3.3通過細(xì)胞融合可產(chǎn)生具有新特性的細(xì)胞課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

甲型H1N1流感是一種急性呼吸道傳染病，流感本身跟普通感冒都屬于上呼吸道感染，二者的區(qū)別主要有兩點(diǎn)：一是流感患者往往會(huì)出現(xiàn)全身難受的癥狀，包括四肢酸疼、腰背酸疼以及頭疼等，這些癥狀會(huì)比普通感冒更重；二是一部分的流感病人還會(huì)出現(xiàn)胃腸道癥狀，比如嘔吐、腹瀉如何檢測(cè)是否感染甲型流感病毒？已知其病原體甲型H1N1流感病毒是一種RNA病毒，其表面有一種特征性蛋白質(zhì)A1、傳統(tǒng)抗體制備方法及缺陷特異性差（能識(shí)別多種抗原），純度低，靈敏度差抗原決定簇多種抗體不純篩選單一B細(xì)胞不能無(wú)限增殖產(chǎn)生大量抗體

抗原

動(dòng)物體內(nèi)

抗體刺激漿細(xì)胞多克隆抗體抗原決定簇病原體、抗原、抗原決定簇、抗體、B淋巴細(xì)胞的對(duì)應(yīng)關(guān)系？壽命有限①過程②缺陷一群識(shí)別不同抗原部位的抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞1975年英國(guó)科學(xué)家米爾斯坦和柯勒的實(shí)驗(yàn)【一個(gè)大膽的猜想】1975年，米爾斯坦和柯勒1984年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)既能產(chǎn)生特異性抗體，又能在正常培養(yǎng)條件下進(jìn)行無(wú)限增殖能產(chǎn)生特異性抗體能無(wú)限增殖每一種B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性繁殖，即克隆。就稱為單克隆抗體。由一個(gè)B淋巴細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群所產(chǎn)生的單一型抗體分子3.3通過細(xì)胞融合可產(chǎn)生具有新特性的細(xì)胞1.概念：2.范圍：在一些融合因子的作用下，將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞融合技術(shù)①基因型相同的細(xì)胞間②基因型不同的同種生物細(xì)胞間3.誘導(dǎo)方式？③親緣關(guān)系非常遠(yuǎn)的不同種生物細(xì)胞間資料1：1838年在腫瘤中觀察到了細(xì)胞融合后的多核細(xì)胞，并在此后，相繼于肺結(jié)核、天花膿包周圍、水痘損害的皮膚、麻疹患者的扁桃體等疾病患者的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。1973年觀察到天花病人血液中也有多核的血細(xì)胞存在肺結(jié)核病人病理切片1875年，科學(xué)家們首次觀察到了脊椎動(dòng)物（蛙）血液細(xì)胞的融合現(xiàn)象。1958年，日本科學(xué)家崗田用滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)人的腹水癌細(xì)胞融合成功。①物理法：電流刺激（電脈沖）、激光融合②化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)③生物法：滅活的病毒（動(dòng)物細(xì)胞融合特有）3.誘導(dǎo)方式一、兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可融合形成一個(gè)細(xì)胞滅活的病毒誘導(dǎo)機(jī)理什么是病毒的滅活？滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面↓細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通↓細(xì)胞膜連接↓細(xì)胞核融合，形成雜交細(xì)胞直流電脈沖誘導(dǎo)下極化，膜兩側(cè)產(chǎn)生電勢(shì)，正負(fù)電荷相吸↓膜變薄，觸發(fā)膜穿孔，細(xì)胞橋形成↓細(xì)胞質(zhì)滲透、細(xì)胞核融合電脈沖誘導(dǎo)誘導(dǎo)機(jī)理4.誘導(dǎo)機(jī)理/原理：細(xì)胞膜出現(xiàn)一定程度損傷，細(xì)胞相互粘連而融合。細(xì)胞膜的流動(dòng)性B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體能無(wú)限增殖小組任務(wù)：結(jié)合書本嘗試完善上圖“抗甲流病毒單克隆抗體制備方案”①原理：一個(gè)（或一種）漿細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體，小鼠的骨髓瘤細(xì)胞能夠無(wú)限增殖，因此，雜交瘤細(xì)胞就具備了既能無(wú)限增殖，又能產(chǎn)生大量單一抗體的特征。其產(chǎn)生的單一抗體即為單克隆抗體1、單克隆抗體的制備二、細(xì)胞融合技術(shù)是制備單克隆抗體的基礎(chǔ)給小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴細(xì)胞（免疫）骨髓瘤細(xì)胞雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞分離脾細(xì)胞誘導(dǎo)融合篩選B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤②制備過程1970年人工條件下的人-鼠細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)知識(shí)拓展：篩選獲得雜交瘤細(xì)胞知識(shí)拓展：篩選獲得雜交瘤細(xì)胞①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基蝶呤阻斷。②人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。討論：如何篩選出雜交瘤細(xì)胞并說(shuō)明篩選機(jī)理？B淋巴細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能無(wú)限增殖，死亡骨髓瘤細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能增殖，死亡雜交瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖，生長(zhǎng)原理：HGPRT-細(xì)胞株培養(yǎng)基加氨基蝶呤（HAT培養(yǎng)基）給小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴細(xì)胞（免疫）骨髓瘤細(xì)胞雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞分離脾細(xì)胞第二次篩選HAT選擇培養(yǎng)基克隆化培養(yǎng)，專一抗體檢驗(yàn)誘導(dǎo)融合篩選Q1：此時(shí)篩選出來(lái)的雜交瘤細(xì)胞一定是我們需要的么？①基因相互抑制導(dǎo)致其無(wú)法產(chǎn)生抗體②遺傳物質(zhì)改變（基因突變、染色體變異）導(dǎo)致其無(wú)法產(chǎn)生抗體③多種抗體的雜交瘤細(xì)胞混合體系Q2：如何篩選？