噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座

Contents噬菌體介紹1噬菌體應(yīng)用技術(shù)介紹2噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用3前景及展望4噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第1頁(yè)1、噬菌體介紹概念：噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體、立克次體及放線菌等微生物病毒,屬非細(xì)胞微生物。特征：個(gè)體微小，需用電鏡觀察，能夠經(jīng)過(guò)細(xì)菌濾器；沒(méi)有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋白質(zhì)組成；專性活細(xì)胞內(nèi)寄生,含有嚴(yán)格寄生特異性。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第2頁(yè)形態(tài)與結(jié)構(gòu)形態(tài)：蝌蚪形，微球形，細(xì)桿形噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第3頁(yè)噬菌體顆粒在結(jié)構(gòu)上有很大差異，普通可分成三種類型，即

無(wú)尾部結(jié)構(gòu)二十面體，有尾部結(jié)構(gòu)二十面體和線狀體，迄今已知噬菌體大多數(shù)是有尾部結(jié)構(gòu)二十面體。

頭部尾部噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第4頁(yè)核酸：DNA或RNA,基因組大小為2-200kb，一些噬菌體基因組中還含有異常堿基。

大多數(shù)為線狀雙鏈

DNA噬菌體少數(shù)為環(huán)狀單鏈多數(shù)為線狀單鏈RNA噬菌體少數(shù)為線狀雙鏈?zhǔn)删w及其研究進(jìn)展專家講座第5頁(yè)噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第6頁(yè)化學(xué)組成核酸：DNA或RNA,基因組大小為2-200kb，一些噬菌體基因組中還含有異常堿基。

大多數(shù)為線狀雙鏈

DNA噬菌體少數(shù)為環(huán)狀單鏈多數(shù)為線狀單鏈

RNA噬菌體少數(shù)為線狀雙鏈?zhǔn)删w及其研究進(jìn)展專家講座第7頁(yè)噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第8頁(yè)按與宿主相互關(guān)系，噬菌體能夠分為兩種類型：

烈性噬菌體，溫和噬菌體（溶原性噬菌體）

烈性噬菌體:能在宿主菌內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細(xì)菌。

溫和噬菌體（溶原性噬菌體）：噬菌體基因組整合于宿主菌染色體中，不產(chǎn)生子代噬菌體，也不引發(fā)細(xì)菌裂解，但噬菌體DNA隨細(xì)菌基因組復(fù)制而復(fù)制，并隨細(xì)菌分裂而分配至子代細(xì)菌基因組中。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第9頁(yè)吸附穿入生物合成裝配釋放烈性噬菌體溶菌周期噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第10頁(yè)2、噬菌體應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用判定細(xì)菌分型測(cè)定輻射劑量檢測(cè)基因產(chǎn)物活性篩選目標(biāo)基因

檢測(cè)病原菌預(yù)防和治療傳染性疾病噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第11頁(yè)3、噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用食源性疾病病原檢測(cè)技術(shù)作為食品添加劑噬菌體展示技術(shù)檢測(cè)真菌毒素噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第12頁(yè)3.1食源性疾病病原檢測(cè)技術(shù)

食源性疾病病原檢測(cè)技術(shù)是食源性疾病預(yù)防與控制關(guān)健技術(shù)步驟。數(shù)據(jù)顯示，每年大約有7600萬(wàn)人因食用了受污染食物而患病，其中91%是因?yàn)榧?xì)菌污染造成?，F(xiàn)存檢測(cè)方法包含傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法、生物芯片技術(shù)和免疫學(xué)方法等。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)費(fèi)勁、價(jià)格昂貴、特異性或靈敏度低、國(guó)內(nèi)試劑供給不配套等，極難適應(yīng)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處理快速反應(yīng)需要。有必要尋找一個(gè)簡(jiǎn)捷、快速、靈敏度高檢測(cè)食源性病原微生物方法以及技術(shù)平臺(tái)。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第13頁(yè)檢測(cè)方法匯報(bào)基因檢測(cè)

