固定化酶和固定化細(xì)胞

關(guān)于固定化酶和固定化細(xì)胞知識點:1.酶和活細(xì)胞的固定方法(包括游離酶、微生物、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞）。2.輔酶和輔基的固定。3.固定化酶的性質(zhì)4.固定化對酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響5.固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用第2頁,共85頁，2024年2月25日，星期天固定化酶(ImmobilizedEnzyme）是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的—項新技術(shù)。以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性的酶。這些水溶性酶催化結(jié)束后，極難回收，因而阻礙了酶工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。60年代后，在酶學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)涌現(xiàn)出固定化酶。它是通過物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚讣砜`在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用；過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。1971年第一屆國際酶工程會上正式建議采用固定化酶的名稱。從60年代起，固定化酶的研究發(fā)展很快，起初人們把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年來，不但固定化方法和載體開發(fā)有了長足發(fā)展，并且已轉(zhuǎn)向它在工業(yè)、醫(yī)藥、化學(xué)分析、親和層析、環(huán)境保護、能源開發(fā)以及理論研究等方面的應(yīng)用研究。第3頁,共85頁，2024年2月25日，星期天1酶和活細(xì)胞的固定方法1.1固定化酶與固定化細(xì)胞的優(yōu)缺點1.1.1固定化酶:固定化酶的研究已取得大量重要成果．發(fā)揮著巨大作用，受到人們極大的關(guān)注。其重要原因是它和水溶性酶比較具有以下優(yōu)點：(1)極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝.(2)可以在較長時間內(nèi)反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。(3)酶反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制，有利于工藝自動化和微電腦化。(4)在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。(5)較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)。(6)酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。第4頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

固定化酶也存在一些缺點：(1)酶固定化時酶的活力有所損失。同時也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。(2)比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。(3)與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)，同時對胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后．才能固定化。1.1.2固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它的優(yōu)點如下:(1)省去了酶的分離手續(xù)．為多酶系統(tǒng)，無須輔因子再生。(2)細(xì)胞生長快、而且多、反應(yīng)快。(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細(xì)胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。(4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對污染因子的抵抗力增加。第5頁,共85頁，2024年2月25日，星期天固定化細(xì)胞同時也存在—些缺點：

(1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。

(2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。

(3)細(xì)胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴散。1.2酶的固定化方法酶的固定化方法有：吸附法；共價鍵結(jié)合法；交聯(lián)法；包埋法.如下圖:第6頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共85頁，2024年2月25日，星期天1.2.1吸附法吸附法分為物理吸附法和離子交換吸附法。(1)物理吸附法:通過氫鍵、疏水作用和π電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上．從而制成固定化酶。常用的載體有：

①有機載體。纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、淀粉等。比如用纖維索作為吸附劑，用膨潤的玻璃紙或膠棉膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸脂酶、6—磷酸葡萄糖脫氫酶。吸附后在載體表面形成單分子層，吸附蛋白能力約70mg/cm2。②無機載休。氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。比如用多孔硅為載體吸附米曲酶和枯草桿菌的r淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45℃進(jìn)行固定化，用高濃度的底物進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)．半衰期分別為14、35、60d。無機載體的吸附容量較低、而且酶容易脫落。第8頁,共85頁，2024年2月25日，星期天(2)離子交換吸附法:這是將酶與含有離予交換基的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化的一種方法。酶吸附較牢，在工業(yè)上頗具廣泛的用途。常用的載體有陰離子交換劑，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纖維素、混合胺類（ECTEDLA）—纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)—纖維素、DEAE—葡聚糖凝膠、AmberliteIRA—93、410、900等。陽離子交換劑基，如羧甲基(CM)—纖維素、纖維素檸檬酸鹽、AmberliteCG50、IRC—50、IR—200、Dowex—50等。DEAE-Sephadex固定化氨基?；福簩EAE-SephadexA25充分溶脹．用0．5mol/LNa0H和水洗滌后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰—DL-Ala活力為25umol/m1·h)充分混合(1g濕重載體加60ml酶液)后，于低溫下攪拌過夜后，吸去上清液，再用蒸餾水和0.15mol/L醋酸鈉水溶液洗滌固定化酶，置4℃?zhèn)溆?。固定化酶活力回?0-60％，水解乙酰—DL—A1a活力為600-800umol/g·h濕固定化酶。氨基?；敢部晒潭ㄓ贒EAE—纖維素。此外，DEAE—纖維素吸附的α—淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。第9頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

