分子生物學常用技術(shù)

關(guān)于分子生物學常用技術(shù)分子生物學常用技術(shù)凝膠電泳分子雜交聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)DNA的物理圖譜DNA序列測定基因芯片第2頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:遷移率

Q:電荷量

r:粒子半徑（分子量）η:介質(zhì)粘度

第3頁,共130頁，2024年2月25日，星期天電泳的用途分離鑒定純度測定分子量凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳

第4頁,共130頁，2024年2月25日，星期天一、瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectrophoresis)

分離核酸原理操作要點應用范圍第5頁,共130頁，2024年2月25日，星期天（一）分離核酸原理

電荷效應

分子篩效應

分子構(gòu)象第6頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1.電荷效應核酸是兩性電解質(zhì)

pH=3.5,正電荷pH=8.0~8.3

,負電荷，正極第7頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2.分子篩效應小分子移動快，大分子移動慢第9頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3.分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開環(huán)DNA

+-第10頁,共130頁，2024年2月25日，星期天（二）操作要點支持物凝膠濃度的選擇

DNA分子量標準電泳緩沖液樣品制備電泳條件

DNA電泳染色

DNA片段的回收第11頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1.支持物第12頁,共130頁，2024年2月25日，星期天商品化的瓊脂糖第13頁,共130頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖種類普通低熔點高純高篩分熔點80~90℃<70℃80~90℃80~90℃機械強度中差高高分辨率中差中高第14頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2.凝膠濃度的選擇第15頁,共130頁，2024年2月25日，星期天凝膠的制備第16頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3.DNAmarker第19頁,共130頁，2024年2月25日，星期天DNAmarker第20頁,共130頁，2024年2月25日，星期天DNA長度標準曲線第21頁,共130頁，2024年2月25日，星期天4.電泳緩沖液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)

pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0

第22頁,共130頁，2024年2月25日，星期天5.樣品制備上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍/二甲苯青

第23頁,共130頁，2024年2月25日，星期天點樣第24頁,共130頁，2024年2月25日，星期天6.電泳條件潛水電泳恒壓電泳

低壓:1~2V/cm

中壓:8~10V/cm

高壓電泳：>幾十V/cm溫度：15~25℃

第25頁,共130頁，2024年2月25日，星期天潛水電泳第26頁,共130頁，2024年2月25日，星期天7.電泳染色溴乙錠(ethidiumbromide,EB)

結(jié)構(gòu)及染色原理染色方法加入凝膠液中

電泳結(jié)束后染色第27頁,共130頁，2024年2月25日，星期天EB染色原理第28頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共130頁，2024年2月25日，星期天紫外燈下顯色第30頁,共130頁，2024年2月25日，星期天8.DNA片段的回收低熔點瓊脂糖法

透析袋電洗脫法(>5kb)DEAE-纖維素膜法(0.5~5kb)第31頁,共130頁，2024年2月25日，星期天（三）應用范圍

DNA的分離、純化和鑒定限制性酶切圖譜分析重組體的分離、鑒定雜交分析

PCR產(chǎn)物的分離鑒定第32頁,共130頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳第33頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分離原理操作要點優(yōu)點應用范圍第34頁,共130頁，2024年2月25日，星期天（一）分離原理

電荷效應分子篩效應第35頁,共130頁，2024年2月25日，星期天PAGE支持物單體－丙烯酰胺(Acr)

交聯(lián)劑－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)

催化劑－過硫酸胺(AP)

加速劑－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)第36頁,共130頁，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝膠第37頁,共130頁，2024年2月25日，星期天（二）操作要點凝膠的分類凝膠濃度的選擇凝膠液的配制凝膠中DNA的檢測DNA片段的回收第38頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1.凝膠的分類非變性凝膠：dsDNA變性凝膠:ssDNA尿素甲酰胺SDS第39頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2.凝膠濃度的選擇第40頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3.凝膠液的配制

試劑(ml)制備濃度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml第42頁,共130頁，2024年2月25日，星期天PAGE裝置第43頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共130頁，2024年2月25日，星期天電泳第47頁,共130頁，2024年2月25日，星期天4.凝膠中DNA的檢測溴乙錠染色法