熒光染料標(biāo)識(shí)

噬菌斑檢測(cè)

噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第14頁(yè)3.1.1噬菌斑檢測(cè)原理：用噬菌體截獲某種病原菌，隨即病原菌被噬菌體感染，用殺毒劑將胞外剩下噬菌體殺死，然后將噬菌體與被感染細(xì)胞混合并在裝有軟瓊脂雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)，被感染細(xì)胞破裂釋放出子代噬菌休，在培養(yǎng)基中就會(huì)形成空斑。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第15頁(yè)試驗(yàn)方法標(biāo)本采集后置于SC增菌管中37℃增菌18h左右,SS平板分離培養(yǎng)37℃過(guò)夜,然后挑出含有沙門(mén)氏菌特征單個(gè)菌落劃線接種于普通瓊脂平皿上,每塊平板劃格后可接種8個(gè)菌落左右。在每格中央用滅菌毛細(xì)滴管滴上O-I噬菌體,待溶液干后置37℃6-8h培養(yǎng)或過(guò)夜,觀察噬菌體裂解情況。發(fā)覺(jué)被O-I噬菌體裂解菌株,馬上挑取噬斑周圍菌苔直接做沙門(mén)氏菌A-F多價(jià)血清凝集試驗(yàn),凝集陽(yáng)性者即可初步匯報(bào)結(jié)果,然后轉(zhuǎn)種克氏雙糖鐵管作深入判定分型。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第16頁(yè)簡(jiǎn)例O-I噬菌體是作用于沙門(mén)氏菌屬特異性噬菌體,染色體為雙鏈DNA,受體是宿主細(xì)胞壁上關(guān)鍵多糖乙酰氨基葡萄糖。應(yīng)用O-I噬菌體進(jìn)行飲食行業(yè)及公共場(chǎng)所從業(yè)人員帶菌調(diào)查結(jié)果表明,沙門(mén)氏菌檢出率為0.131%,與廣東省報(bào)道0.134%檢出率相近,說(shuō)明O-I噬菌體應(yīng)用對(duì)沙門(mén)氏菌診療含有較高特異性和敏感性,不失為大量從業(yè)人員沙門(mén)氏菌調(diào)查較為理想快速診療方法。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第17頁(yè)3.1.2熒光染料標(biāo)識(shí)法原理：選取一個(gè)適當(dāng)染色劑，噬菌體核酸染色標(biāo)識(shí)，然后用標(biāo)識(shí)過(guò)噬菌體侵染對(duì)應(yīng)宿主菌，噬菌體吸附在宿主菌表面后，隨即將標(biāo)識(shí)過(guò)核酸注入宿主細(xì)胞，伴隨越來(lái)越多噬菌體核酸注入，細(xì)胞內(nèi)熒光伴隨熒光素增多而增強(qiáng)，借助熒光顯微鏡便能判定宿主菌存在，從而實(shí)現(xiàn)病原菌檢測(cè)。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第18頁(yè)介紹A圖只有細(xì)菌,熒光視野里不見(jiàn)任何發(fā)光物質(zhì);B圖中只有熒光標(biāo)識(shí)O-I噬菌體,視野下偶然可見(jiàn)少許圓點(diǎn)狀熒光物質(zhì),不見(jiàn)菌形;C圖是熒光標(biāo)識(shí)O-I噬菌體和沙門(mén)氏菌混合,可見(jiàn)大量桿狀物,少許點(diǎn)狀物,極少數(shù)彗星狀桿狀物,將桿狀物質(zhì)與沙門(mén)氏菌革蘭氏染色形態(tài)進(jìn)行比較,二者一致。由此可推知,C圖中桿形物是侵有熒光噬菌體沙門(mén)氏菌,點(diǎn)狀物是標(biāo)識(shí)O-I噬菌體,結(jié)合B圖可知彗星狀桿形物是即將裂解宿主菌。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第19頁(yè)簡(jiǎn)例蔣魯巖等用此方法快速檢測(cè)食品源沙門(mén)氏菌，檢測(cè)靈敏度達(dá)10CFU/100μL;120份食品樣品中沙門(mén)氏菌O-I噬菌體檢測(cè)與生化判定結(jié)果陽(yáng)性率分別為9.17%和10%,符合率為91.7%。表明用熒光標(biāo)識(shí)O-I噬菌體能夠快速、直觀、準(zhǔn)確、大量地檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第20頁(yè)3.1.3匯報(bào)基因檢測(cè)技術(shù)該技術(shù)中，將一個(gè)匯報(bào)基因經(jīng)過(guò)噬菌體插入到目標(biāo)菌體DNA中，伴隨匯報(bào)基因表示，目標(biāo)菌體便可快速得到檢測(cè)。