通過酶蛋白化學(xué)修飾來增加蛋白質(zhì)分子上電荷．能有效的克服吸附法制備的固定化酶在使用過程的解吸。用水溶性乙烯—順丁烯二酸酐共聚物共價修飾的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE—纖維素和DEAE—Scphadex載體有效的固定。這種固定幾乎是不可逆的吸附。此外．酶的吸附與解吸還與介質(zhì)中離子強度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度及酶和載體的特性相關(guān)。pH的變化影響到載體和酶的電荷，從而影響載體對酶的吸附。在等電點兩側(cè)(±1-2pH單位)吸附將明顯減少，但也有個別例外。鹽對吸附的影響較為復(fù)雜．在一些特殊事例中、鹽可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸附。這就是所謂的鹽析吸附。對蛋白質(zhì)吸附來說，隨溫度的升高吸附下降。載體的表面積、多孔性及其頂處理都影響對酶的吸附。第10頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

吸附法制備固定化酶操作簡單，可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體，吸附過程可以同時純化酶，固定化酶在使用過程失活后可重新活化，同時，載體可以回收再利用。但由于有些機理不十分明了，在給酶量、吸附程度與固定化酶活力回收的關(guān)系不可預(yù)見性大，同時由于吸附法制備的固定化酶易脫落，影響產(chǎn)物純度和酶的操作為穩(wěn)定性。1.2.2包埋法包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑(包括交聯(lián)劑)的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化。包埋法操作簡單，由于酶分子只被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，可以制得較高活力的固定化酶．對大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細(xì)胞都是適用的。但是，只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過凝膠網(wǎng)絡(luò)，而對大分子底物不適宜。同時，凝膠網(wǎng)絡(luò)對物質(zhì)擴散的阻力導(dǎo)致固定化酶動力學(xué)行為的變化、活力降低。包埋法常用凝膠包埋法和微囊化法。第11頁,共85頁，2024年2月25日，星期天(1)凝膠包埋法凝膠包埋法是將酶分子包埋在凝膠格子中。①聚丙烯酰胺凝膠包埋法。一般的制備過程如下：將1ml溶于適當(dāng)緩沖液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(單體)和40mgN，N’—甲叉雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑)的3ml溶液中，再加0.5ml15％的二甲氨基丙腈(加速劑)，同時，加入1％過硫酸鉀(引發(fā)劑)，混合，于25T：保溫10min，便得含酶凝膠。將凝膠粉碎，制得不規(guī)則的顆粒．于低溫儲存或冷凍干燥。為制得珠狀固定化酶，可以在聚合反應(yīng)開始時，立即轉(zhuǎn)入到疏水相(一種乳化劑，與水相有相同密度)的有機溶液中，使分散成含酶的珠狀凝膠。

聚丙烯酰胺包埋法的缺點是酶容易漏失，以低分子量蛋白質(zhì)為甚，如果調(diào)整交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)程度可以得到克服。第12頁,共85頁，2024年2月25日，星期天②輻射包埋法。酶溶于純單體水溶液、單體加合物水溶液或純聚合物溶液中．在常溫或低溫下，用x—射線、Y—射線或電子束輻照。可得到包埋酶的親水凝膠。如用X—射線引發(fā)聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年H．Maeda等用聚乙烯水溶液輻照包埋了多種酶。運用弱水性或稍微疏水性的玻璃化載體，用低溫過冷態(tài)的輻照聚和，可用于—般生物物質(zhì)的固定化。這些生物物質(zhì)主要分布在載體表面層區(qū)域，固定化產(chǎn)物表面具有生物活性，曾稱這種方法為粘附法。這種方法可粘附酶、葉綠素、病毒等，長期使用后仍有較高的活性?？梢允褂貌ＡЩ瘑误w，玻璃化單體和非玻璃化單體混合物、單體和天然聚合物的混合物為載體。第13頁,共85頁，2024年2月25日，星期天③其他凝膠包埋法。

a.淀粉凝膠包埋法。將氨基甲酸乙酯的泡沫墊浸入溫?zé)岬牡矸廴芤汉鸵阴Ｄ憠A脂酶的混合物中，再經(jīng)冷卻、干燥，便制得固定化乙酰膽堿脂酶。，為增強機械強度和重新水合可加入—定量的甘油。b.膠原包埋法即大分子絡(luò)合法。膠原有纖維性，易成膜，能在生理pH下自發(fā)的聚焦成束，膠束末端可以通過多種次級鍵與酶分子相互作用，通過酶和膠原分子形成網(wǎng)架而將酶固定化。其制備方法極為簡單：將酶加到膠原懸浮液中、鋪膜、干燥即得固定化酶?；蛘呓?jīng)過透析的酶和膠原混合，插入電極，酶—膠原復(fù)合物便在電極上沉淀。第14頁,共85頁，2024年2月25日，星期天c.卡拉膠包埋法：卡拉膠(K—Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一種多糖，可以用來包埋酶。具體方法：將100gx酶在37—50℃溶于水中，又將1.7g卡拉膠在40一60溶于34ml生理鹽水中，二者混合后冷全10℃，所成凝膠浸在0.3mol/LKCl溶液中硬化，作成適當(dāng)大小的顆粒,即為固定化酶。

d.天然血纖維包埋法：血纖維不會引起抗體形成，且無毒。在檸檬酸緩沖液中使酶和血纖蛋白原及凝血酶混合、便制得血纖蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纖蛋白的谷氨酰胺殘基之間發(fā)生交聯(lián)而將酶固定化。e.大豆蛋白包埋法。含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌菌株與大豆蛋白溶液混合，在60℃用碳酸鎂處理使其凝結(jié)，過濾．制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺處理，硬化．從而制得固定化葡萄糖異構(gòu)酶。第15頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

