn)移到合適的容量瓶中，用水溶解對(duì)照品。根據(jù)對(duì)照品的純度折算，配制成6’-唾液酸乳糖鈉鹽濃度約為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)原液。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中，用稀釋溶劑，配制成5個(gè)不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別約為20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL和60μg/mL。A.2.5.1.2N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品，轉(zhuǎn)移到合適的容量瓶中，用水溶解，配制成的N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)原液，根據(jù)對(duì)照品的純度折算，其濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取適量N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)原液，加入稀釋溶劑配制成濃度為66μg/mL的N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.2.5.2試樣溶液配制精確稱(chēng)取550mg（精確到1mg）試樣，加入到50mL的容量瓶中，加水至約容量瓶刻度線(xiàn)2cm以下，振蕩溶解，然后加水定容至刻度；再取5mL定容后的溶液，移液后加入稀釋溶劑，定容至50mL；取2.5mL定容后的溶液，移液后加入稀釋溶劑，定容至50mL。A.2.5.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)A.2.5.3.1系統(tǒng)適用性測(cè)試溶液的制備系統(tǒng)適用性試驗(yàn)原液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量6’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品、3’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品和N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品，置于合適的容量瓶中，用水溶解。配制系統(tǒng)適用性測(cè)試原液，使每種對(duì)照物質(zhì)的濃度約為1.0mg/mL。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1：取適量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液原液，加入稀釋溶劑后配制成各標(biāo)準(zhǔn)品濃度約為50μg/mL的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2：取適量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液原液，加入稀釋溶劑后配制成各標(biāo)準(zhǔn)品濃度約為2μg/mL的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液3：取適量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1，加入稀釋溶劑后配制成各標(biāo)準(zhǔn)品濃度約為5μg/mL的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液3。A.2.5.3.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)當(dāng)滿(mǎn)足以下條件時(shí)，可進(jìn)行試樣溶液的測(cè)定：——在測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液1-3時(shí)，每個(gè)樣品中6’-唾液酸乳糖鈉鹽的峰面積與濃度的相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.995；——在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1的色譜圖中，6’-唾液酸乳糖鈉鹽、3’-唾液酸乳糖鈉鹽與N-乙酰D-神經(jīng)氨酸的分離度——系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1重復(fù)測(cè)量6次，6’-唾液酸乳糖鈉鹽峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤2.0%；——系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2色譜圖中6’-唾液酸乳糖鈉鹽的信噪比≥150；——系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液3中6’-唾液酸乳糖鈉鹽和N-乙酰D-神經(jīng)氨酸的峰面積為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1峰面積的在此色譜條件下6’-唾液酸乳糖鈉鹽、3’-唾液酸乳糖鈉鹽和N-乙酰D-神經(jīng)氨酸對(duì)照品的參考色譜圖譜見(jiàn)附錄B.1。A.2.6結(jié)果計(jì)算A.2.6.16’-唾液酸乳糖鈉鹽含量的測(cè)定以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中6’-唾液酸乳糖鈉鹽的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，建立校準(zhǔn)曲線(xiàn)，并根據(jù)試樣溶液的峰面積確定測(cè)試樣品中6’-唾液酸乳糖鈉鹽的濃度。6’-唾液酸乳糖鈉鹽含量（以干基計(jì)）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X1按……C1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到試樣溶液中6’-唾液酸乳糖鈉鹽的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）；V1——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；m1——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；ω1——試樣水分，單位為%；((100-ω1)/100)——水分校正；f——稀釋因子。A.2.6.2N-乙酰D-神經(jīng)氨酸含量的測(cè)定A1——試樣溶液中N-乙酰D-神經(jīng)氨酸的峰面積；A2——標(biāo)準(zhǔn)溶液中N-乙酰D-神經(jīng)氨酸的峰面積；m2——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；m3——標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；ω2——標(biāo)準(zhǔn)品水分，單位為%；((100-ω2)/100)——水分校正；P1——N-乙酰D-神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品純度，單位為%；(P1/100)——純度校正；V2——試樣的定容體積，單位為mL；V3——標(biāo)準(zhǔn)品的定容體積，單位為mL；f——稀釋因子。