中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座

內(nèi)容一、中藥指紋圖譜技術(shù)概述二、中藥指紋圖譜研究指導標準三、指紋圖譜研究相同度計算四、中藥指紋圖譜研究方法與思緒五、中藥指紋圖譜研究示例演示（試驗）中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第1頁一、中藥指紋圖譜技術(shù)概述中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第2頁（一）中藥指紋圖譜與中藥質(zhì)量（二）中藥指紋圖譜研究方法學（三）中藥指紋圖譜技術(shù)發(fā)展中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第3頁指紋圖譜穩(wěn)定性可控性安全性有效性1.中藥指紋圖譜與中藥安全、有效、穩(wěn)定關(guān)系（一）中藥指紋圖譜與中藥質(zhì)量中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第4頁2.國內(nèi)中藥質(zhì)量評價現(xiàn)實狀況植物學方法： 原植物判定，顯微判定等植物化學方法： 理化判定分析化學方法： 儀器分析，色譜分析等藥理學方法： 生物判定法，生物等效等分子生物學方法: DNA指紋判定中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第5頁3.國外植物藥質(zhì)量評價概況標準制劑： 銀杏人參西洋參五味子 甘草黃芪貫葉連翹 定量測定結(jié)合主成份百分比固定產(chǎn)地以生產(chǎn)質(zhì)量恒定制劑各種分析伎倆和方法包含藥材、中間體等指紋圖譜中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第6頁4.中藥指紋圖譜意義

是全方面反應中藥所含內(nèi)在化學成份種類與數(shù)量，進而反應中藥質(zhì)量，尤其在現(xiàn)階段中藥有效成份絕大多數(shù)沒有明確，采取中藥指紋圖譜方式，將有效地表征中藥質(zhì)量和穩(wěn)定性有利于中藥及其產(chǎn)品進入國際市場中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第7頁5.中藥指紋圖譜建立標準

系統(tǒng)性：指紋圖譜所反應化學成份，應包含中藥有效部位所含大部成份種類，或指標成份全部特征性：指紋圖譜中反應化學成份信息（詳細表現(xiàn)為保留時間或位移值）是含有高度選擇性，是這些信息綜合結(jié)果穩(wěn)定性：指紋圖譜在要求方法與條件下應能作出相對一致指紋圖譜

色譜特征穩(wěn)定性：特征峰 特征區(qū) 特征參數(shù)色譜條件穩(wěn)定性：不一樣儀器驗證 不一樣試驗室驗證不一樣操作者驗證中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第8頁☆品種判別--真?zhèn)巍罨磁袆e--產(chǎn)地☆藥用部位判別--根、莖、葉、花、果☆提取工藝☆藥材炮制☆限量成份控制☆一致性--不一樣批次產(chǎn)品.6.指紋圖譜研究目標中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第9頁

品種多、產(chǎn)地多;采收、加工不一致

－化學組分與含量不一樣 （產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)劣不一樣）有效組分種類繁多、含量相對少；非有效組分成分復雜、含量高 －分析檢測困難 （質(zhì)量控制指標不統(tǒng)一）基礎(chǔ)研究微弱藥材GAP建設(shè)滯后7.建立中藥指紋譜所面臨問題中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第10頁8.對策加強GAP藥材種植基地建設(shè)加強中藥種植與加工、炮制規(guī)范化加強中藥化學成份基礎(chǔ)研究應用當代分析技術(shù)伎倆進行中藥指紋圖譜研究中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第11頁儀器設(shè)備技術(shù)人員研究經(jīng)驗系統(tǒng)性問題穩(wěn)定性問題特征性問題9.中藥指紋譜研究過程中面臨問題中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第12頁色譜法