(2)微囊化法此法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。它使酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外環(huán)境直接接觸．從而增加了酶的穩(wěn)定性．同時，小分子底物能通過膜與酶作用，產(chǎn)物經(jīng)擴散而輸出。微囊一般直徑約1～100um，膜厚約100nm，膜上孔徑約3.6nm，表面積與體積之比極大，物質(zhì)能很快達(dá)到平衡，能有效的包埋許多種酶。同時、可用不同類型、不同濃度的酶、細(xì)胞提取物或細(xì)胞，不同組成和含量的膜包裹組建成人工細(xì)胞.因此，此法在醫(yī)療上極為有用。例如固定化天門冬酰胺酶(治療白血病)就是用這種方法制成的微膠囊。微膠囊的制備方法有4種。第16頁,共85頁，2024年2月25日，星期天①界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度極低而形成膜，從而將酶包埋的方法。如，含有高濃度血紅蛋白的酶溶液在與水不互溶、沸點比水低的有機相中乳化，加入油溶性表面活性劑，形成油包水的微滴，再將溶于有機溶劑的高聚物在攪拌下加入乳化液中，然后加入一種不溶解高聚物的有機溶劑．使高聚物在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，從而制成固定化酶。作為高聚物有硝酸纖維素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。如“人造細(xì)胞”制備：25ml10%％血紅蛋白水溶液(內(nèi)含適當(dāng)酶、②界面聚合法。界面聚合法是將疏水性和親水性單體在界面進(jìn)行聚合，形成半透膜,使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用來制備Asn酶、脲酶等。制備方法一般是：將酶水溶液與親水單體(如乙二醇)用一種水不溶混的有機溶劑制成乳化液，再將溶于同一有機溶劑疏水單體(如多異氰酸)溶液在攪拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有機溶劑之間的界面發(fā)生聚合化第17頁,共85頁，2024年2月25日，星期天這樣水相中酶便包埋在聚合體(聚脲)膜內(nèi)。例如用含酶的10％血紅蛋白水溶液與己甲叉二胺的水溶液混合，立即在1％Span85的氯仿-環(huán)已烷中分散乳化,加人癸二酰氯(有機相)后，便在油-水界面發(fā)生聚合反應(yīng)，棄除上清液，加入Tween-20去乳化,洗除有機溶劑，除去未聚合單體后，轉(zhuǎn)入水相，制得固定化酶。③液體干燥法。此法曾用乙基纖維素和聚苯乙烯包埋過氧化氫酶、脂肪酶等。它是將一種聚合物溶于一種沸點比水低，且與水不混溶的溶劑中．加入酶液后，加入油溶性表面活性劑為乳化劑使之乳化。再把它分散于含有保護性膠質(zhì)如明膠、聚丙烯醇和表面活性劑的水溶液中，第二次乳化.在不斷攪拌下，低溫真空除去有機溶劑，便得含酶微囊。常用聚合體有乙基纖維素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有機溶劑有苯、環(huán)己烷和氯仿。第18頁,共85頁，2024年2月25日，星期天④紅血球包埋法。在高滲溶液中紅細(xì)胞膨脹伸展后，細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白漏出，同時胞外蛋白也能擴散進(jìn)紅血球．再放進(jìn)等滲溶液中，紅血球膜又回復(fù)至正常狀態(tài)和透性，進(jìn)入的酶不會漏出來.⑤脂質(zhì)休包埋法。上述微囊法是一種半透性膜將酶包埋，近年來采用雙層脂質(zhì)體形成極細(xì)球粒包埋酶。例如．將卵磷脂、膽甾醇和二鯨臘磷酯按7：2：1溶于氯仿中．再加入酶液，混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在氮氣下32℃轉(zhuǎn)動乳化，然后在室溫下保持2h，再在氮氣氣流中．4℃用音波處理10s，在室溫下保持2h，過Sepharose6B柱，收集脂質(zhì)體，離心分離脂質(zhì)體，所得球粒懸浮于緩沖液中，繼續(xù)音波處理，并過Sepharose6B柱，可得含酶的微囊。這種微囊液膜當(dāng)?shù)孜锂a(chǎn)物穿過時、與膜的徑無關(guān)．但與產(chǎn)物或底物對膜成分的溶解度有關(guān)。第19頁,共85頁，2024年2月25日，星期天1.2.3共價鍵結(jié)合法

