3.2.2基因工程的基本操作程序高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修二

3.2

基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第一步第二步第三步第四步目的基因的檢測(cè)與鑒定閱讀課本P81-82，找出目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法，各個(gè)方法的原理以及各自適用于什么生物？有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。P80旁欄思考：將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便么？如果這樣做，效果會(huì)怎樣？這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣也無(wú)法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）花粉管通道法（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪▽?dǎo)入外源DNA三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。②特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法③過(guò)程：兩次拼接和兩次導(dǎo)入拼接1拼接2導(dǎo)入1導(dǎo)入2④具體轉(zhuǎn)化方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株。b.可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關(guān)系？T-DNA不是目的基因，但它將來(lái)會(huì)被整合到宿主細(xì)胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞并整合到宿主細(xì)胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進(jìn)入植物的一個(gè)體細(xì)胞，但基因工程最終要的是一個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，如何實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)？得到含有目的基因的植物細(xì)胞后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)問(wèn)題探討三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）導(dǎo)入方法：（2）受體細(xì)胞:顯微注射法受精卵原因：①體積大，易操作；

②易表現(xiàn)出全能性。（3）過(guò)程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物知識(shí)拓展--病毒介導(dǎo)法（主要用于導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞）科學(xué)家也用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)。如用腺病毒載體，搭載新冠病毒S基因，進(jìn)入人體內(nèi)，使人體產(chǎn)生對(duì)S蛋白的免疫記憶。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）常用方法：Ca2+處理原核細(xì)胞（常選擇大腸桿菌）可使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（3）過(guò)程：（目的？）（2）受體細(xì)胞：（優(yōu)點(diǎn)？）繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，易于培養(yǎng)。Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收重組DNA增加細(xì)胞壁的通透性一般利用溫度變化導(dǎo)入將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法總結(jié)細(xì)胞種類(lèi)植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射Ca2＋處理法(CaCl2)受體細(xì)胞受精卵或體細(xì)胞受精卵常用原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中→表達(dá)目的基因表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2+處理細(xì)胞→能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細(xì)胞→重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中四、目的基因的檢測(cè)與鑒定

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)檢測(cè)與鑒定才能知道。1.檢測(cè)與鑒定的方法分子水平的檢測(cè)個(gè)體水平的鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定（1）分子水平的檢測(cè)①電泳檢測(cè)法方法2：可以以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后再進(jìn)行電泳檢測(cè)。設(shè)計(jì)PCR的一對(duì)引物時(shí)，最好一個(gè)引物與質(zhì)粒DNA互補(bǔ)結(jié)合，另一個(gè)引物與目的基因DNA互補(bǔ)結(jié)合，這樣只有以重組DNA為模板才能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物（也可以都跟目的基因互補(bǔ)結(jié)合，這樣只有含有目的基因，才能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物），之后再進(jìn)行電泳檢測(cè)；方法1：體細(xì)胞中的質(zhì)粒直接進(jìn)行電泳檢測(cè)或者選擇合適的限制酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切后再進(jìn)行電泳檢測(cè)，同時(shí)可借助指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)目的基因。方法3：提取受體細(xì)胞的mRNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，用上述方法2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后再進(jìn)行電泳檢測(cè)；重組質(zhì)粒四、目的基因的檢測(cè)與鑒定（1）分子水平的檢測(cè)②核酸雜交檢測(cè)法a.將轉(zhuǎn)化的菌落影印在濾膜上；b.通過(guò)溶菌和核酸變性處理，使核酸暴露并與濾膜原位結(jié)合;c.用相應(yīng)的帶有標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交,經(jīng)放射自顯影，就可以鑒別出目的基因;d.最后從原來(lái)的培養(yǎng)基上選出相應(yīng)的菌落。a.提取受體細(xì)胞的DNA進(jìn)行酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；b.對(duì)分離后定位在凝膠上的DNA進(jìn)行處理，并將凝膠中變性的DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上固定；c.用相應(yīng)的帶有標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影，就可以鑒別出目的基因。菌落原位雜交法DNA印染法四、目的基因的檢測(cè)與鑒定（1）分子水平的檢測(cè)②核酸雜交檢測(cè)法（原理）

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交（遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則），若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功或轉(zhuǎn)錄出mRNA。四、目的基因的檢測(cè)與鑒定（1）分子水平的檢測(cè)③抗原-抗體雜交技術(shù)在抗原-抗體雜交中，目的蛋白是作為抗原還是抗體？

從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質(zhì)?？乖K云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交脫分化四、目的基因的檢測(cè)與鑒定（2）個(gè)體水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)方法觀察目標(biāo)抗蟲(chóng)植物害蟲(chóng)吞食害蟲(chóng)是否死亡抗病植物病毒(菌)感染是否出現(xiàn)病斑抗鹽植物鹽水澆灌是否正常生長(zhǎng)抗除草劑植物噴灑除草劑是否正常生長(zhǎng)獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物提取細(xì)胞產(chǎn)物，與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較細(xì)胞產(chǎn)物的功能活性是否正常（1）原核生物基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子：RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)終止子：終止轉(zhuǎn)錄基因的結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成非編碼區(qū)組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)（2）真核生物基因1.若無(wú)法獲得該蛋白，原因可能是什么？2.以上情況如何解決？3.若可以獲得該蛋白，但是蛋白質(zhì)無(wú)活性，原因可能是？4.以上情況如何解決？真核生物的基因有內(nèi)含子，原核生物沒(méi)有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列的機(jī)制，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列不能被切除，因此無(wú)法表達(dá)出該蛋白使用cDNA作為目的基因或使用酵母菌等真核生物作為受體細(xì)胞原核生物缺少高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，無(wú)法對(duì)真核生物的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的加工人工體外再加工或使用酵母菌等真核生物作為受體細(xì)胞思考當(dāng)真核生物的基因以原核生物作為受體細(xì)胞時(shí)：1.研究人員將一種海魚(yú)的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（

）（2）構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。（

）（3）只要檢測(cè)出番茄細(xì)胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功。（

）√××練習(xí)與應(yīng)用(P83)2.利用PCR既可以快速擴(kuò)增特定基因，也可以檢測(cè)基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述

錯(cuò)誤的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過(guò)程中雙鏈DNA的解開(kāi)不需要解旋酶C.復(fù)性過(guò)程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則D.延伸過(guò)程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸D一、概念檢測(cè)研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒(méi)有卡那霉素抗性的植株。請(qǐng)查找相關(guān)資料，嘗試對(duì)這個(gè)問(wèn)題作出解釋。二、拓展應(yīng)用外源基因插入基因