動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第1頁表1動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物

疫苗人小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、風(fēng)疹疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗等

動物牛病毒性腹瀉疫苗、牛痢疾疫苗、犬傳染性肝炎疫苗、雞痘病疫苗、豬霍亂疫苗、牛疫狂犬疫苗、草魚出血熱疫苗單克隆抗體IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)整劑β-細(xì)胞生長因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、血清胸腺因子、白細(xì)胞介素、胸腺素、巨噬細(xì)胞毒力因子等酶尿激酶、天門冬氨酰胺酶、膠原酶、細(xì)胞色素P、450、纖維蛋白溶酶原激活劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脫羥酶等激素絨膜促性腺激素、促紅細(xì)胞生成素、促濾泡激素、生長激素、促間質(zhì)細(xì)胞激素、促黃體激素等動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第2頁表2微生物和動物細(xì)胞培養(yǎng)方法比較微生物細(xì)胞動物細(xì)胞PH控制添加酸、堿CO2-HCO3緩沖液攪拌速度速度快、范圍廣較慢溶氧控制改變攪拌速度、通氣量、進(jìn)氣氧濃度改變進(jìn)入氣體氧濃度培養(yǎng)基滅菌方法高溫蒸煮過濾培養(yǎng)時間幾小時—幾天幾天—3、4周對水純度要求較低很高

與微生物細(xì)胞培養(yǎng)類似，動物細(xì)胞體外培養(yǎng)有兩種類型：一類是非貼壁依賴性細(xì)胞，這類細(xì)胞能夠采取與微生物培養(yǎng)類似方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；另一類是貼壁依賴性細(xì)胞，它們需要附著于帶適量電荷固體或半固體表面上生長。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第3頁5、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝

大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程如圖11-15所表示。工藝過程中，先將組織切成碎片，然后用溶解蛋白質(zhì)酶處理而得到單個細(xì)胞，再用離心法搜集細(xì)胞。將細(xì)胞植入營養(yǎng)培養(yǎng)基，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中增殖到覆蓋瓶壁表面，用酶把細(xì)胞從瓶壁上消化下來，再接種到若干培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)充培養(yǎng)，將培養(yǎng)所得細(xì)胞“種子”冷藏于液氮中，從液氮中取出一個別細(xì)胞“種子”進(jìn)行解凍、復(fù)活培養(yǎng)，進(jìn)行擴(kuò)充培養(yǎng)以取得足夠細(xì)胞量，將細(xì)胞接種于大規(guī)模生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，按照產(chǎn)物不一樣形式進(jìn)行產(chǎn)物分離純化。對于積累在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，可經(jīng)過搜集細(xì)胞后進(jìn)行破胞，再經(jīng)過分離純化取得產(chǎn)物；對于由細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中產(chǎn)物，能夠經(jīng)過濃縮、純化培養(yǎng)液來取得產(chǎn)品；而對于那些必須加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行培養(yǎng)或病毒感染培養(yǎng)才能得到產(chǎn)物細(xì)胞，可加入上述誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)或病毒感染后，搜集細(xì)胞，再經(jīng)分離純化得到產(chǎn)物。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第4頁圖11-15大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程圖細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器提取細(xì)胞誘生劑細(xì)胞產(chǎn)品（腫瘤抗原）純化產(chǎn)品（干擾素）純化提取產(chǎn)品（單克隆抗體）濃縮純化79865432110動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第5頁內(nèi)容（一）單克隆抗體

哺乳動物細(xì)胞中有一套復(fù)雜防御系統(tǒng)保護(hù)自己不受有毒物質(zhì)和病原物侵害，其中一個別防御反應(yīng)就是淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異蛋白，這些蛋白能夠在其它免疫系統(tǒng)蛋白幫助下與外來物質(zhì)結(jié)合，并抵消其生物學(xué)功效。這些特異蛋白，就是抗體；相對于抗體，誘發(fā)產(chǎn)生抗體外來物質(zhì)即稱為抗原?？贵w最早是由德國微生物學(xué)家貝林發(fā)覺，它們存在于人和脊椎動物血清之中，是這些生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)主要組成成份。因為抗體分子含有極其準(zhǔn)確結(jié)合特異性，能夠識別各種不一樣抗原，還能夠激活細(xì)胞其它防衛(wèi)系統(tǒng)以毀滅抗原，所以抗體在基礎(chǔ)研究和臨床診療中取得了廣泛重視和應(yīng)用。伴隨雜交瘤技術(shù)、蛋白質(zhì)工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等技術(shù)發(fā)展，抗體已逐步在疾病治療等應(yīng)用領(lǐng)域顯示出越來越遼闊應(yīng)用前景。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第6頁抗體