共價鍵結(jié)合法是酶蛋白的側(cè)鏈基團和載休表面上的功能基團之間形成共價鍵而固定的方法。其優(yōu)點是：酶與載體結(jié)合牢固，酶不易脫落，但反應(yīng)條件較激烈，酶易失活，同時，制作手續(xù)亦較繁瑣。(1)酶分子和載體連接的功能基團從理論上講，酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團有以下幾種：①酶蛋白N—端的M—氨基或賴氨酸殘基的-氨基。②酶蛋白C-端的羧基以及Asp殘基的α-羧基和Glu殘基γ-羧基。③Cys殘基的巰基。④Ser、Tyr、Thr殘基的羥基。⑤Phe和Tyr殘基的苯環(huán)。⑥His殘基的咪唑基。⑦Trp殘基的吲哚基。在實際中偶聯(lián)最普遍的基團是：氨基、羧基以及苯環(huán)。被偶聯(lián)的基團還應(yīng)是酶活性的非必需基團，否則將導(dǎo)致酶失去活性。第20頁,共85頁，2024年2月25日，星期天(2)載體的選擇載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對載體的一般要求是:①一般親水載體在蛋白質(zhì)結(jié)合量和固定化酶活力及其穩(wěn)定性上都優(yōu)于疏水載體。②載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機械強度。③載體必須有在溫和條件與酶共價結(jié)合的功能基團。④載休沒有或很少有非專一性吸附。⑤載體來源容易．便便．并能反復(fù)使用。(3)偶聯(lián)反應(yīng)酶和載體的連接反應(yīng)取決于載體上的功能基團和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團，而且是在十分溫和的pH、中等離子強度和較低溫的緩沖液中進(jìn)行?，F(xiàn)已有許多種偶聯(lián)反應(yīng)都能制備固定化酶。這些方法在實際運用中經(jīng)濟意義起著決定性作用，必須考慮到酶的偶聯(lián)效率．固定化酶總活力，操作的簡便性以及載體與試劑的成本等因素?，F(xiàn)介紹如下：第21頁,共85頁，2024年2月25日，星期天①重氮法是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸酸處理成重氮鹽衍生物，再在中性偏堿(pH8—9)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。第22頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

可能與酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在過量重氮鹽存在下還可與酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基形成雙偶氮化合物。常用載體及其反應(yīng)如下：a.多糖類的芳香族氨基衍生物。我國獨創(chuàng)的使用對-β-硫酸脂乙砜基胺(ABSE—)多糖(纖維素，葡聚糖，文聯(lián)瓊脂糖，交聯(lián)瓊脂及淀粉)屬于此類載體。在堿性條件下用對—β—硫酸脂乙砜基胺話化多糖，制得的醚鍵連接的乙砜基苯胺衍生物，經(jīng)重氮化后偶聯(lián)酶：第23頁,共85頁，2024年2月25日，星期天b.氮基酸共聚體。如L—Leu和對氨基—DL—苯丙氨酸共聚物：待1mol/L的L—Leu和對氨基—DL—Phe的N—羧基酐的苯溶液在少量水存在及室溫下進(jìn)行反應(yīng)制成。共聚物與亞硝酸作用轉(zhuǎn)變?yōu)橹氐}，可供酶固定用。用此法制備的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。第24頁,共85頁，2024年2月25日，星期天c.聚丙烯酰胺衍生物。該類衍生物的商品名稱為bio—Gel或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，經(jīng)重氮化可固定酶。用此法制備的有氨基?；?，淀粉酶等固定化酶。第25頁,共85頁，2024年2月25日，星期天d.苯乙酰樹脂。這是聚氨基苯乙烯(a)和一種異丁烯一間一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通過重氮化后可固定酶．如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。第26頁,共85頁，2024年2月25日，星期天e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。玻璃的化學(xué)改造物多孔玻璃在丙酮中與Y—氨基丙基三氧乙烷硅回流加熱，生成烷基胺玻璃:第27頁,共85頁，2024年2月25日，星期天烷基氨玻璃用對硝基苯酚氯處理后，再還原，轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷慊苌?第28頁,共85頁，2024年2月25日，星期天此芳香基衍生物經(jīng)重氮化后與酶結(jié)合．產(chǎn)生固定化酶。第29頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

②芳香烴化反應(yīng)具有鹵素取代的芳香環(huán)或含有鹵素取代的雜環(huán)的高聚物以及含有鹵乙酰基的高聚物，可以通過烷基化、芳香基化，在堿性條件下，與酶分子上的氨基、酚基、巰基等反應(yīng)，如：

a.將纖維素在二惡烷(Diaxanc)-溴乙酸中與嗅乙酰溴反應(yīng)，形成溴乙酰纖維素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化：常用載休有鹵乙酰、鹵異丁烯衍生物，如氯乙酰纖維素、溴乙酰纖維索、碘乙酰纖維素等。第30頁,共85頁，2024年2月25日，星期天b.纖維素等載體在堿性條件下和均三氯三嗪等反應(yīng)，引入活潑的鹵素基后，能與酶的氨基、酚羥基、巰基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。