銀鹽染色法甲醛還原放射自顯影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

第48頁,共130頁，2024年2月25日，星期天5.DNA片段的回收壓碎浸泡法<1kb

純度高，回收率低第49頁,共130頁，2024年2月25日，星期天（三）PAGE優(yōu)點機械強度好、化學穩(wěn)定性高分辨率高載樣量大回收的DNA純度高

第50頁,共130頁，2024年2月25日，星期天（四）PAGE應用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)的檢測和分析第51頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)分子雜交

分子雜交的基本原理固相支持物探針幾種常用雜交技術(shù)第52頁,共130頁，2024年2月25日，星期天一、分子雜交的基本原理

核酸的變性和復性第53頁,共130頁，2024年2月25日，星期天分子雜交DNA-DNA第54頁,共130頁，2024年2月25日，星期天DNA-RNA第55頁,共130頁，2024年2月25日，星期天雜交條件

靶分子探針雜交袋雜交爐第56頁,共130頁，2024年2月25日，星期天雜交種類被檢核酸種類和方法原位雜交斑點雜交Southern雜交Northern雜交Western雜交反應介質(zhì)液相雜交固相雜交(

)第57頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、固相支持物固相支持物的特性結(jié)合能力強不影響雜交反應結(jié)合牢固非特異性吸附少機械性能良好

第58頁,共130頁，2024年2月25日，星期天固相支持物的種類硝酸纖維素濾膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龍膜(nylonmembrane)第59頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1.硝酸纖維素濾膜

特點吸附ssDNA和RNA

雜交信號本底低不足不適于重復雜交濾膜較脆不適于電轉(zhuǎn)移印跡法對DNA小片段(<200bp)結(jié)合能力弱第60頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2.尼龍膜特點結(jié)合能力強

可反復雜交

韌性強

適于電轉(zhuǎn)移印跡法對DNA小片段(10bp)結(jié)合能力強不足雜交信號本底較高

第61頁,共130頁，2024年2月25日，星期天分子生物學考試時間：2005.1.11(晚7:00-9:00)地點9教講演廳(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地點：逸夫樓3樓生化實驗室第62頁,共130頁，2024年2月25日，星期天三、探針(probe)探針的概念探針的類型

標記物的種類標記方法第63頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1.探針的概念特異結(jié)合和檢測靶分子的活性物質(zhì)抗原－抗體配體－受體同源DNA/RNA第64頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2.探針的類型基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針蛋白質(zhì)或多肽探針第65頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3.標記物的種類放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性標記物生物素地高辛熒光素酶

第66頁,共130頁，2024年2月25日，星期天4.核酸探針的放射性標記方法

DNA缺口平移標記法隨機引物標記法

DNA的5’末端標記

第67頁,共130頁，2024年2月25日，星期天缺口翻譯特點均一標記制備dsDNA探針第68頁,共130頁，2024年2月25日，星期天隨機引物標記法(randompriming)

隨機引物6nt含有各種可能的排列順序特點放射比活性>缺口翻譯操作簡便DNA/cDNA探針第69頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第70頁,共130頁，2024年2月25日，星期天DNA的5’末端標記(5’endlabeling)

堿性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶標記原理制備寡核苷酸探針制備短的DNA/RNA探針

第71頁,共130頁，2024年2月25日，星期天DNA的5’末端標記第72頁,共130頁，2024年2月25日，星期天四、Southern雜交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印跡(blotting):轉(zhuǎn)移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting

第73頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1.印跡的方法

毛細管轉(zhuǎn)移法

電轉(zhuǎn)移法

真空轉(zhuǎn)移法

第74頁,共130頁，2024年2月25日，星期天毛細管轉(zhuǎn)移法第75頁,共130頁，2024年2月25日，星期天電轉(zhuǎn)移法第76頁,共130頁，2024年2月25日，星期天真空轉(zhuǎn)移法第77頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第78頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2.Southern雜交的步驟第79頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3.Southern雜交的應用基因的定性及定量分析基因的酶切圖譜分析基因突變分析RFLP第80頁,共130頁，2024年2月25日，星期天五、Northern雜交

RNAblotting

步驟

總RNA/mRNA→變性電泳分離→轉(zhuǎn)移→雜交→放射自顯影/化學顯色

應用檢測組織/細胞中mRNA的大小、量比較不同組織/細胞中基因的表達情況

第81頁,共130頁，2024年2月25日，星期天Northern雜交第82頁,共130頁，2024年2月25日，星期天六、Western雜交免疫印跡(immunoblotting)

