T-SHRH 015-2018 化妝品-酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)方法

71.100.70C2682Y42上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SHRH

015-2018_________________________________________________________________________________________化妝品-酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)方法Cosmetics

Method

前言…………… 21.范圍………………………… 32.原理………………………… 33.儀器………………………… 34.試劑………………………… 35

實(shí)驗(yàn)方法…………………… 36.結(jié)果計(jì)算…………………… 47.試驗(yàn)有效性驗(yàn)證…………… 48.結(jié)果報(bào)告…………………… 5 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)提出和歸口。資）有限公司、廣東博溪生物科技有限公司、上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳媛祺、陳志濤、范倩文、廖峰、吳建銘、呂智、孫培文、林藝青、周澤琳、萬(wàn)向紅、李瓊、高宏旗、金堅(jiān)、陳亦華1．范圍抑制酪氨酸酶活性而達(dá)到美白效果的水溶性原料的功效評(píng)價(jià)。2.原理pH6.8475nm處可測(cè)值的變化，評(píng)估原料對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用。3.儀器分析天平：感量

0.1mg；試管：10mL；可調(diào)節(jié)移液槍：1.00mL；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。4.試劑除有另外說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T

6682規(guī)定的一級(jí)水。Na2HPO4·2O；一水合檸檬酸；pH6.8

的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液① 0.2mol/L

24·2O：14.33g

溶于

水，用玻棒攪拌至溶解；② 0.1

mol/L

一水合檸檬酸：2.1g

100mL

水，用玻棒攪拌至溶解；③ pH6.8

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：0.2mol/L

Na2HPO4·12H2O

154.5

mL，加入

mol/L

一水合檸檬酸

45.5

mL，配制成

的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；酪氨酸酶，活力≥1000unit/mg

固體；左旋多巴，純度≥；酪氨酸酶溶液：用

pH6.8

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制，100u/mL左旋多巴溶液：用

pH6.8

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制，1mg/mL陽(yáng)性對(duì)照：曲酸，純度≥98.5%5.實(shí)驗(yàn)方法T-0C-DPPH

0溶劑本底mLmL0.51.5mL0.50.5mL3/1/3/1/陽(yáng)性對(duì)照物用

pH6.8

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋成：1mg/mL、0.2mg/mL、0.04mg/mL、系列濃度梯度用以驗(yàn)證試驗(yàn)系統(tǒng)。受試物處理：受試物用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋為多級(jí)濃度樣品。參照表

1

10mL

TT0CC0樣品的每個(gè)受試濃度的樣品管（T）需設(shè)立

3

支平行管，同時(shí)酶反應(yīng)管（C

3

支平行管。在樣品管（TT0）中各加入

1mL

相同濃度的樣品溶液，酶反應(yīng)管（C）和溶劑本底（C0）則分別加入

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。TC

0.5mL

T0C0

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液代替，將樣品和酪氨酸酶充分混勻，置

℃水浴槽孵育

分鐘。依次在各管中加入

5

中，在

475nm

處測(cè)定吸光值。

樣品加液要求6.結(jié)果計(jì)算計(jì)算酪氨酸酶抑制率：抑制率（%）（1

-

T

-

T0C

C

0

)

100%…………（1）（1）式中：T—樣品管吸光值，即樣品與酪氨酸酶反應(yīng)后溶液吸光值；T0—樣品本底吸光值；C—酶反應(yīng)管吸光值

3

次平均值，即未加樣品時(shí)酪氨酸酶和多巴反應(yīng)的吸光值；C0—溶劑本底吸光值。7.試驗(yàn)有效性驗(yàn)證

IC50（達(dá)到

抑制效果時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品受試濃度）應(yīng)在

，則認(rèn)為試驗(yàn)系統(tǒng)有效。應(yīng)用擬合公式（

R

應(yīng)用擬合公式（

R

≥0.9）計(jì)算各樣品的

IC50，IC50越小代表活性越強(qiáng)。準(zhǔn)差（Standard

，SD），

值須≤3%，則認(rèn)為試驗(yàn)平行性有效。8.

結(jié)果報(bào)告樣品在某一受試濃度下的對(duì)酪氨酸酶的抑制率應(yīng)表述為：抑制率平均值±抑制率間的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。對(duì)于樣品抑制酪