2023年高考生物一輪復習（全國版） 第10單元 第1課時　基因工程的基本工具和基本操作程序

第1課時基因工程的基本工具和基本操作程序目標要求1.基因工程的誕生。2.基因工程的原理及技術(含PCR技術)。3.實驗：DNA的粗提取與鑒定?？键c一重組DNA技術的基本工具1．基因工程的概念(1)手段：按照人們的愿望，通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性。(2)目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。(3)水平：分子水平。由于在DNA分子水平上進行設計和施工，因此又叫做DNA重組技術。拓展延伸基因工程的理論基礎2．DNA重組技術的基本工具(1)限制性核酸內切酶(也稱“限制酶”)(2)DNA連接酶(3)載體(1)源于選修3P4“尋根問底”①原核生物中存在限制酶的作用是什么？提示原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。②限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？提示限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。(2)源于選修3P6“尋根問底”：DNA連接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。延伸應用圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶?？枷蛞幌拗泼负虳NA連接酶1．(2022·青島市高三期中)下表為常用的限制性核酸內切酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷以下說法中，錯誤的是()限制酶名稱識別序列和切割位點限制酶名稱識別序列和切割位點BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGG注：Y為C或T，R為A或G。A．HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B．Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部C．BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D．一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列答案D解析HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶沿著中軸線切口切開，切割后形成平末端，A項正確；Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割位點在識別序列的外部，B項正確；BamHⅠ限制酶識別GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C項正確；HindⅡ能識別GTCAAC，也能識別GTTAAC，D項錯誤。2．第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護性抗原蛋白的基因(如圖甲)插入到適宜的質粒(如圖乙)中得到的重組DNA分子，將其導入人體內，在人體細胞內表達的產物可直接誘導機體免疫應答，且可持續(xù)一段時間。限制性核酸內切酶的切點分別是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析錯誤的是()A．構建DNA疫苗時，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質粒B．圖乙中只用EcoRⅠ切割后的質粒，含有2個游離的磷酸基團C．用EcoRⅠ切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶連接，只產生1種連接產物D．抗原基因在體內表達時不需要解旋酶答案C解析從圖甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后兩端各有一個切口，與圖乙中EcoRⅠ切口對接時，可有兩種可能，即可產生兩種重組DNA，C項錯誤；基因表達包括轉錄和翻譯，轉錄時不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D項正確?？枷蚨蚬こ梯d體的應用3．質粒是基因工程最常用的載體，下列有關質粒的說法正確的是()A．質粒不僅存在于細菌中，也存在于某些病毒中B．細菌的基因只存在于質粒上C．質粒為小型環(huán)狀DNA分子D．質粒是基因工程中的重要工具酶之一答案C4．下列有關基因工程中載體的說法，正確的是()A．在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒都是天然質粒B．所有的質粒都可以作為基因工程中的載體C．質粒是一種獨立于細菌染色體外的鏈狀DNA分子D．作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因答案D解析在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的，A錯誤；具有一至多個限制酶切點、具有標記基因的質粒才可以作為基因工程中的載體，B錯誤；質粒是一種獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外的環(huán)狀DNA分子，C錯誤；作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因，而且能在受體細胞中復制并穩(wěn)定保存，D正確?？键c二基因工程的基本操作程序1．目的基因的獲取(1)目的基因：主要指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用的因子。(2)獲取目的基因的方法①從基因文庫中獲取eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(從基因組文庫中獲取,從部分基因文庫如cDNA文庫中獲取))eq\a\vs4\al\co1(②利用,PCR技,術擴增,目的基,因)eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(原理：DNA雙鏈復制,條件：引物、DNA模板、熱穩(wěn)定DNA,聚合酶、游離的dNTPdCTP、dATP、,dGTP、dTTP,過程\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(變性：90～95℃條件下受熱變性,↓,

后解鏈為單鏈,

,復性：55～60℃條件下，引物與單,

鏈相應互補序列結合,↓,延伸：70～75℃條件下在熱穩(wěn)定,

DNA聚合酶作用下合成子鏈)),結果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，即成指數形,