與纖維素共價結(jié)合的另一類芳香烴化功能基是3-F-4，6-二硝基苯?？刂苝H＜7，使它勺酶分子的氨基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。第31頁,共85頁，2024年2月25日，星期天c.四元縮合反應(yīng)利用四元化合物(羧酸、胺、醛和異氰酸)發(fā)生縮合反應(yīng)，形成N—取代的酰胺。在反應(yīng)中，羧酸(R1)和胺化合物(R2)形成酰胺鍵，醛(R3)和異氰酸(R4)結(jié)合形成酰胺氮的側(cè)鏈：第32頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

當(dāng)選擇適當(dāng)條件，適當(dāng)?shù)妮d體及控制反應(yīng)液中的添加物，可以使連接鍵或通過酶的氨基或通過羧基，將酶固定并免除有害反應(yīng)。例如：在乙醛和小分子的3—(二甲氨基)—丙基異氰酸存在下，用0.5mol/LHCl維持pH6.5，攪拌反應(yīng)6h，用帶氨基的聚合物，可以與酶分子的羧基偶聯(lián)。而帶—COOH的高聚物在醛和異氰酸存在下，可與酶分子的—NH2偶聯(lián)。d.巰基—二硫基交換反應(yīng)帶有—SH或二硫基的載體，通過巰基—二硫基的交換反應(yīng)，和酶分子上非必需巰基偶聯(lián)。若載體的功能基團為—SH時，可先用2，2’—二吡啶二硫化物處理，生成的二硫基中間產(chǎn)物在酸性條件下能與酶分子的巰基發(fā)生交換反應(yīng)，從而產(chǎn)生固定化酶。第33頁,共85頁，2024年2月25日，星期天此法通過小分子巰基化合物的運轉(zhuǎn)，使載體可以再生：第34頁,共85頁，2024年2月25日，星期天e.金屬偶聯(lián)法利用某些過渡金屬鹽溶液將載體(纖維素、尼龍、硼硅玻璃、濾紙及酵母細(xì)胞等)浸泡24h，洗除末反應(yīng)的金屬鹽后，制得的活化載體放入酶溶液中，即可將酶固定化。如：f.縮合反應(yīng)一些帶羧基或氨基的載體用羰二亞胺活化后，與酶分子的氨基或羧基直接偶聯(lián)，形成肽鍵，產(chǎn)生固定化酶。—般在弱酸條件下(pH4.75—5)將酶、羰二亞胺、載體同時混合，羰二亞胺與載體的羧基反應(yīng)生成活潑的O—乙酰異脲衍生物，與酶分子的氨基縮合成肽鍵或者重排為?；?。第35頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

例如以丙烯酰胺和丙烯酸共聚物為載體用縮合法制備固定化胰蛋白酶。0.95g丙烯酸用3mol/LNaOH調(diào)pH6.5，加入1.95g丙烯酰胺和0.1gN，N’—甲叉雙丙烯酰胺，再加入0.1mol/LpH6.5磷酸緩沖液，使體積為10m1，加入25mg過硫酸銨和22ulN，N，N，N’，N’—四甲基乙二胺，抽真空除氣泡，4聚合30min，壓擠成粒，攪拌下水洗．丙酮干燥備用。70g干膠在20m10.5mol/LHCl中攪拌30min，用水和O.1mol/LpH6.5磷酸緩沖液洗滌后轉(zhuǎn)至小燒杯，加入3.5ml0.1mol/LpH6．5磷酸緩沖液的8.75mg膠原蛋白酶后，攪拌5min，接著加1—環(huán)己基—3—(2—嗎啉乙基)—羰二亞胺甲基—對甲苯磺酸，連續(xù)攪拌18h，洗滌后即為固定化酶。第36頁,共85頁，2024年2月25日，星期天g.疊氮反應(yīng)帶有羧基或羥基、羧甲基等的載體，首先在酸性條件下用甲醇處理使之酯化，再用水合肼處理形成酰肼，最后在HNO3作用下轉(zhuǎn)變成疊氮衍生物。此衍生物在低溫下可與酶蛋白的羥基、酚基或巰基等反應(yīng)，但產(chǎn)物可用中性羥胺水解掉，使之僅與一NH2反應(yīng)。第37頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

此法常用載體有羧甲基纖維素、CM—Sephadex、聚天冬氨酸、BioGel.CM—100、乙烯—順丁烯二酸酐共聚物、AmberliteIRC50等。疊氮法用途較廣，舉例如下：