由B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，它能識別抗原某一特定位點。抗體分子由兩個完全相同重鏈分子以及兩個完全相同輕鏈分子組成。存在于人或哺乳動物血清之中?？乖?/p>

指誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體物質(zhì)。

如前所述，抗體分子是免疫系統(tǒng)反應(yīng)一個主要組分，因為抗體分子能夠識別各種不一樣外來抗原，同時可激活宿主防衛(wèi)系統(tǒng)。對于一個免疫刺激（有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原），每一個淋巴細(xì)胞都會合成并分泌一個單個抗體，這些抗體能夠高度特異地識別免疫抗原特定區(qū)域，也就是抗原決定簇。因為一個抗原通常都有幾個不一樣抗原決定簇，所以每個免疫淋巴細(xì)胞都可能產(chǎn)生一個針對某一個抗原決定簇抗體，這些由同一抗原而產(chǎn)生不一樣抗體統(tǒng)稱為多克隆抗體。有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原侵入抗體2抗體1動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第7頁

于是，大家認(rèn)識到要把抗體應(yīng)用于臨床診療或是治療，必須要制備單一類型只對某一特定抗原決定簇抗體分子，也就是單克隆抗體。多克隆抗體

在一個血清樣品中包含了對同一抗原分子上不一樣抗原決定簇各種抗體。單克隆抗體

由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生針對某一特定抗原決定簇單一類型抗體。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第8頁補(bǔ)充

要依據(jù)糖基化結(jié)構(gòu)，選擇適宜細(xì)胞系糖代謝特點，氨基酸代謝特點，選擇適宜細(xì)胞系。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第9頁細(xì)胞系FucGal唾液酸α1,6α1,3Fucα1,3GalSO4-GalNAcα2,3

α2,6糖基化等分GluNAcBHK++0+0++0-0CHO++-00++0+0鼠雜交瘤++0++0++0+++0C127++0+++++++++++0J558L++0++-+++++++0人淋巴細(xì)胞++000++0++人垂體++00+++++0++Namalwa++000++++--人鼠雜交瘤++000+++0動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第10頁動物細(xì)胞制藥表示系統(tǒng)與特征

昆蟲系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)，最成功、主要表示活性外源蛋白有效系統(tǒng)，應(yīng)用于藥品蛋白質(zhì)表示。