式擴增約為2n，其中n為擴增循環(huán)的次數))③用化學方法直接人工合成eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(條件：基因比較小，核苷酸序列已知,方法：通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成))歸納總結(1)PCR技術和DNA復制的比較(2)幾種獲取目的基因方法的比較項目從基因文庫中獲取人工合成方法從基因組文庫中獲取從cDNA文庫中獲取化學合成法反轉錄法過程供體細胞中的DNA↓限制酶許多DNA片段↓插入載體↓導入受體菌群(基因組文庫)↓外源DNA擴增，產生特定性狀↓分離目的基因目的基因的mRNA↓反轉錄單鏈DNA↓合成雙鏈DNA↓插入載體↓導入受體菌群(cDNA文庫)↓分離目的基因蛋白質的氨基酸序列↓推測mRNA的核苷酸序列↓推測基因的核苷酸序列↓化學合成目的基因目的基因的mRNA↓反轉錄單鏈DNA↓合成雙鏈DNA(即目的基因)說明將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫，包括基因組文庫和cDNA文庫適用于片段較小，核苷酸序列已知的目的基因；利用DNA合成儀合成以RNA為模板，需要逆轉錄酶易錯提醒①在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內的DNA進行復制時，也需要引物，一般為RNA片段。③真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。④PCR擴增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律循環(huán)次數123nDNA分子數2482n含引物A(或B)的DNA分子數1372n－1同時含引物A、B的DNA分子數0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗的引物數量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22n＋1－22.基因表達載體的構建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。(2)基因表達載體的組成及作用(3)構建過程易錯提醒列表比較啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA使轉錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)3.將目的基因導入受體細胞生物種類植物動物微生物常用方法農桿菌轉化法、花粉管通道法顯微注射技術Ca2＋處理法受體細胞體細胞或受精卵受精卵原核細胞轉化過程將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導入辨析1轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。此處“轉化”與肺炎雙球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。2農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上，第二次拼接非人工操作是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌，第二次導入非人工操作是指含目的基因的T－DNA導入受體細胞。3農桿菌特點①能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有感染能力。②農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T－DNA轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。4．目的基因的檢測與鑒定考向一目的基因的獲取5．如圖表示基因工程中獲取目的基因的示意圖，下列相關敘述不正確的是()A．③表示PCR技術，用來擴增目的基因B．若獲取的目的基因相同，則圖中基因組文庫小于cDNA文庫C．要從基因文庫中得到所需的目的基因可以根據目的基因的相關信息來獲取D．若基因比較小，核苷酸序列又已知，可以通過化學方法直接人工合成獲取答案B6．利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關PCR的敘述，錯誤的是()A．PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B．變性過程中，雙鏈DNA的解開不需要解旋酶C．復性過程中，引物與模板鏈的結合遵循堿基互補配對原則D．延伸過程中，需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸答案D考向二基因工程的基本操作程序7．(2022·山東高三聯考)戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結構蛋白(pORF2)位于病毒表面，構成病毒的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關于該疫苗的敘述，正確的是()A．過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、CB．重組基因表達載體上的啟動子需來源于戊型肝炎病毒C．過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)D．過程⑥大量制備pORF2蛋白前應做相應的檢測與鑒定答案D解析戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA，獲取目的基因的過程，需要的酶是逆轉錄酶，原料是四種脫氧核苷酸，A項錯誤；啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的識別結合以驅動目的基因的轉錄，啟動子具有物種或組織特異性，構建在大腸桿菌細胞內特異表達pORF2蛋白的載體時，需要選擇大腸桿菌細胞的啟動子，而不能選擇其他物種和組織細胞的啟動子，B項錯誤；將目的基因導入微生物細胞的方法是Ca2＋處理法，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，增大大腸桿菌細胞壁的透過性，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，C項錯誤。8．某質粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點，同時還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質粒獲得轉基因抗鹽煙草的過程，如下圖所示。請回答下列問題：(1)將目的基因導入植物細胞，采用最多的方法是農桿菌轉化法。其中用到的質粒是____________________；該質粒含有一段特殊的DNA片段，稱為________________。該方法中農桿菌的作用是__________________________________________________________。(2)在構建重組質粒時，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質粒相比，選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶的好處是______________________________________________________________。(3)含有目的基因的農桿菌可根據標記基因進行篩選。若農桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上都可以生長繁殖，農桿菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。為什么？