以CM一纖維素(CMC)疊氮衍生物為載體固定化胰蛋白酶。首先，載體的酯化與肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗滌，干燥后，懸于無水甲醇，在冰浴冷卻下通入HCl氣體，使之飽和。室溫下過夜，并重復(fù)此過程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗滌，并空氣干燥。將產(chǎn)物懸于甲醇中，加入80％水合肼，回流1h。放置過夜，過濾，再用甲醇洗滌，干燥。其次為偶聯(lián)：1gCMC酰肼和150m12％HCl在冰浴中混合，攪拌下滴加9ml%3NaNa2，冰水浴中攪拌20min。離心棄去上清液。沉淀用150m1二氧氯環(huán)洗滌．再用150m1冷的蒸餾水洗滌二次，并且懸于預(yù)冷的10ml0.05mol/LpH8．7磷酸緩沖液的胰蛋白酶溶液中，5℃攪拌反應(yīng)2—3h，用HCl凋PH4，冷0.001mol/LHCl洗三次，冷水洗一次，凍干，即為固定化酶。第38頁,共85頁，2024年2月25日，星期天j.異硫氰酸反應(yīng)含有芳香氨基的載體，在堿性PH條件下，與光氣或硫芥子氣反應(yīng)．生成異硫氰酸或異琉氰酸衍生物，可在溫和條件下與酶分子的氨基連接，產(chǎn)生固定化酶。

用含有?；B氮的載體在加熱下與HClI反應(yīng)，亦得到異硫氰酸衍生物．亦可用于固定化酶。第39頁,共85頁，2024年2月25日，星期天k.溴化氰—亞胺碳酸基反應(yīng)含有羥基的載體(如纖維素、葡聚糖、瓊脂等)在堿性條件下，載體的羥基與CNBr反應(yīng)，生成活潑的亞胺碳酸基，在弱堿條件下，可與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。第40頁,共85頁，2024年2月25日，星期天例如：用CNBr活化的瓊脂糖固定化胰蛋白酶。將Sepharose4B用蒸餾水洗凈，含0.1g干物質(zhì)的濕膠加5ml水和4ml現(xiàn)配溴化氰水溶液(25mg/m1)，攪拌下用2mol/LNaOH調(diào)pHll.0，23—25℃反應(yīng)6min，抽干立即用300ml0.1mol/LNaHCO3洗凈,(5—8min內(nèi)完成)?；罨妮d體用0.025mol/LpH10.2（含0.02mol/LCaCl2）硼酸緩沖液液快速淋洗后，用5m1緩沖液轉(zhuǎn)入燒杯內(nèi)加16mg結(jié)晶胰蛋白酶，攪拌4h，用0.1mol/LpH8.5硼酸緩沖液(內(nèi)含1mol/LNaCl)洗滌后，復(fù)用pH4.1的醋酸緩沖液洗滌，便制成了固定化胰蛋白酶。

⑩酰氯化反應(yīng)含羧基載體如羧基樹脂(AmberliteIRC—50等)，可用氯化亞砜處理，生成酰氯衍生物，與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。第41頁,共85頁，2024年2月25日，星期天m．酸酐反應(yīng)乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基與順丁烯二酸酐的共聚物，在己二胺作用下，酸酐與酶蛋白的氨基起偶聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。第42頁,共85頁，2024年2月25日，星期天．活化酯法含羧基的共聚物載體在二環(huán)己基碳二亞胺(DDC)存在下用N—羥基琥珀酰亞胺活化，產(chǎn)生活化酯，再在溫和條件下連接酶。n.含醛基高聚物多糖類如淀粉、葡聚糖、纖維素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖環(huán)，形成含醛基(每—葡萄糖產(chǎn)生兩個醛基)高聚物，可與酶蛋白氨基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。第43頁,共85頁，2024年2月25日，星期天例如：用甘蔗渣纖維素衍生物固定化木瓜蛋白酶。載體制備：60g甘蔗渣纖維素浸于500ml0.6％NaOH溶液中85℃處理30min，水洗至中性，抽干。懸浮于NaI04溶液中，空溫下攪拌12h，用水反復(fù)沖洗、抽干。置于IL脲溶液中，攪拌。產(chǎn)物用水反復(fù)洗滌，抽干后，置于12％甲醛溶液中攪拌處理12h，用水洗滌，除去過量甲醛，反應(yīng)過程如下：第44頁,共85頁，2024年2月25日，星期天加酶固定:上述載體1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.20.1mol/L磷酸緩沖液配制)攪拌下4—8℃固定18h后，用PH7.20.1mol/L磷酸緩沖液(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干，即為固定化酶。1.2.4交聯(lián)法

這是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶與載體間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以制備固定化酶的力法。最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛，其他如苯基二異硫氰、雙重氮聯(lián)苯胺-2，2’二磺酸、1，5—二氟—2，4—二硝苯、己二酰二胺甲脂等。用戊二醛交聯(lián)制備固定化酶的反應(yīng)如下：第45頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