一、哺乳動物細(xì)胞表示系統(tǒng)與特征1.動物細(xì)胞特征細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，沒有細(xì)胞壁。亞細(xì)胞器，功效獨特。內(nèi)容（二）動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第11頁2．哺乳動物細(xì)胞株系CHO細(xì)胞：中國倉鼠卵巢中分離上皮樣細(xì)胞系，貼壁型生長，是當(dāng)前使用最為普遍和成熟表示糖基化蛋白藥品宿主細(xì)胞。核型為亞二倍體，分泌表示外源蛋白，而內(nèi)源蛋白分泌極少。貼壁型生長細(xì)胞，但可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高忍受能力。蛋白質(zhì)翻譯后修飾準(zhǔn)確，表示產(chǎn)物結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物活性靠近天然。有各種衍生突變株應(yīng)用于藥品生產(chǎn)，培養(yǎng)時需要添加脯氨酸。二氫葉酸還原酶缺點株表示藥品有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ，已上市。使用氨甲酰喋呤，增加外源基因拷貝數(shù)，提升蛋白質(zhì)表示水平。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第12頁BHK－21：幼倉鼠腎臟中分離成纖維樣細(xì)胞，非整倍體。用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。BHK-21表示重組凝血因子Ⅷ已被獲準(zhǔn)上市。C127：從小鼠乳腺腫瘤中分離取得上皮樣細(xì)胞，貼壁型生長。C127細(xì)胞系已表示各種外源基因，其中EPO水平達(dá)10mg/L，生產(chǎn)rhGH已被同意上市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培養(yǎng)物中分離建立連續(xù)細(xì)胞系，能大量表示外源蛋白，廣泛用于藥品毒理學(xué)研究。骨髓瘤細(xì)胞：J558L是小鼠BALB/c骨髓瘤細(xì)胞，分泌IgA，用于轉(zhuǎn)染研究。NSO和SP2/O－Ag14不分泌Ig，與淋巴細(xì)胞融合篩選雜交瘤，分泌制備特異性抗體。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第13頁雜交瘤細(xì)胞：從小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞中分離取得雜交瘤細(xì)胞系，能在無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長，輕易轉(zhuǎn)染和生長，能進(jìn)行糖基化等加工修飾，大量分泌和高效表示。很多雜交瘤細(xì)胞系用于抗體制備。Vero：從成年非洲綠猴腎中分離取得貼壁型成纖維細(xì)胞，多倍體核型，能適應(yīng)灌流操作，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。已經(jīng)有突變細(xì)胞系能用無血清培養(yǎng)。最為常見VeroE6增殖各種病毒，如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)病毒性疫苗，已被同意用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，用于表示外源基因蛋白質(zhì)藥品和病毒檢測。COS：是從SV40DNA轉(zhuǎn)化非洲綠猴腎細(xì)胞CV1中分離得到，廣泛用于外源基因瞬時表示研究。GH3用于生長激素研究，293細(xì)胞系用于基因治療研究。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第14頁3．昆蟲細(xì)胞株系Sf21：從秋粘蟲卵巢細(xì)胞中分離得到，細(xì)胞較大，輕易放大，高效表示外源基因。Sf9：從秋粘蟲卵巢細(xì)胞（SF21）中分離得到，是最常見昆蟲表示細(xì)胞。對桿狀病毒高度敏感，生長快，能高效表示外源基因。抗機(jī)械剪切，能在無血清培養(yǎng)基攪拌反應(yīng)器中生長。TN-5B1-4：從粉紋夜蛾卵細(xì)胞勻漿中分離得到，無血清培養(yǎng)，快速倍增。分泌表示重組蛋白能力比Sf9細(xì)胞系高20多倍，能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第15頁三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染（是將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞技術(shù)通用名稱?；?qū)胝婧思?xì)胞方法很多，主要有化學(xué)轉(zhuǎn)染、物理轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。方法表示類型毒性細(xì)胞類型特點基因槍瞬時，穩(wěn)定無各種細(xì)胞組織，器官有效，儀器操作顯微注射瞬時，穩(wěn)定無各種細(xì)胞有效，技術(shù)難度大電穿孔瞬時，穩(wěn)定無各種細(xì)胞有效，儀器操作沖擊波瞬時，穩(wěn)定無各種細(xì)胞，局部組織簡單有效，儀器操作動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第16頁方法表示類型毒性細(xì)胞類型特點逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時，穩(wěn)定無對應(yīng)宿主細(xì)胞有效原生質(zhì)體融合瞬時，穩(wěn)定無懸浮細(xì)胞技術(shù)復(fù)雜生物轉(zhuǎn)染特點動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第17頁化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常見轉(zhuǎn)染方法。其基礎(chǔ)原理是磷酸鈣、二乙氨乙基（DEAE）－葡聚糖（dextran）和陽離子樹脂與核酸形成復(fù)合物，附著于細(xì)胞表面，經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。磷酸鈣與DNA形成不溶性沉淀，帶正電荷DEAE－葡聚糖與帶負(fù)電荷DNA磷酸基團(tuán)結(jié)合，陽離子樹脂包裹DNA形成脂質(zhì)體。滲透性休克和DMSO等化學(xué)試劑能促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑盒商業(yè)化供給，尤其是脂質(zhì)體材料轉(zhuǎn)染試劑。影響原因：細(xì)胞培養(yǎng)物密度、DNA大小、純度與用量、化學(xué)試劑用量與處理時間、促進(jìn)劑使用等。動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第18頁方法表示類型毒性細(xì)胞類型特點磷酸鈣瞬時、穩(wěn)定無貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞簡單DEAE-葡聚糖瞬時有CV1，COS簡單陽離子樹脂瞬時、穩(wěn)定有或無貼壁、原代懸浮細(xì)胞簡單，有效化學(xué)轉(zhuǎn)染特點動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第19頁四、轉(zhuǎn)染體篩選與分離轉(zhuǎn)染后1～6天收獲細(xì)胞，進(jìn)行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交，檢測外源基因瞬時表示。為了取得穩(wěn)定整合細(xì)胞系，先在非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48小時，讓細(xì)胞倍增1～2代，使轉(zhuǎn)染DNA表示。再按1：15百分比轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上，每2～4天更換培養(yǎng)基，連續(xù)2～3周，促進(jìn)抗性細(xì)胞生長，去除死細(xì)胞殘骸，最終得到獨立克隆。在轉(zhuǎn)染中大約有萬分之一細(xì)胞將穩(wěn)定整合外源基因，所以需要顯性選擇標(biāo)識來分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞選擇標(biāo)識，使用與之相對應(yīng)選擇劑。

動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第20頁選擇劑基因使用濃度氨甲喋呤dhfr－0.01～300μmol/L氨喋呤tk＋0.4μmol/L5-溴脫氧尿苷tk－30μg/mlG418,Zeocinneo100～800μg/ml潮霉素Bhyg10～400μg/ml殺瘟稻菌素bsd2～10μg/ml霉酚酸gpt25μg/ml嘌呤霉素乙?；D(zhuǎn)移酶0.5～10μg/mlXyl-Aada