____________________________________________________________________。(4)將已經轉化的農桿菌進行如下操作，篩選出符合要求的農桿菌。先把轉化的農桿菌接種到A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長出菌落后，用無菌牙簽挑取A上的單個菌落，分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環(huán)素和氨芐青霉素)兩個培養(yǎng)基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請在圖中相應的位置上圈出來。答案(1)Ti質粒T－DNA感染煙草細胞，把目的基因插入到煙草細胞的染色體DNA上(2)防止目的基因自連和質粒自連，以提高帶有目的基因的重組質粒的合成效率(3)否含有目的基因的質粒中抗四環(huán)素基因被破壞(4)如圖所示科學思維載體上標記基因的標記原理載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，原理如下圖所示：考點三DNA的粗提取與鑒定1．基本原理(1)DNA的粗提?、僭恚豪肈NA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。②DNA與蛋白質在物理和化學性質方面的差異比較項目DNA蛋白質溶解性2mol·L－1NaCl溶液中溶解析出0.14mol·L－1NaCl溶液中析出溶解酒精溶液中析出溶解耐受性蛋白酶無影響水解高溫80℃以上變性不能忍受60～80℃的高溫(2)DNA的鑒定：DNA＋二苯胺eq\o(→,\s\up7(沸水浴))藍色。2．操作流程易錯提醒(1)DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、4、4”實驗操作實驗操作的目的加蒸餾水2次①加到雞血細胞液中，使血細胞吸水漲破；②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物質的量濃度稀釋到0.14mol/L，使DNA析出用紗布過濾4次①過濾血細胞破裂液，得到含細胞核物質的濾液；②過濾用2mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，濾去溶液中的雜質；③濾取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④過濾溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的細胞核物質；②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA(2)注意事項①本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)。可選用雞血細胞作材料。②加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟的操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。③二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。④提取植物細胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。⑤在DNA進一步提純時，選用冷卻的體積分數為95%的酒精溶液的作用是溶解雜質和析出DNA。考向DNA的粗提取與鑒定9．下圖是“DNA的粗提取和鑒定”實驗中幾個重要操作的示意圖，下列敘述錯誤的是()A．圖①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白質可溶于酒精B．圖①和圖③都需要用玻璃棒沿一個方向輕緩攪拌，便于DNA的析出并保持結構完整C．若圖③操作后接圖②操作，則DNA會留在濾液中D．若圖④操作后接圖②操作，則DNA會留在紗布上答案B10．(2022·貴州遵義聯考)下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖，下列相關敘述正確的是()A．圖1中溶液a是物質的量濃度為0.14mol/L的NaCl溶液B．圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤，可能導致試管2中藍色變化不明顯C．圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質等雜質不溶D．圖2試管1的作用是證明物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出現藍色答案B解析圖1中溶液a是NaCl溶液，其目的是溶解DNA，DNA在物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液中的溶解度較高，在物質的量濃度為0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，A錯誤；圖2所示實驗的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面，可能導致加熱不充分，試管2中藍色變化不明顯，B正確；圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白質等雜質能溶，C錯誤；圖2試管1起對照作用，目的是證明沸水浴下物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不會出現藍色，而DNA遇二苯胺出現藍色，D錯誤。重溫高考真題演練1．(2019·江蘇，10)下列關于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯誤的是()A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近B．DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂C．預冷的酒精可用來進一步純化粗提的DNAD．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行水浴加熱答案A解析哺乳動物(如兔)成熟的紅細胞中無細胞核和眾多細胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作為該實驗的實驗材料，A錯誤；為防止DNA斷裂，在DNA析出過程中攪拌操作要輕柔且沿著一個方向，B正確；DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質溶于酒精溶液，預冷的酒精溶液可用來進一步純化粗提的DNA，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺呈現藍色，因此，用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行水浴加熱，D正確。2．(2021·全國甲，38)PCR技術可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進行了相關操作：①分析PCR擴增結果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答下列問題：(1)若要得到正確的檢測結果，正確的操作順序應該是________(用數字序號表示)。