②制備過程抗體檢測(cè)板多孔細(xì)胞培養(yǎng)板陽(yáng)性孔抗體檢測(cè)的方法——抗原-抗體雜交法將雜交瘤細(xì)胞群稀釋，約每孔1個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間后，檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔分泌抗體能跟特定抗原結(jié)合的細(xì)胞即為所需雜交瘤細(xì)胞知識(shí)拓展：篩選獲得能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆培養(yǎng)給小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴細(xì)胞（免疫）骨髓瘤細(xì)胞雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞分離脾細(xì)胞第二次篩選HAT選擇培養(yǎng)基克隆化培養(yǎng)，專一抗體檢驗(yàn)體外培養(yǎng)或小鼠腹腔內(nèi)增殖誘導(dǎo)融合篩選特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備②制備過程Q3：此過程涉及哪些動(dòng)物細(xì)胞工程的技術(shù)？動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)2、細(xì)胞融合技術(shù)應(yīng)用：①利用淋巴細(xì)胞和癌細(xì)胞的融合，培育__________②通過人-鼠雜交細(xì)胞丟失人的染色體可進(jìn)行__________單克隆抗體基因定位經(jīng)免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞第二次篩選：抗體陽(yáng)性檢測(cè)獲得能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞第一次篩選：利用選擇培養(yǎng)基（HAT培養(yǎng)基）獲得雜交瘤細(xì)胞克隆培養(yǎng)滅活仙臺(tái)病毒B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤腹腔腹水中提取活體體內(nèi)培養(yǎng)思考：?jiǎn)慰寺】贵w制備過程中的幾個(gè)問題（2）兩次篩選的目的相同嗎？（1）給小鼠注射抗原的目的是什么？（3）三次培養(yǎng)的目的是什么？（4）該過程運(yùn)用了哪些技術(shù)？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)。誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）第一次篩選：淘汰未融合或自融合的細(xì)胞，得到雜交瘤細(xì)胞。第二次篩選：淘汰不能產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞，最終獲得能產(chǎn)生最佳特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞第一次是培養(yǎng)漿細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞，并使兩種細(xì)胞融合；第二次是培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，篩選出能產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤細(xì)胞。第三次是培養(yǎng)能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，便于提取大量單克隆抗體。動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)給小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴細(xì)胞（免疫）骨髓瘤細(xì)胞雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞第一次篩選第二次篩選誘導(dǎo)融合選擇培養(yǎng)基克隆化培養(yǎng)，專一抗體檢驗(yàn)體外培養(yǎng)或小鼠腹腔內(nèi)增殖既能大量繁殖又能產(chǎn)生專一抗體在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的目的和方法是不相同的。1、單克隆抗體的制備③優(yōu)點(diǎn)a、特異性強(qiáng)：只能識(shí)別特異抗原分子的特定部位b、靈敏度高C、可大量制備d、純度高2、單克隆抗體的應(yīng)用a.作為診斷試劑——最廣泛應(yīng)用同位素標(biāo)記的單克隆抗體，在特定組織中成像，定位診斷相關(guān)疾病。準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速原理：抗原-抗體雜交技術(shù)b.作為特異性的探針，研究相應(yīng)抗原蛋白的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞學(xué)分布及功能抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體艾滋病檢測(cè)試劑c.用于治療疾病和運(yùn)載藥物

①特異性強(qiáng)、靈敏度高

生物導(dǎo)彈——單克隆抗體＋抗癌藥物

②療效高、毒副作用小

2、單克隆抗體的應(yīng)用抗癌藥物應(yīng)用時(shí)最大的問題？“生物導(dǎo)彈”追蹤癌細(xì)胞植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的比較植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞電融合法、離心法；聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能2.下圖為科研工作者利用小鼠制備H7N9禽流感病毒單克隆抗體的過程,請(qǐng)據(jù)圖回答有關(guān)問題。(1)圖中將H7N9病毒抗原基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的方法是

。

(2)在受體細(xì)胞的培養(yǎng)過程中,為了防止污染,通常還要在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加一定量的

,其培養(yǎng)液與植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基相比,特有的天然成分是

。

(3)圖中X細(xì)胞一般選用

,與植物體細(xì)胞雜交相比,誘導(dǎo)X細(xì)胞和Y細(xì)胞融合還可采用

。

顯微注射技術(shù)抗生素動(dòng)物血清骨髓瘤細(xì)胞

滅活的病毒

(4)單克隆抗體的制備過程需要經(jīng)過多次篩選,首先用特定的選擇性培養(yǎng)基篩選出

,最終獲得足夠數(shù)量