交聯(lián)法有下列方法：

(1)交聯(lián)酶法在一定條件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。這種反應(yīng)與酶和試劑濃度、溶液PH和離子強度、溫度、反應(yīng)時間均有一定的關(guān)系。如木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白濃度、2.3％戊二醛、pH5.2—7.2、0℃下交聯(lián)24h，可形成固定化酶。其中，F(xiàn)H的影響L分明顯，隨pH升高，閉定化速度增加5pH低于4不能形成固定化酶。其中，pH的影響十分顯著，隨pH升高，固定化速度增加；pH低于4不能形成固定化酶。有人認(rèn)為pH應(yīng)控制在酶的等電點附近有利于固定化。在交聯(lián)時，加入一定量中性鹽〔如Na2SO4、（NH4)2SO4等]和丙酮等有機溶劑有助于形成固定化酶。溫度也有一定影響．如木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0℃長時間反應(yīng)，只得可溶性固定化酶，若在室溫下0一5h，即可形成不溶性固定化酶。這種情況對不同酶可能有不同結(jié)果。第47頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

這種方法也用于制備交聯(lián)的結(jié)晶酶。交聯(lián)結(jié)晶酶仍具有一定酶活力。例如：將500mg酶溶于5m10.2mol/LpH6醋酸緩沖液中，在攪拌下滴加2m12.5％戊二醛，在室溫下放置10—30min，會有沉淀析出，1—3h內(nèi)反應(yīng)結(jié)柬。形成的凝膠切碎后水洗，除多余戊二醛，即為固定化酶。(2)酶與輔助蛋白交聯(lián)法用雙功能或多功能試劑使惰性蛋白與酶共交聯(lián)．從而制備固定化酶．由于酶在交聯(lián)反應(yīng)過程中因化學(xué)修飾而引起失活，或因可得到的酶量有限時，因此，通常以一些輔助蛋白，如牛血清白蛋白、明膠、膠原、抗體等，與酶一起進(jìn)行交聯(lián)。例如：10mg脲酶與2.5ml含6％白蛋自、0.2％戊二醛的0.02mol/LpH．8磷酸緩沖液混合，冷到—30后，冉升溫至4下,放置4h將形成的泡沫聚合物徹底洗除后，凍干，即為固定化脲酶。第48頁,共85頁，2024年2月25日，星期天(3)載體交聯(lián)法是用多或雙功能試劑的一部分功能基團與載體交聯(lián)，另一部分功能基團與酶蛋白交聯(lián)而制備固定化酶的方法。例如：尼龍固定化木瓜蛋白酶的制備：尼龍布用含18.6％CaC12和18.6％水的甲醇溶液處理10min，洗凈吸干，于3.65mol/LHCl中45℃水浴中水解45min，水洗至中性，吸干，用5％戊二醛溶液(0.2mol/LpH8.5硼酸緩沖液配制)，于20℃攪拌交聯(lián)20min，用PH7.80.1mol/L磷酸緩沖液洗去多余戊二醛。2g處理載體(尼龍)加入4ml酶溶液(1mg/ml）于4—5℃下固定3h后，用0.1mol/LpH7.5磷酸緩沖液(內(nèi)含0.5mol/LNaCl)洗滌，除去多余酶液，抽干，即為固定化木瓜蛋白酶。單用戊二醛等試劑文聯(lián)制備的固定化酶活力較低，常將此法與吸附法、包埋法結(jié)合使用，可以達(dá)到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。第49頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

殼聚糖微球固定化木瓜蛋白酶制備。殼聚糖微球制備：4g殼聚糖洛于100m12％醋酸溶液，在攪拌下緩慢滴人燒杯中的透平油(酸性膠與透平油的比例為1：3)中，技4：35：1比例加入25％戊二醛溶液，再用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH9—10，置水浴(60一70℃)中3h，冷卻后，棄去上層油液，依次用石油醚、丙酮、無水乙醇、水洗滌．真空干燥備用。酶的固定化：0.5g載休于0.1mol/LpH7.2磷酸緩沖液浸泡24h，抽干，加入1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.6mL，4—8℃下吸附12h，滴入0.6％戊二醛溶液3m1．于4—8℃交聯(lián)3h后．棄去上層溶液，用0.1mol/LpH7．2磷酸緩沖液(含NaCl0.5mol/L)洗多次，吸干水分，即得固定化酶?；盍厥占s60％，在填充休反應(yīng)器內(nèi)連續(xù)水解酪蛋白(0．5％)時半衰期為16d.第50頁,共85頁，2024年2月25日，星期天另一種方法是酶交聯(lián)后再用凝膠包埋。1mg/m1(601U/m1)脲酶的0.02mol/LpH6．8磷酸緩沖液與等體積2.5％戊二醛的上述緩沖液混合，4℃反應(yīng)10h．加G1y至0.1mol/L，終止交聯(lián)，得交聯(lián)酶。lml60％丙烯酰胺和1．6％N，N’—甲叉雙丙烯酰胺與5mL上述交聯(lián)酶液混合，37℃保溫(為溶液A)。另取96mg瓊脂糖在6mL水中煮沸5min，在攪拌下冷卻至40℃(溶液B)。在溶液B中加入0.5mlN，N，N’，N’—四甲基乙二胺．3．6mg過硫酸銨，立即加入溶液A，4℃聚合30min，凝膠水洗，干燥，即為固定化酶。第51頁,共85頁，2024年2月25日，星期天1.2.3微生物細(xì)胞的固定化方法