(2)操作③中使用的酶是________，PCR反應中的每次循環(huán)可分為變性、復性、______三步，其中復性的結果是______________________________________________。(3)為了做出正確的診斷，PCR反應所用的引物應該能與____________特異性結合。(4)PCR(多聚酶鏈式反應)技術是指_______________________________________________。該技術目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面。答案(1)④②③①(2)Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)延伸引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合(3)病原菌DNA(4)一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術解析(1)PCR技術可用于臨床的病原菌檢測，若要得到正確的檢測結果，正確的操作順序應該是④采集病人組織樣本→②從病人組織樣本中提取DNA→③利用PCR擴增DNA片段→①分析PCR擴增結果。(3)DNA復制需要引物，為了做出正確的診斷，PCR反應所用的引物應該能與兩條單鏈DNA特異性結合。3．(2019·全國Ⅰ，38)基因工程中可以通過PCR技術擴增目的基因?；卮鹣铝袉栴}：(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得?；蛭膸彀╛___________________和______________。(2)生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是____________。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是________________。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的________。(3)目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________________________________________。答案(1)基因組文庫cDNA文庫(2)解旋酶加熱至90～95℃氫鍵(3)Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活4．(2018·全國Ⅰ，38)回答下列問題：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達。該研究除證明了質粒可以作為載體外，還證明了___________________________________________________________________________________(答出兩點即可)。(2)體外重組的質?？赏ㄟ^Ca2＋參與的________方法導入大腸桿菌細胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞。在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是________。(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解。為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用____________的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加________的抑制劑。答案(1)體外重組的質粒可以進入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達(2)轉化外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)細菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶5．(2021·全國乙，38)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內切酶的切割位點如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)常用的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中____________________酶切割后的DNA片段可以用E·coliDNA連接酶連接。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是______________。(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征。如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能______________；質粒DNA分子上有_________________________，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是__________。(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指________________________________。答案(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復制一個至多個限制酶切割位點用含有該種抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能存活的細胞含有質粒載體(4)一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位一、易錯辨析1．限制酶也可以識別和切割RNA(×)2．DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來(×)3．E·coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(×)4．用PCR方法擴增目的基因時需要設計兩種引物(√)5．提取DNA時，如果沒有雞血材料，可用豬血代替(×)二、填空默寫1．(選修3P1)基因工程：按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。2．(選修3P4)限制酶的作用是能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。3．(選修3P5)DNA連接酶的作用是將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。4．(選修3P6)質粒：一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，并具有自我復制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。5．(選修3P6)載體上有特殊的標記基因，作用是供重組DNA的鑒定和選擇。6．(選修3P9)目的基因：主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用的因子。