應(yīng)用在這一技術(shù)匯報(bào)系統(tǒng)主要有原核生物和真核生物熒光素酶(lux,luc)基因，細(xì)菌冰核蛋白(inaW)基因，E.coliβ-半乳糖苷酶(lacZ)基因和生物素親和蛋白。匯報(bào)噬菌體已經(jīng)能夠成功檢測(cè)許多菌種，如E.coli,Salmonella.spp等。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第21頁(yè)介紹噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第22頁(yè)利用熒光素酶基因作為匯報(bào)基因快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)，發(fā)光機(jī)理可用下式表述：FMNH2+RCHO+O2→FMN+H2O+RCOOH+hν(490nm)反應(yīng)是在熒光素酶催化下進(jìn)行。細(xì)菌熒光素酶是一個(gè)77kD二聚體，其中包含α亞基(4037kD)和β亞基(37kD)。當(dāng)前，生物發(fā)光基因(lux,luc)在匯報(bào)噬菌體檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛。Waddell等利用轉(zhuǎn)座子致突變，將lucA和lucB基因插入到E.coliO157:H7溫和噬菌體φV10中，構(gòu)建了一個(gè)熒光素酶轉(zhuǎn)座噬菌體，這一噬菌體能夠使E.coliO157:H7在1h內(nèi)被成功檢測(cè)，并匯報(bào)出結(jié)果。Masahito等將綠熒光蛋白(GFP)基因分別插入到T偶數(shù)型噬菌體PP01外殼蛋白(SOC)基因C末端和N末端，構(gòu)建成噬菌體PP01-GFP/SOC和PP01-SOC/GFP，這種對(duì)E.coliO157:H7特異噬菌體能夠成功檢測(cè)菌體可培養(yǎng)細(xì)胞，不可培養(yǎng)但可存活細(xì)胞(VBNC)及經(jīng)過(guò)巴氏消毒過(guò)細(xì)胞，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間僅為20min。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第23頁(yè)以β-半乳糖苷酶作為匯報(bào)基因快速檢測(cè)技術(shù)β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一個(gè)催化β-半乳糖苷水解反應(yīng)糖苷酶。β-半乳糖苷酶作用特征是伴隨水解反應(yīng)底物不一樣而改變，鄰硝基苯β-D-半乳糖苷是檢測(cè)中慣用靈敏基質(zhì)，它被β-半乳糖苷酶水解后產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，該技術(shù)能夠使檢測(cè)靈敏度到達(dá)生物發(fā)光熒光素酶檢測(cè)水平。Goodridge等設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有l(wèi)acZ基因T4噬菌體，用這種噬菌體感染待測(cè)樣品，并用化學(xué)發(fā)光基質(zhì)作為檢測(cè)基質(zhì)，研究人員成功檢測(cè)了肉湯培養(yǎng)基中E.coli，檢測(cè)限僅為102CFU/ml。然后，研究人員將最大約率數(shù)(mostprobablenumber，MPN)法應(yīng)用到食源性病原菌檢測(cè)中，檢測(cè)水平可降至10CFU/ml，用時(shí)僅1h。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第24頁(yè)3、噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用食源性疾病病原檢測(cè)技術(shù)作為食品添加劑噬菌體展示技術(shù)檢測(cè)真菌毒素噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第25頁(yè)3.2作為食品添加劑美國(guó)食品和藥品管理局同意了一個(gè)由噬菌體病毒混合而成產(chǎn)品，主要用于殺滅肉制品中李氏桿菌。這是美國(guó)首次同意將病毒用作食品添加劑。美藥管局教授稱，該產(chǎn)品在制備過(guò)程中可能留有殘毒，但試驗(yàn)表明，這些微量殘毒不會(huì)引發(fā)任何健康問(wèn)題。該產(chǎn)品包含6種噬菌體病毒，可在熟肉片和香腸等包裝前噴灑在這些肉制品上，有效殺滅各種李氏桿菌，預(yù)防由這些細(xì)菌引發(fā)食物中毒。產(chǎn)品中所包含噬菌體只會(huì)攻擊李氏桿菌，對(duì)人體和植物細(xì)胞都不會(huì)產(chǎn)生影響。

噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第26頁(yè)3、噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用食源性疾病病原檢測(cè)技術(shù)作為食品添加劑噬菌體展示技術(shù)檢測(cè)真菌毒素噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第27頁(yè)3.3噬菌體展示技術(shù)檢測(cè)真菌毒素噬菌體展示技術(shù)(Phagedisplaytechnology)是20世紀(jì)80年代逐步建立并發(fā)展起來(lái)一項(xiàng)分子生物學(xué)新技術(shù)。它以噬菌體或噬粒為載體,使外源肽或蛋白基因與噬菌體表面特定蛋白基因在其表面進(jìn)行融合表示,進(jìn)而經(jīng)過(guò)親和富集法篩選表示有特異肽或蛋白質(zhì)噬菌體。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第28頁(yè)真菌毒素作為天然毒素廣泛存在于谷物等食品中，世界很多國(guó)家都有被污染匯報(bào)，因?yàn)檎婢舅貙儆诤哿课廴疚铮詸z測(cè)技術(shù)主要有各類色譜法和利用抗體免疫學(xué)方法。其中高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度和可靠性都很高缺點(diǎn)：樣品處理繁瑣，儀器昂貴，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中難以普及使用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)(ELISA)優(yōu)點(diǎn)：能夠同時(shí)大批量檢測(cè)樣品，攜帶方便，操作簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì),常以試劑盒形式出現(xiàn)且易商品化缺點(diǎn):當(dāng)前用于ELISA檢測(cè)試劑盒各類毒素單克隆抗體(McAb)主要起源于小鼠雜交瘤細(xì)胞，在篩選單克隆抗體生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞株系上，需要做雜交融合，亞克隆篩選，是一個(gè)長(zhǎng)久復(fù)雜過(guò)程，既花費(fèi)財(cái)力、物力，又浪費(fèi)時(shí)間，且檢測(cè)所用真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第29頁(yè)利用噬菌體展示技術(shù)制備抗體、模擬抗原表位，不但繞過(guò)了細(xì)胞融合，而且能夠以單克隆抗體（McAb）或單鏈抗體（ScFv）為靶分子篩選真菌毒素模擬抗原表位，代替真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，建立無(wú)毒ELISA檢測(cè)方法，確保試驗(yàn)操作人員和相關(guān)研究人員人身安全。熊嘯（年）等選取抗黃曲霉毒素M1（anti-AFM1,AflatoxinM1,AFM1）單克隆抗體為篩選配基，從噬菌體表面展示隨機(jī)7肽庫(kù)中篩選出AFM1抗原模擬表位LTSFPRH和MAPSSWR，為研制出安全無(wú)毒ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第30頁(yè)4、前景及展望噬菌體檢測(cè)技術(shù)含