SDS→轉(zhuǎn)移→蛋白－第一抗體→標記的第二抗體(探針)→檢測

應用蛋白質(zhì)的定性定量分析第83頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第84頁,共130頁，2024年2月25日，星期天免疫印跡第85頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

Southern,Northern&Western

待測物質(zhì)

支持物

探針

轉(zhuǎn)移方式Southern

DNANC單鏈核酸

毛細管/電/真空

Northern

RNANC/尼龍單鏈核酸

毛細管/電/真空

Western

蛋白質(zhì)NC/PVDF

抗體電轉(zhuǎn)移

第86頁,共130頁，2024年2月25日，星期天七、原位雜交

(insituhybridization)定義種類細胞內(nèi)原位雜交組織切片原位雜交

基本程序細胞/組織固定預雜交雜交沖洗雜交信號檢測分析結(jié)果

第87頁,共130頁，2024年2月25日，星期天組織切片第88頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第89頁,共130頁，2024年2月25日，星期天八、斑點雜交

(dothybridization)

第90頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)PCR的發(fā)展簡史PCR的基本原理和步驟PCR的影響因素PCR的種類PCR的應用第91頁,共130頁，2024年2月25日，星期天一、PCR的發(fā)展簡史1971年,Korana提出核酸體外擴增的設想1985年,Mullis等發(fā)明了PCR技術(shù)1988年,PE-Cetus公司推出了第一臺PCR儀

第92頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復制三個步驟變性(denaturation)

退火(annealing)

延伸(extension)

第93頁,共130頁，2024年2月25日，星期天PCR的原理第94頁,共130頁，2024年2月25日，星期天PCR的擴增產(chǎn)物cycle

12345n長片段

246810短片段

002822長＋短

21222324252n第95頁,共130頁，2024年2月25日，星期天標準的PCR反應體系10X擴增緩沖液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4種dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U總體積：100ul第96頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第97頁,共130頁，2024年2月25日，星期天三、PCR的影響因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4種dNTP

Mg2+循環(huán)條件

第98頁,共130頁，2024年2月25日，星期天模板

DNARNAcDNA對模板的純度要求低第99頁,共130頁，2024年2月25日，星期天引物長度：15～30nt

G+C含量：40~60%

堿基的隨機分布避免引物自身和引物之間的互補引物的3’端引物的5’端引物濃度：0.2~1umol/L

第100頁,共130頁，2024年2月25日，星期天TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul

－20℃保存最后加

第101頁,共130頁，2024年2月25日，星期天底物4種dNTP

的濃度相等終濃度：200umol/L

第102頁,共130頁，2024年2月25日，星期天Mg2+

濃度:1.5～2.0mmol/L

過高:非特異擴增

過低:反應產(chǎn)物減少第103頁,共130頁，2024年2月25日，星期天循環(huán)條件變性溫度和時間:90~96℃,30~60s退火溫度和時間:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸溫度和時間70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循環(huán)次數(shù):25～35

第104頁,共130頁，2024年2月25日，星期天四、PCR的種類反轉(zhuǎn)錄PCR原位PCR(insituPCR)實時PCR(realtimePCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)第105頁,共130頁，2024年2月25日，星期天原位PCR原位雜交＋PCR程序固定細胞/組織樣品→PCR前處理→PCR擴增→原位雜交及檢測

第106頁,共130頁，2024年2月25日，星期天實時PCR的原理第107頁,共130頁，2024年2月25日，星期天五、PCR的應用分子生物學研究臨床醫(yī)學第108頁,共130頁，2024年2月25日，星期天分子生物學研究基因克隆

DNA序列測定基因的體外定點突變

突變分析(PCR-SSCP)

基因定量

第109頁,共130頁，2024年2月25日，星期天臨床醫(yī)學病原體診斷

遺傳病的基因診斷

腫瘤檢測

法醫(yī)學

第110頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)DNA序列測定

Sanger雙脫氧鏈終止法(1977)

Maxam-Gilbert化學裂解法(1977)第111頁,共130頁，2024年2月25日，星期天Sanger雙脫氧鏈終止法原理－DNA復制

反應條件模板引物

dNTP（其中一種帶放射性標記）

ddNTP

DNA聚合酶第112頁,共130頁，2024年2月25日，星期天DNA的復制第113頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2’,3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP)第114頁,共130頁，2024