7．(選修3P11)基因表達載體是載體的一種，除目的基因、標記基因外，還必須含有啟動子、終止子等。8．(選修3P11)啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質。9．(選修3P11)終止子位于基因的尾端，是一段有特殊結構的DNA短片段，終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉錄在所需要的地方停止下來。10．(選修3P12)將目的基因導入植物細胞采用最多的方法是農桿菌轉化法，將目的基因插入到Ti質粒的T－DNA上，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞，并將其插入到植物細胞中染色體的DNA上，使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達。11．(選修3P13)將目的基因導入動物細胞采用最多的方法是顯微注射技術。12．(選修3P13)將目的基因導入微生物細胞最常用的方法是Ca2＋處理法，首先用Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細胞稱為感受態(tài)細胞，第二步是將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉化過程。課時精練一、選擇題1．若要利用某目的基因(見圖甲)和P1噬菌體載體(見圖乙)構建重組DNA(見圖丙)，限制性核酸內切酶的酶切位點分別是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是()A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體答案D解析解答本題的關鍵是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體，構建的重組DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移動方向才一定與圖丙相同。2．農桿菌中的Ti質粒是植物基因工程中常用的載體，下列相關敘述正確的是()A．Ti質粒是能夠自主復制的單鏈DNAB．Ti質粒中磷酸基團都與兩個脫氧核糖相連接C．重組Ti質粒的受體細胞只能是植物愈傷組織細胞D．Ti質粒上的基因可全部整合到受體細胞染色體上答案B3．利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。下列敘述錯誤的是()A．用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列B．設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連C．復性溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產物D．第四輪循環(huán)產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16答案D解析用PCR方法擴增目的基因時，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成(兩種)引物，但不必知道基因的全部序列，A正確；復性的目的是使兩種引物通過堿基互補配對與兩條DNA單鏈結合，因此復性溫度過高可能引起兩種引物不能與兩條DNA單鏈結合，進而導致PCR反應得不到任何擴增產物，C正確；DNA復制為半保留復制，第四輪循環(huán)即DNA復制4次，共形成24＝16個DNA分子，其中含有最初模板鏈的2個DNA分子含有引物A或引物B，其余14個DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四輪循環(huán)產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為14/16＝7/8，D錯誤。4．下列關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗原理的敘述，正確的是()A．利用DNA能溶于酒精溶液，而蛋白質不溶于酒精溶液的特點，可將DNA與蛋白質分離B．利用85℃的高溫能使蛋白質變性卻對DNA沒有影響的特性，將DNA與蛋白質分離C．利用DNA在2mol·L－1NaCl溶液中溶解度最大的特點，可將DNA與雜質分離D．在DNA濾液中加入嫩肉粉，通過木瓜蛋白酶的作用，可將DNA與蛋白質分離答案D5．科學家將馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因Pin－Ⅱ導入楊樹細胞，培育成了抗蟲楊樹。下圖表示含目的基因的DNA分子和農桿菌質粒，圖中AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因，箭頭表示識別序列完全不同的4種限制酶的酶切位點。下列敘述不正確的是()A．目的基因插入到質粒的T－DNA上，才能整合到受體細胞染色體中B．為使目的基因與質粒高效重組，最好選用EcoRⅠ和PstⅠC．成功導入重組質粒的細胞會表現為不抗氨芐青霉素、抗新霉素D．可用PCR等技術或抗原—抗體雜交技術檢測目的基因是否表達答案D解析農桿菌中的Ti質粒上的T－DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上，根據這一特點，將目的基因插入到質粒的T－DNA上，才能整合到受體細胞染色體中，A正確；應選用EcoRⅠ和PstⅠ切割質粒，氨芐青霉素抗性基因被破壞，故成功導入重組質粒的細胞會表現為不抗氨芐青霉素、抗新霉素，C正確；檢測目的基因是否表達應檢測是否成功產生蛋白質，可用抗原—抗體雜交技術，D錯誤。6．科學家將蘇云金芽孢桿菌中的Bt抗蟲蛋白基因(抗蟲基因)導入棉花的愈傷組織細胞，鑒定后，將含抗蟲基因的受體細胞組織培養(yǎng)獲得棉花植株。經棉鈴蟲飼喂實驗，發(fā)現棉花植株并無抗蟲性狀，科學家提取棉花葉片細胞中的有關成分進行了如下操作，下列分析錯誤的是()A．提取細胞中的蛋白質，采用抗原—抗體雜交技術進行檢測，若能檢測到Bt抗蟲蛋白，則可能是抗蟲基因表達效率低B．若經A檢測確定細胞中無Bt抗蟲蛋白，可采用核酸分子雜交技術檢測細胞中的RNA，若測到Bt抗蟲蛋白的mRNA，則可能是抗蟲基因能轉錄，但不能正常翻譯C．若經B檢測確定細胞中無Bt抗蟲蛋白的mRNA，可采用核酸分子雜交技術檢測細胞中的DNA，若能檢測到抗蟲基因，則可能是抗蟲基因反向插入載體DNA分子中D．若經C檢測確定細胞中無抗蟲基因，則可能只是載體DNA分子導入受體細胞答案D解析抗原、抗體能特異性結合，可提取細胞中的蛋白質，采用抗原—抗體雜交技術進行檢測，若能檢測到Bt抗蟲蛋白，說明抗蟲基因能表達。但棉花植株并無抗蟲性狀，則可能是抗蟲基因表達效率低，合成的Bt抗蟲蛋白太少，A正確；核酸分子雜交技術的原理是堿基互補配對，檢測細胞中的RNA，若測到Bt抗蟲蛋白的mRNA，說明抗蟲基因能轉錄，細胞中無Bt抗蟲蛋白，說明抗蟲基因不能正常翻譯，導致棉花植株并無抗蟲性狀，B正確；核酸分子雜交技術檢測細胞中的DNA，若能檢測到抗蟲基因，而抗蟲基因又不能表達，則可能是抗蟲基因反向插入載體DNA分子中，C正確；由題干信息“鑒定后，將含抗蟲基因的受體細胞組織培養(yǎng)獲得棉花植株”可知，導入受體細胞的是重組DNA分子，D錯誤。二、非選擇題7．如圖pIJ702是一種常用質粒，其中tsr為硫鏈絲菌素(一種抗生素)抗性基因；mel為黑色素合成基因，其表達能使白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落；而三種限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分別只有一處識別序列?