A.2.6.36’-唾液酸乳果糖和3’-唾液酸乳糖鈉鹽含量的測(cè)定6’-唾液酸乳果糖和3’-唾液酸乳糖鈉鹽含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X3按（式A.3）計(jì)算。A3——試樣溶液中6’-唾液酸乳果糖的峰面積；A4——試樣溶液中3’-唾液酸乳糖鈉鹽的峰面積；A5——標(biāo)準(zhǔn)溶液中6’-唾液酸乳糖鈉鹽的峰面積；m4——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；m5——標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；ω3——標(biāo)準(zhǔn)品的水分，單位為%；((100-ω3)/100)——水分校正；P2——3’-唾液酸乳糖鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品純度，單位為%；(P2/100)——純度校正；V4——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；V5——標(biāo)準(zhǔn)品的定容體積，單位為（mL）；f——稀釋因子。A.3D-乳糖的測(cè)定A.3.1方法提要試樣用水溶解后，在陰離子交換色譜柱的液相色譜條件下分離，電化學(xué)脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。A.3.2試劑和材料A.3.2.16’-唾液酸乳糖鈉鹽對(duì)照品：純度＞98.5%。A.3.2.2D-乳糖一水合物對(duì)照品：無(wú)水D-乳糖含量≥95%或標(biāo)明含量的等同物。A.3.2.350%氫氧化鈉溶液：濃度47.0%~53.0%；A.3.2.4醋酸鈉：純度＞99.0%。A.3.3儀器和設(shè)備液相色譜儀：配備電化學(xué)脈沖安培檢測(cè)器（PAD）A.3.4參考色譜條件A.3.4.1色譜柱：陰離子交換色譜柱4.0mmol/L×250mmol/L，10μm或等效柱。A.3.4.2色譜保護(hù)柱：陰離子交換色譜柱4.0mmol/L×50mmol/L，10μm或等效柱。A.3.4.3流動(dòng)相：A相為水；B相為0.5M氫氧化鈉溶液；C相為0.28M醋酸鈉溶液+0.03M氫氧化鈉溶液。梯度洗脫條件見(jiàn)表A.2。表A.2梯度洗脫條件A%B%C%0.0280280282220.0282238.0050.0050.028055.0280A.3.4.4柱溫：30℃。A.3.4.5流速：1.2mL/min。A.3.4.6檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器A.3.4.6.1參比電極：銀/氯化銀電極。A.3.4.6.1工作電極：金電極。A.3.4.7進(jìn)樣體積：10μL。A.3.4.8運(yùn)行時(shí)間：55min。A.3.5分析步驟A.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的乳糖一水合物對(duì)照品，置于同一個(gè)合適的容量瓶中，用水溶解，配制成濃度約為10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)A.3.5.2試樣溶液制備精確稱(chēng)取100mg試樣，加入到100mL的容量瓶中，加水至約容量瓶刻度線(xiàn)2cm以下，振蕩溶解，然后加水定容至A.3.5.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)A.3.5.3.1系統(tǒng)適用性測(cè)試溶液制備系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1：準(zhǔn)確稱(chēng)取乳糖一水合物對(duì)照品，置于一個(gè)合適的容量瓶中，用水溶解，制備得到系統(tǒng)適用性溶液1，使標(biāo)準(zhǔn)品參考濃度約為25μg/mL。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2：取適量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1，加入稀釋溶劑后配制成標(biāo)準(zhǔn)品濃度約為1.25μg/mL的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2。A.3.5.3.2系統(tǒng)適用性測(cè)試系統(tǒng)適用性應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足以下條件：——在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液2中得到的D-乳糖的峰面積為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1峰面積的3.5~6.5%。——系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1中D-乳糖的色譜圖分辨率應(yīng)——當(dāng)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液1重復(fù)測(cè)量6次，D-乳糖峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤2.0%。依據(jù)前述分析條件測(cè)定，D-乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的參考色譜圖譜見(jiàn)A.3.6D-乳糖結(jié)果計(jì)算根據(jù)下式（A.4），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中D-乳糖的峰面積計(jì)算并確定了D-乳糖含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X4。A6——試樣溶液中D-乳糖的峰面積；A7——標(biāo)準(zhǔn)溶液中D-乳糖的峰面積；m6——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；m7——標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；ω4——標(biāo)準(zhǔn)品的水分，單位為%；((100-ω4)/100)——水分校正；V6——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；V7——標(biāo)準(zhǔn)品的定容體積，單位為毫升（mL）；342.30——D-乳糖的分子量（無(wú)水）；360.31——乳糖一水化合物的分子量；f——稀釋因子。A.4殘留蛋白含量的測(cè)定A.4.1方法提要考馬斯亮藍(lán)染色試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)，在595nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度用于蛋白質(zhì)測(cè)定。為了防止樣品基質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)的干擾，樣品溶液與不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液混合后顯色，繪制二次標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量。A.4.2試劑和材料A.4.2.1牛血清白蛋白對(duì)照品：純度≥99%或標(biāo)明含量的等同A.4.2.2考馬斯亮藍(lán)試劑：市售，適用于0.1mg/mL~1.4mg/mL蛋白含量的測(cè)定。A.4.3儀器和設(shè)備A.4.3.1紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。A.4.3.2分析天平：感量0.0001g。