如何養(yǎng)好懸浮細胞

最近有很多小伙伴向小尚訴苦：“懸浮細胞太難養(yǎng)了，操作不方便，總感覺長得很慢！”其實呀，只要掌握訣竅，懸浮細胞也可以輕松培養(yǎng)。小尚多年培養(yǎng)80余種懸浮細胞，精心總結了這份懸浮細胞培養(yǎng)指南，相信肯定能幫到你。1.選擇合適的容器培養(yǎng)懸浮生長的細胞，需要選擇合適的容器，就像選擇一個合適的家一樣。但家并不是越大越好，對于初期擴增培養(yǎng)，較小的容器往往具有更好的培養(yǎng)效果，如T25培養(yǎng)瓶、10cm培養(yǎng)皿。等到細胞數量足夠多時，再轉移至更大的容器中進行培養(yǎng)。2.密切關注細胞的密度懸浮細胞有著較顯著的密度依賴性，密度越低細胞生長速度越慢，有些較難養(yǎng)的懸浮細胞在低密度時可能會死亡。因此接種密度不可過低，30-50萬細胞/ml為宜。當然密度也不是越高越好，一般來說，密度達到80萬細胞/ml就可以傳代了，最好不超過100萬。綜上，推薦培養(yǎng)時密度控制在30-100萬細胞/ml。Q：沒有計數板或計數儀怎么估算懸浮細胞的密度？A：對于單個分散生長的細胞，將細胞置于顯微鏡下靜置10min，等待細胞沉底，隨后用4x或10x倍鏡觀察，若細胞幾乎鋪滿整個視野，密度一般已經達到80-100萬細胞/ml（圖1）圖1.THP-1細胞（10x物鏡）A：對于聚團生長的細胞，難以估算細胞數量，主要看團塊數量和大小。若10x倍物鏡下觀察每個視野都有較多、較大的細胞團，可以進行傳代。（圖2）圖2.NK92MI細胞（10x物鏡）3.穩(wěn)定的環(huán)境懸浮細胞喜歡安穩(wěn)的生活環(huán)境，不喜歡經常被打擾。若是頻繁的將細胞拿出觀察，造成溫度、CO2濃度、濕度、培養(yǎng)基酸堿度的波動，細胞進入生長對數期需要的時間就會變長，生長速度減慢。建議一天觀察一次為宜，對于難養(yǎng)的懸浮細胞，可以兩天觀察一次。4.懸浮細胞害怕機械損傷懸浮細胞對吹打造成和離心帶來的機械損傷比較敏感，當細胞生長很慢或者狀態(tài)不好的時候，應該盡量避免離心和吹打，換液和傳代都可采用不離心的方法（圖3-4）。圖3.半換液示意圖圖4.傳代示意圖5.細胞聚團是正常的嗎？不同情況而定。有些懸浮細胞天生就是聚團生長的，如NK92MI等（圖2）。而單個分散生長的懸浮細胞偶爾也會出現一些十幾個細胞聚集成的小團（圖5），這也是正?，F象，不必把團塊吹開（除非實驗需要）。圖5.偶有小聚團是正?，F象然而本該單個分散生長的細胞出現大量的巨大團塊就要引起注意了，這可能是細胞不適應環(huán)境或者受到損傷的表現。需檢查培養(yǎng)基配方是否正確，使用的血清是否合適，是否因為吹打、離心等過程中細胞受到了機械損傷。Q：異常大量聚團的細胞就只能丟棄嗎？A：建議不要立刻丟棄。可將細胞離心收集起來，用新鮮培養(yǎng)基重懸吹散細胞，用臺盼藍染色法確認細胞活性。若活細胞較多，可以繼續(xù)培養(yǎng)，同時嘗試優(yōu)化培養(yǎng)條件（如更換血清品牌、減少吹打離心頻率等）改善細胞聚團問題。6.懸浮細胞出現貼壁怎么處理？懸浮細胞在培養(yǎng)時出現少量貼壁是正?，F象，無需特殊處理。在同一器皿中靜置培養(yǎng)時間越久，出現貼壁的細胞可能就越多，可試著用手掌輕拍瓶身側面（勿用力敲打），將松散貼壁的細胞拍起來。如果出現少量貼壁非常緊并且出現上皮樣形態(tài)的細胞，這可能和培養(yǎng)器皿材質或細胞特性有關?？蓪腋〖毎D移至新瓶中培養(yǎng)，舍棄異常貼壁的細胞。如果出現大量貼壁，懸浮生長的細胞也狀態(tài)不佳，則需要檢查培養(yǎng)基成分是否有誤，或者存在污染等異常情況。7.細胞碎片怎么處理？在培養(yǎng)過程中，常常會有少量細胞死亡從而產生碎片，然而懸浮細胞并不能像貼壁細胞那樣通過換液就將碎片清干凈。通常，為了保持細胞生長環(huán)境穩(wěn)定，不會對少量的細胞碎片進行特殊處理，少量碎片的存在也不影響細胞生長。隨著培養(yǎng)，細胞數量越來越多，碎片也可能逐漸減少（碎片自己降解或被細胞吸收）。當碎片特別多時，待到細胞密度較大時，可以進行低速離心（800-900rpm，3min）去除部分碎片。低速離心將損失一些細胞，因此不要在細胞數量較少時使用這種方式去除碎片。8.細胞形態(tài)不圓潤不均勻是正常的嗎？懸浮細胞不一定都是規(guī)則圓形的細胞，需結合生長速度和細胞整體狀態(tài)來確定細胞狀態(tài)。有些種類的懸浮細胞本身形態(tài)不均一；而有些細胞在受到較為劇烈的環(huán)境變化后（比如長途運輸）形態(tài)可能發(fā)生輕微改變。若細胞邊緣平滑發(fā)