4.(1)基因工程賦予生物新的遺傳特性（第3課時）（教學(xué)課件）高二生物（浙科版20(1)9選擇性必修3）

第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過化學(xué)信號實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過化學(xué)信號實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)第四章基因工程第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第一節(jié)基因工程賦予生物新的遺傳特性第3課時基因工程的基本操作程序2基因工程的基本操作步驟獲取目的基因構(gòu)建重組DNA分子將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞檢測目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物目

錄將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞構(gòu)建重組DNA分子（核心）檢測目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物（二）、構(gòu)建重組DNA分子--核心①用一定的限制酶切割表達(dá)載體（質(zhì)粒），使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。②用同一種限制酶切斷目的基因DNA片段，使其產(chǎn)生同樣的黏性末端。③將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。利用表達(dá)載體構(gòu)建重組DNA分子----核心1.如何構(gòu)建重組DNA分子？那什么是表達(dá)載體呢？克隆載體：用于大量擴(kuò)增外源DNA的載體。

目的：克隆基因可以獲得大量的DNA分子，不僅用于基因診斷、法醫(yī)鑒定、判斷物種親緣關(guān)系等研究工作，還可以用于指導(dǎo)合成大量稀有的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，如胰島素、干擾素和抗癌藥物等。2.克隆載體與表達(dá)載體為什么要構(gòu)建克隆載體？

許多外源DNA片段自身很難在受體細(xì)胞內(nèi)成功復(fù)制，需要與含有復(fù)制起點(diǎn)的DNA分子相連

表達(dá)載體：使目的基因既能擴(kuò)增又能表達(dá)出相應(yīng)蛋白質(zhì)的載體。表達(dá)載體包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯信號。構(gòu)建表達(dá)載體的目的：2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代復(fù)制原點(diǎn)：復(fù)制的起始點(diǎn)啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因多個限制酶的識別序列：便于插入目的基因3.基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+啟動子+終止子+標(biāo)記基因+多個限制酶的識別序列思考：得到的一定是重組DNA分子嗎？

載體（質(zhì)粒）同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割帶有黏性末端（或平末端）的切口帶有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）4、構(gòu)建重組DNA分子含有目的基因的DNA片段思考：如何防止質(zhì)?；蚰康幕蜃陨憝h(huán)化呢？基因兩端用2種不同的限制酶切割，并用同樣的2種酶切割質(zhì)粒用ＤＮＡ連接酶連接時，可形成３種不同的連接物：

目的基因—載體連接物（正反向）載體—載體連接物（自身環(huán)化）目的基因—目的基因連接物（自身環(huán)化）在構(gòu)建重組DNA分子時,用同種限制酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表達(dá)載體,然后用DNA連接酶將它們連接起來,形成重組DNA分子。在實(shí)際操作過程中可出現(xiàn)下圖所示情況,據(jù)圖回答問題?！皢蚊盖蟹ā焙汀半p酶切法”1.黏性末端1與2能否經(jīng)DNA連接酶連接?3與4呢?為什么?此現(xiàn)象說明“單酶切法”具有什么缺點(diǎn)?2.黏性末端1與4、2與3能否經(jīng)DNA連接酶連接?此現(xiàn)象說明“單酶切法”具有什么缺點(diǎn)?提示

均能。因?yàn)橥环N限制酶切割后形成的黏性末端互補(bǔ)(相同)。此現(xiàn)象說明“單酶切法”會導(dǎo)致質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化。提示

均能。說明“單酶切法”會導(dǎo)致質(zhì)粒與目的基因反向連接。3.如何避免以上問題?提示

使用兩種限制酶分別對目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行切割(目的基因的兩側(cè)和質(zhì)粒上含有這兩種限制酶的酶切位點(diǎn)),且兩種限制酶產(chǎn)生的黏性末端不同(不互補(bǔ)),這樣能有效地避免質(zhì)粒與目的基因的反向連接以及自身環(huán)化。選擇限制酶的方法(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶酶切位點(diǎn)確定限制酶的種類①應(yīng)選擇酶切位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶,如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇酶切位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶,如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的酶切位點(diǎn))切割。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)來確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致,以確保具有互補(bǔ)的黏性末端。②質(zhì)粒作為表達(dá)載體必須具有標(biāo)記基因等,所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)。(3)在重組DNA分子中,啟動子應(yīng)位于目的基因的首端,終止子應(yīng)位于目的基因的尾端,這樣目的基因才能表達(dá),即酶切位點(diǎn)應(yīng)位于啟動子與終止子之間。例題1.圖甲、乙分別表示質(zhì)粒和外源DNA,其中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列相關(guān)敘述正確的是(

)A.用質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒過程中,不能使用SmaⅠ切割B.圖甲所示的質(zhì)粒分子在經(jīng)SmaⅠ切割后含有4個游離的磷酸基團(tuán)C.為獲取重組質(zhì)粒,將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合,并加入DNA聚合酶D.用EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ中的任意一種酶切割質(zhì)粒和外源基因都可以A例題2.在構(gòu)建重組DNA分子時,需要選擇合適的限制酶去切割表達(dá)載體和目的基因所在的DNA分子。下列相關(guān)敘述錯誤的是(