A.4.4分析步驟A.4.4.1牛血清白蛋白儲(chǔ)備溶液的制備稱(chēng)取20.0mg牛血清白蛋白對(duì)照品10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.4.4.2牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取100μL上述儲(chǔ)備溶液10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.4.4.3試樣溶液的制備稱(chēng)取200mg樣品于5mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.4.4.4測(cè)定按表A.3直接在比色皿中依次加入試樣溶液、水、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和考馬斯亮藍(lán)試劑，混勻，室溫下靜置10min。然后以水作為參比，在595nm波長(zhǎng)下依次測(cè)定混合溶液的吸光值。表A.3測(cè)試試樣溶液制備蛋白濃度（mg/L）牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(μL）考馬斯亮藍(lán)試劑(μL）空白溶液1000200空白溶液2000200混合溶液006002000200混合溶液11600200混合溶液22600200混合溶液346000200200A.4.4.5結(jié)果計(jì)算以混合溶液的吸光值減去空白吸光值的平均值得到校準(zhǔn)吸光值。以校準(zhǔn)吸光值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制通過(guò)橫坐標(biāo)左半軸交點(diǎn)的二次標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與橫坐標(biāo)左半軸交點(diǎn)對(duì)應(yīng)濃度值的絕對(duì)值即為試樣中蛋白的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的示意圖見(jiàn)圖A.1。圖A.1蛋白含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖試樣中蛋白含量X5按式（A.5）計(jì)算，單位為mg/kg。=××C2——標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與橫坐標(biāo)左半軸交點(diǎn)對(duì)應(yīng)濃度值，數(shù)值為負(fù)值，單位為毫克每升（mg/L）；2——通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的測(cè)定混合溶液中蛋白的濃度，單位為毫克每升（mg/L）；V8——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；f——稀釋因子；m8——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；0.6——1mL混合溶液中試樣溶液的體積為0.6mL；1000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。該方法的定量限為17mg/kg。若結(jié)果低于定量限，則結(jié)果表示為＜17mg/kg。結(jié)果保留整數(shù)位。在重復(fù)性測(cè)定條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)其算術(shù)平均值20%。A.5內(nèi)毒素的測(cè)定（凝膠法）A.5.1一般規(guī)定本測(cè)定所用的水應(yīng)符合滅菌注射用水標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)所用器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性?xún)?nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、至少30min）去除，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器具。試驗(yàn)中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時(shí)，均指水溶液。A.5.2方法提要利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷試樣中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。鱟試劑是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可以與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)，通過(guò)凝膠法進(jìn)行限度檢測(cè)或半定量檢測(cè)內(nèi)毒A.5.3試劑和材料A.5.3.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品。A.5.3.2鱟試劑：帶有靈敏度標(biāo)示值λ。A.5.3.3細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：內(nèi)毒素含量<0.015EU/mL。A.5.4儀器和設(shè)備A.5.4.1旋渦混合器。A.5.4.2恒溫水浴箱。A.5.5分析步驟A.5.5.1試樣溶液配制樣品加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解。必要時(shí)，可調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，一般試樣溶液和鱟試劑混合堿溶液或緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。所用溶劑、酸堿溶液及緩沖液應(yīng)不含內(nèi)毒素和干擾因子。A.5.5.2鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/mL表示。當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(λ),將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15min或參照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30s或參照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作。取不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別與等體積的鱟試劑溶液混合，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外取2管加入等體積的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的恒溫水浴緩緩倒轉(zhuǎn)180°,若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)，造成假陰性結(jié)果。當(dāng)最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc）按式（A.6）計(jì)算，單位為EU/mL。X——為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)，反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度；n——為每個(gè)濃度的平行管數(shù)。