1.液相色譜法（LC） 2.氣相色譜法（GC） 3.薄層掃描法（TLC） 4.毛細管電泳法（CE）其它

1.質(zhì)譜法（MS）及色譜與質(zhì)譜聯(lián)用 2.X-衍射法 3.近紅外法（NIR）等（二）中藥指紋圖譜研究方法學中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第13頁（三）中藥指紋圖譜技術(shù)發(fā)展應用范圍儀器設(shè)備與軟件指紋圖譜標準中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第14頁二、中藥指紋圖譜研究指導標準中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第15頁（一）目標和要求（二）中藥指紋圖譜標準起草說明（三）中藥指紋圖譜標準建立中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第16頁中藥質(zhì)量研究和質(zhì)量標準一個主要內(nèi)容加強中藥質(zhì)量管理、提升中藥質(zhì)量、確保藥品安全、有效、穩(wěn)定、可控固定原料藥（中藥材）品種、產(chǎn)地和采收季節(jié)前提下，需制訂原料藥(中藥材)和注射劑指紋圖譜（一）目標和要求中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第17頁（二）中藥指紋圖譜標準起草說明1.名稱、漢語拼音2.起源（產(chǎn)地、采收期、炮制）按中藥命名標準制訂藥材：產(chǎn)地、采收期、炮制中間體：提取工藝或提取物起源中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第18頁3.供試品溶液制備

有效成份(專屬性成份、指標性成份)理化性投質(zhì)并結(jié)合檢測方法要求提取工藝參考物溶液制備 對照品內(nèi)標物標準提取物

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第19頁中藥指紋圖譜檢測方法驗證（1）檢測方法測定方法、儀器、試劑、測定條件（2）驗證專屬性（空白試驗）精密度試驗（RSD<3%） 重復性與重現(xiàn)性試驗（S<0.95）穩(wěn)定性試驗（S<0.95）系統(tǒng)適應性試驗6.指紋圖譜相關(guān)性中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第20頁（三）中藥指紋圖譜標準建立中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第21頁注意事項

（1）全部成份應在2小時左右洗脫，并提供2小時指紋圖譜（2）可建立各個組分指紋圖譜（3）可建立各種方法指紋圖譜（4）可選擇經(jīng)典樣品指紋圖譜，或標準提取物指紋圖譜，或含有代表性勾兌樣品指紋圖譜作為標準指紋圖譜中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第22頁2.指紋圖譜標準建立

（1）藥材、中間體指紋圖譜標準為企業(yè)內(nèi)控標準，列入起草說明（2）10批供試品（3）標準要求：供試品指紋圖譜與對照提取物（標準提取物指紋圖譜一致；或供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜（標準圖譜）一致；或經(jīng)過對各特征峰位置（相對保留時間、比移值等）、豐度（積分面積或峰高）及相對豐度、光譜特征（顏色）等綜合參數(shù)描述給予確定。中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第23頁指紋圖譜標準書寫格式液相色譜法【指紋圖譜】照高效液色譜法（中國藥典一部附錄VID），結(jié)合指紋圖譜要求測定。色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗如以對照品做系統(tǒng)適用性試驗，則參考中國藥典書寫格式。如以隨行對照提取物做系統(tǒng)適用性試驗，則只書寫所用儀器、色譜柱型號及相關(guān)參數(shù)和各項詳細試驗條件。對照品溶液制備如有對照品則照中國藥典書寫格式。供試品溶液制備精密吸收供試品溶液、對照品溶液（或?qū)φ沼锰崛∥锶芤海└鱔Xml，分別流入液相色譜儀，測定。本品指紋圖譜主要特征供試品指紋圖譜與質(zhì)量標準所附對照指紋圖譜（或隨行對照提取物指紋圖譜）經(jīng)計算軟件計算，相同度大于XX，符合要求（或相同度小于XX，不符合要求）。中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第24頁三、指紋圖譜研究相同度計算中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第25頁（一）、指紋圖譜相同度評價標準與方法（二）、指紋圖譜相同度計算原理（三）、指紋圖譜相同度評價軟件中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第26頁（一）、指紋圖譜相同度評價標準與方法標準：整體性、含糊性、特征性方法：直接觀察、計算機輔助相同性計算中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第27頁1.引用參數(shù)2.數(shù)據(jù)獲取路徑3.相同度算法（二）、指紋圖譜相同度計算原理中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第28頁1.引用參數(shù)①保留時間(RT)②峰高(Height)③峰面積(Area)④峰面積百分比（Area%）⑤相對保留時間（RatioofRetentionTime,RRt）⑥積分相對比值（RatioofArea,RA）中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第29頁2.數(shù)據(jù)獲取途徑（1）圖形/圖像轉(zhuǎn)化成ASCII數(shù)據(jù)（2）截片數(shù)據(jù)（3）色譜數(shù)據(jù)