；卮鹣铝袉栴}：表1pIJ702pZHZ8BglⅡ5.7kb6.7kb表2固體培養(yǎng)基中硫鏈絲菌素濃度(μg/mL)012510不含質粒的鏈霉菌生長狀況＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－注：“＋”表示生長；“－”表示不生長。(1)限制酶可以識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的________________斷裂，切割形成的末端有______________________兩種。(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，與質粒pIJ702上長度為0.4kb的SacⅠ/SphⅠ片段進行置換，構建重組質粒pZHZ8。上述兩種質粒經限制酶BglⅡ酶切后所得片段長度見表1。由此判斷目的基因的片段長度為____________kb，判定目的基因中含有一個BglⅡ切割位點的理由是__________________________________________________________________________。(3)導入目的基因時，首先用Ca2＋處理鏈霉菌使其成為感受態(tài)(能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài))細胞，再將重組質粒pZHZ8溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下可以促進鏈霉菌完成________________________________________________________過程。(4)不含質粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素的固體培養(yǎng)基上生長狀況如表2所示。若要篩選導入pZHZ8的鏈霉菌細胞，所需硫鏈絲菌素濃度至少應在________μg/mL以上，挑選成功導入pZHZ8的鏈霉菌的具體方法是___________________________________________________。若要檢測整合到染色體DNA上的目的基因是否發(fā)揮功能作用，第一步需檢測受體細胞的____________(填“DNA”或“RNA”)。答案(1)磷酸二酯鍵黏性末端和平末端(2)1.4pIJ702上的原有BglⅡ切割位點被目的基因置換得到的環(huán)狀pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一條線段(3)轉化(4)5根據導入pIJ702的鏈霉菌菌落呈黑色、導入pZHZ8的鏈霉菌菌落呈白色的特點，通過觀察菌落的顏色進行挑選RNA解析(2)質粒pIJ702的長度為5.7kb，而重組質粒pZHZ8的長度為6.7kb，又已知構建基因表達載體時，目的基因置換了pIJ702上0.4kb的片段，由此判斷目的基因的片段長度為6.7－5.7＋0.4＝1.4kb。(4)從不含質粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素固體培養(yǎng)基上的生長狀況表格可以看出，硫鏈絲菌素濃度低于5μg/mL時，鏈霉菌能夠生長，因此所需的硫鏈絲菌素最小濃度應為5μg/mL。檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步是目的基因是否能轉錄形成mRNA。8．(2022·濟南聯考)下圖是利用工程菌(大腸桿菌)生產人生長激素的實驗流程。所用的pBR322質粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的切點各一個，且三種酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環(huán)素抗性基因。請回答以下相關問題：(1)目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有________的因子。過程①所用到的組織細胞是________________，③過程的目的是________________________，⑤過程常用________處理大腸桿菌。(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對圖中質粒進行切割，形成的DNA片段種類有________種，這些種類的DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有______種和___________________________________________種。(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和質粒，完成過程④、⑤后(受體大腸桿菌不含AmpR、TetR)，將三角瓶內的大腸桿菌先接種到甲培養(yǎng)基上，形成菌落后用無菌牙簽挑取甲培養(yǎng)基上的單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培養(yǎng)基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如圖乙、丙所示。接種到甲培養(yǎng)基上的目的是篩選____________________的大腸桿菌；接種到乙培養(yǎng)基上的大腸桿菌菌落，能存活的大腸桿菌體內導入的是__________________________。含有目的基因的大腸桿菌在培養(yǎng)基乙和丙上的生存情況是____________________________。答案(1)調控作用人垂體組織細胞將平末端處理為黏性末端Ca2＋(2)933(3)含四環(huán)素抗性基因完整的pBR322質粒(或含有AmpR、TetR的質粒)在丙中能存活，在乙中不能存活解析(2)(后面的→均按照順時針方向)假設PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三種酶的切點分別用1、2、3表示。一種酶分別酶切時，一共可以得到3種片段1→1、2→2、3→3；任意兩種酶分別同時酶切時，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六種片段；三種酶同時酶切時，可得到1→2、2→3、3→1三種片段。綜上所述，共計9種不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3種含有完整氨芐青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3種含有完整四環(huán)素抗性基因。9．我國科學家將甲型肝炎病毒V區(qū)抗原基因和丙型肝炎病毒C區(qū)抗原基因以融合基因的方式導入光致死突變體(pet基因缺失導致光照致死)衣藻的葉綠體基因組中，融合蛋白得到了高效表達，且具有雙價抗原活性?；卮鹣铝袉栴}：(1)構建基因表達載體時，應當在甲型肝炎病毒V區(qū)和丙型肝炎病毒C區(qū)融合基因的首段插入啟動子序列，便于其被________識別并發(fā)生特異性結合，應當選擇____________作為標記基因。培養(yǎng)pet基因缺失突變體的受體衣藻時，應給予____________以篩選成功導入重組質粒的衣藻細胞。(2)科學家將基因表達載體包裹