當(dāng)λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。A.5.5.3干擾試驗(yàn)按表A.4制備溶液A、B、C和D，使用的試樣溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是指在試驗(yàn)中試樣溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)，MVD按式（A.7）計(jì)算：c——為試樣溶液的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL如需計(jì)算在MVD時(shí)的試樣濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=λ/L；L——試樣的細(xì)胞內(nèi)毒素限量，單位為內(nèi)毒素單位每毫克（EU/mg）；λ——鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，單位為內(nèi)毒素單位每毫升（EU/mL）。表A.4干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的平行管數(shù)A無(wú)/試樣溶液———2B2λ/試樣溶液試樣溶液12λ4248λ0.5λ0.25λ444C2λ/內(nèi)毒素檢查用水檢查用水12482λλ0.5λ0.25λ2222D無(wú)/內(nèi)毒素檢查用水———2注：A為試樣溶液；B為干擾試驗(yàn)溶液；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度對(duì)照系列；D為陰性對(duì)照。只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，試驗(yàn)有效。當(dāng)系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，認(rèn)為試樣在該濃度下無(wú)干擾作用。其他情況則認(rèn)為試樣在該濃度下存在干擾作用。若試樣溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將試樣溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD的進(jìn)一步稀釋?zhuān)俅沃貜?fù)干擾試驗(yàn)?？赏ㄟ^(guò)對(duì)試樣進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過(guò)其他適宜的方法（如過(guò)濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過(guò)處理的試樣溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)行樣品的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。A.5.5.4測(cè)定A.5.5.4.1凝膠限度試驗(yàn)按表A.5制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過(guò)MVD并且已經(jīng)排除干擾的試樣溶液來(lái)制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表A.5凝膠限度試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無(wú)/試樣溶液2B2λ/試樣溶液2C2λ/內(nèi)毒素檢查用水2D無(wú)/內(nèi)毒素檢查用水2注：A為試樣溶液；B為試樣陽(yáng)性對(duì)照；C為陽(yáng)性對(duì)照；D為陰性對(duì)照。保溫60min±2min后觀(guān)察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，試樣陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照溶液C的平行管均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定試樣符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽(yáng)性，判定試樣不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定試樣符合規(guī)定，否則判定試樣不符合規(guī)定。若試樣的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A結(jié)果出現(xiàn)不符合規(guī)定時(shí)，可將試樣稀釋至MVD重新實(shí)驗(yàn)，再對(duì)結(jié)果進(jìn)行判A.5.5.4.2凝膠半定量試驗(yàn)通過(guò)確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來(lái)量化試樣中內(nèi)毒素的含量。按表A.6制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表A.6凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的平行管數(shù)A無(wú)/試樣溶液檢查用水1248 2222B2λ/試樣溶液—12λ2C2λ/內(nèi)毒素檢查用水檢查用水12482λλ0.5λ0.25λ2222D無(wú)/內(nèi)毒素檢查用水———2注：A為不超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾試驗(yàn)的試樣溶液。從通過(guò)干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開(kāi)始用內(nèi)毒素檢查用水稀釋如1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MVD；B為含2λ溶度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的溶液A（試樣陽(yáng)性對(duì)照）；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度對(duì)照系列；D為陰性對(duì)照。若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，試樣陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何A.5.5.5結(jié)果判定系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ,為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度。如果檢驗(yàn)的是經(jīng)稀釋的試樣，則將終點(diǎn)濃度乘以試樣進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列內(nèi)毒素濃度c。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定試樣符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為試樣溶液的內(nèi)毒素濃度[按公式CE=antilg(Σlgc/2)]。若試驗(yàn)中試樣溶液的所有平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗(yàn)的是稀釋過(guò)的試樣，則記為小于λ乘以試樣進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)）。