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第30頁3.相似度算法

夾角余弦算法 相關(guān)系數(shù)算法優(yōu)化算法中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第31頁1.軟件開發(fā)標準2.市售/慣用軟件介紹3.相同度軟件使用過程中應注意問題（三）、指紋圖譜相同度評價軟件中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第32頁1.軟件開發(fā)原則系統(tǒng)獨立性

(2)計算方法科學性

(3)數(shù)據(jù)接口通用性

(4)操作過程及應用實用性中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第33頁2.市售/慣用軟件介紹浙江大學陳一宇教授中南大學梁逸增教授沈陽藥科大學畢開順教授西北大學李華教授二軍大Waters中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第34頁3.相同度軟件使用過程中應注意問題數(shù)據(jù)接口與數(shù)據(jù)類型數(shù)據(jù)校正算法選擇中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第35頁四、中藥指紋圖譜研究方法與思緒中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第36頁（一）、研究方案設(shè)計（二）、樣品選擇與搜集（三）、供試品制備（四）、指紋圖譜色譜條件研究思緒（五）、相同度值研究與指紋特征中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第37頁（一）、研究方案設(shè)計資料搜集與整理

文件、工藝資料、質(zhì)量標準方案設(shè)計

（1）研究對象-有效成份（2）研究方法選擇-色譜法(HPLCGCTLC)及其它方法（3）研究內(nèi)容-依據(jù)技術(shù)要求要求：包含“名稱、起源、制備、檢測方法、標準要求及起草說明”中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第38頁（二）、樣品選擇與搜集要求： 10個批次道地藥材與GAP基地藥材經(jīng)典性與代表性離散樣品剔除中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第39頁（三）、供試品制備依據(jù)：有效組分物理化學性質(zhì)生產(chǎn)或提取工藝檢測方法需要中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第40頁（四）、指紋圖譜色譜條件研究思緒高效液相色譜法HPLC氣相色譜法GC中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第41頁（1）檢測波長選擇（簡）（2）柱溫選擇（略）（3）進樣量（簡）（4）色譜柱選擇（重點）（5）檢測成份選擇（重點）（6）流動相（梯度表）選擇（重點）1.高效液相色譜法HPLC中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第42頁示例：蜂膠(BeePropolis)（1）檢測波長選擇中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第43頁

=280nm

=360nm

=254nm

=210nm中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第44頁波長選擇：

=280nm中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第45頁（4）色譜柱選擇

選取市場上較常見填料所填充色譜柱，比如：Eka-NobelKromasiC18(5mm)，其分離效果好、性能穩(wěn)定，不論是國產(chǎn)填充Kromasi色譜柱，還是國外企業(yè)填充Kromasi色譜柱，在分離效果上基本相同。所以對于大多數(shù)中藥注射劑，可選取Kromasi色譜柱。如選取乙腈-緩沖溶液，應依據(jù)緩沖溶液特點，選取對應色譜柱：①如為酸性緩沖溶液，可選取ZorbaxSB-C18色譜柱（pH<2）；②如為堿性緩沖溶液，可選取EclipseXDB-C18色譜柱（pH>6）。示例：不一樣色譜柱對三七總皂苷分離效果中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第46頁Lichosorb中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第47頁Polaris中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第48頁Kromasil中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第49頁Diamonsil中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第50頁Carbosorb中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第51頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第52頁（5）檢測成份選擇（重點）示例：何首烏中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第53頁何首烏生品液相色譜圖（全局圖）中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第54頁何首烏生品液相色譜圖（局部放大圖）中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第55頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第56頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第57頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第58頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第59頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第60頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第61頁圖9上海制首烏指紋圖譜