)A.可以選擇同一種限制酶分別切割表達(dá)載體和目的基因所在的DNA分子B.可以選擇能產(chǎn)生相同末端的兩種限制酶分別切割表達(dá)載體和目的基因所在的DNA分子C.可以選擇一種限制酶切割表達(dá)載體,另一種限制酶(產(chǎn)生的黏性末端與前一種不同)切割目的基因所在的DNA分子D.構(gòu)建重組DNA分子時,除了要用到限制性內(nèi)切核酸酶之外,還要用到DNA連接酶C（三）、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞2、常用的受體細(xì)胞：接受目的基因的細(xì)胞，如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌和動、植物細(xì)胞等3、導(dǎo)入方法：1、含義：用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑿纬傻闹亟MDNA分子轉(zhuǎn)移到合適的受體細(xì)胞中。

（1）導(dǎo)入微生物細(xì)胞——Ca2+處理法②

Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）的一般過程低溫、Ca2+處理大腸桿菌使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中Ca2+的作用：增加細(xì)胞膜通透性這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞一般利用溫度變化導(dǎo)入①受體細(xì)胞：常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌最廣泛。（1）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞低溫將大腸桿菌與重組DNA分子混合，熱刺激①受體細(xì)胞：受精卵。因?yàn)槭芫讶菀妆憩F(xiàn)出全能性。②過程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物（2）導(dǎo)入動物細(xì)胞——顯微注射法顯微操作儀轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。①易感染雙子葉植物和裸子植物；②內(nèi)含Ti質(zhì)粒，其上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體DNA上。農(nóng)桿菌特點(diǎn)（3）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常使用）（3）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常使用）植物組織培養(yǎng)技術(shù)農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA片段能整合到植物染色體DNA中Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA中植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植株植物組織培養(yǎng)生物種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2+處理法、感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞體細(xì)胞、受精卵受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將重組DNA分子→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→融合到受體細(xì)胞的DNA中得以表達(dá)將重組DNA分子提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物CaCI2處理大腸桿菌細(xì)胞→大腸桿菌細(xì)胞的細(xì)胞膜的通透性改變→含有目的基因的重組質(zhì)粒（DNA）進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞3、導(dǎo)入方法：導(dǎo)入植物細(xì)胞：還有電擊法、基因槍法與花粉管通道法導(dǎo)入受體細(xì)胞后，目的基因是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性呢？檢查基因工程是否成功目的基因的檢測與鑒定四、檢測目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物檢測和鑒定的四個方面:DNA、RNA、蛋白質(zhì)、個體性狀檢測DNA檢測RNA、蛋白質(zhì)以及個體水平上是否出現(xiàn)相應(yīng)性狀1.檢測目的基因是否穩(wěn)定存在：2.檢測目的基因是否正確表達(dá)：檢測內(nèi)容及形式：(1)借助載體上的標(biāo)記基因可以檢測目的基因是否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定地存在并遺傳。1.檢測目的基因是否穩(wěn)定存在：

例如，某些應(yīng)用于大腸桿菌的質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性基因和LacZ基因兩種標(biāo)記基因。可使大腸桿菌具有青霉素抗性并能夠合成β-半乳糖苷酶，該酶能催化無色的X-gal（5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷)分解為半乳糖和藍(lán)色的5-溴-4-氯淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，將目的基因插入這種質(zhì)粒上的LacZ基因中，使該基因失活，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，從而使含有重組DNA的大腸桿菌在含有X-gal和青霉素的培養(yǎng)基上形成白色菌落；而只導(dǎo)入不含目的基因的載體的大腸桿菌則形成藍(lán)色菌落，不含有載體的大腸桿菌無法生長。含重組DNA的大腸桿菌：白色不含目的基因的載體的大腸桿菌：藍(lán)色不含有載體的大腸桿菌：不能生存(2)利用PCR技術(shù)檢測更精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因的方法根據(jù)目的基因的序列設(shè)計引物利用待檢DNA為模板進(jìn)行PCR通過電泳或DNA測序技術(shù)鑒定PCR產(chǎn)物(3)利用核酸分子雜交技術(shù)檢測原理：兩個不同來源核酸單鏈的核苷酸之間堿基互補(bǔ)配對①核酸探針：是帶有放射性或熒光標(biāo)記的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA②過程：使待檢的DNA變性成單鏈并固定在硝酸纖維素膜上加入探針漂洗硝酸纖維素膜去除未互補(bǔ)結(jié)合的探針檢測硝酸纖維素膜的放射性或熒光2.檢測目的基因是否正確表達(dá)：1.檢測mRNA------運(yùn)用核酸分子雜交技術(shù)2.檢測蛋白質(zhì)------運(yùn)用抗原-抗體雜交技術(shù)3.個體水平-----觀察測定個體是否表現(xiàn)出目的基因控制的特定性狀并穩(wěn)定遺傳是判斷轉(zhuǎn)基因成功的直接證據(jù)個體水平的鑒定例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。3.如果目的基因是抗蟲基因，在個體水平上怎么檢測？如果目的基因是耐鹽基因呢？PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)

用核酸分子雜交技術(shù)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA；用抗原一抗體雜交技術(shù)檢測目的基因是否翻譯出相應(yīng)蛋白質(zhì)

如果目的基因是抗蟲基因，則要進(jìn)行抗蟲接種實(shí)驗(yàn)；如果，目的基因是耐鹽基因，則要用一定濃度的鹽水澆灌。1.用什么方法可以更加精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因？2.用什么方法檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄和翻譯？思考：目的基因表達(dá)檢測是否轉(zhuǎn)錄檢測——核酸分子雜交是否翻譯檢測——抗原-抗