北京良方藥業(yè)制首烏

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第62頁北京金象藥店制首烏

北京壽春堂藥店制首烏指紋圖譜

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第63頁（6）流動相（梯度表）選擇主要影響原因1.起始濃度2.梯度速率3.流速中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第64頁時間∕min水%（H+/OH-）*乙腈%*Ⅰ

01000552080600100Ⅱ

01000407030606040Ⅲ

08020406040605050Ⅳ

06040403070600100*為體積百分比（V/V）

指紋圖譜流動相梯度優(yōu)化*

為體積百分比（V/V）

梯度表中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第65頁初始色譜條件時間（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000600100時間（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000552080600100中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第66頁初始色譜條件設(shè)定依據(jù)及目標依據(jù)：化合物極性大小。如未知時，假設(shè)有效組分中包含各種極性成份。目標：快速確定主要或大部分化合物被洗脫時流動相組成，為優(yōu)化條件選擇提供依據(jù)。中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第67頁優(yōu)化條件選擇選擇依據(jù)：初始色譜圖、梯度洗脫表及一定經(jīng)驗示例：（1）淫羊藿總黃酮（40%）提取物 （2）鉤藤總生物堿 （3）黃連藥材 （4）知母總皂苷

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第68頁淫羊藿提取物在初始條件下色譜圖中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第69頁淫羊藿提取物第一次優(yōu)化后色譜圖中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第70頁梯度速率： 初始：100/60min=1.7/min 優(yōu)化：0~1.7中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第71頁CH3CN%CH3CN%MinMin初始條件中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第72頁CH3CN%Min三七人參西洋參CH3CN%Min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第73頁起始濃度：依據(jù)初始色譜圖中主要色譜峰被洗脫時流動相組成，對應降低~20%。流速：0.5~2.0ml/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第74頁2.氣相色譜法（1）影響色譜峰分離程度原因 色譜柱類型 載氣流速 起始柱溫 升溫速率

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第75頁（2）研究示例 樣品：廣藿香油指紋圖譜研究過程

方案設(shè)計中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第76頁檢測方法 （1）色譜方法 廣藿香油為廣藿香藥材經(jīng)水蒸汽蒸餾而得到揮發(fā)油，均為易揮發(fā)組分，擬采取氣相色譜法（GC）。 （2）儀器：

Agilent6890GC （3）色譜柱選擇 可供選擇色譜柱：極性 非極性 中等極性 （4）進樣方式確實定

手動自動頂空中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第77頁2.供試品溶液制備

取廣藿香油適量，加醋酸乙酯溶解，即得。 注：對于非極性毛細管色譜柱，如供試品溶液中含少許少，最好干燥后進樣。中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第78頁2.色譜條件探索（1）對梯度速率及流速進行微調(diào)-由粗到精

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第79頁初始條件流速： 3.0 ml/min進樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 30 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第80頁第一次優(yōu)化流速： 2.0 ml/min進樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 20 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第81頁第二次優(yōu)化流速： 1.0 ml/min進樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 10 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第82頁第三次優(yōu)化流速： 1.0 ml/min進樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 5 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第83頁第四次優(yōu)化流速： 0.5 ml/min進樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 5 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第84頁（2）選擇細化初始條件-由細到精中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第85頁初始條件流速： 1.0 ml/min進樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 1.0 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第86頁第一次優(yōu)化流速：