菌體細(xì)胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋法、吸附法和不用載體法等。(1)包埋法包埋法是制備固定化細(xì)胞最常用的方法。將產(chǎn)酶菌株用包埋劑如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂、海藻酸、卡拉膠、二和三醋酸纖維、膠原、明膠和戊二醛等包埋起來，發(fā)揮酶或酶系的作用。1977年我國投入生產(chǎn)的固定化青霉素酰胺酶，是使用明膠、戊二醛包埋大腸桿茵而成。美國、歐洲和日本等大規(guī)模生產(chǎn)高果糖漿的工藝多數(shù)采用固定化菌體的酶柱工藝。包埋法制備固定化細(xì)胞與其制備固定化酶大體相似，茲舉例介紹如下。第52頁,共85頁，2024年2月25日，星期天①聚丙烯酰胺凝膠包埋法3m1細(xì)胞懸浮液，加入12m1生理鹽水和丙烯酰胺2.25g、甲叉雙丙烯酰胺O.25g、5％二甲氨基丙氰1.5ml及2.5％過硫酸銨1.5ml，在10min內(nèi)聚合，得到終濃度為15％的聚丙烯酰胺凝膠．切成3mmX3mmX3mm小塊，用蒸餾水、生理鹽水各洗二次，抽干即可。又如用聚丙烯酰胺包埋大腸桿菌(E．coliATCCll303)固定天冬氨酸酶：將大腸桿菌細(xì)胞懸浮液和單體溶液(750g丙烯酰胺和40gN．N’—中叉雙丙烯酰胺溶于2.4L水)在8℃混合后，加入100m125％(體積比)P—二甲氨丙氰和500ml1％過硫酸鉀，混勻后于20—25℃放置約5min開始聚合并升溫，當(dāng)升至30℃即用冷水冷卻，放置15—20min完成聚合。凝膠切成直徑3—4mm顆粒。再用水洗滌。約10ml凝膠相當(dāng)于1g濕細(xì)胞，酶活力約為1300—1800umol/h。若用1mmol/LMg2+和1mol/L反丁烯二酸(pH8.5)將膠在37℃保溫24—48h．酶活力可提高9—10倍。第53頁,共85頁，2024年2月25日，星期天②瓊脂凝膠包理3m1細(xì)胞懸浮液加入到20ml4％瓊脂液(45℃)中，攪拌均勻，凝固后，切成3mm×3mm×3mm小方塊，用100m1生理鹽水洗二次。③海藻酸包埋3m1細(xì)胞懸浮液加人到20ml2％CaCl2溶液中，置冰箱10h，用100ml生理鹽水洗二次。

④卡拉膠包埋法8g濕菌、8m1生理鹽水在45℃混勻；再將1.5g卡拉膠溶于3m1生理鹽水中，兩者于50℃混合后、冷至10℃，30min后．將凝膠浸于0.3mol/LKCl溶液中4h，切塊或制粒。

⑤明膠包埋法將3m1細(xì)胞懸浮液加入到200ml10％明膠液，34℃混勻冷凝后，切塊，加入20m15％戊二醛溶液，室溫下文聯(lián)1.5h，用蒸餾水、生理鹽水各洗二次。其他包埋方法還有膠原膜、四氯化鈉在水中形成的聚合的金屬氧化物沉淀及液體膜等。第54頁,共85頁，2024年2月25日，星期天(2)吸附法吸附法也分物理吸附法和離子交換吸附法①物理吸附法物理吸附法是將微生物細(xì)胞附著于固體載體上的一種固定方法。載體常用的多孔磚、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纖維等。如將酵母用聚氯乙烯或多孔磚固定化，每克載體可以固定80mg酵母；也可將固定化的釀酒酵母，裝入反應(yīng)柱，以生產(chǎn)乙醇，乙醇可達(dá)120g/L。在環(huán)境保護中用木片、石礫等固定微生物細(xì)胞作為污水處理的過濾器。物理吸附法載體與微生物細(xì)胞間不起反應(yīng)，吸附量大.但細(xì)胞極容易脫落而流失.有待于進(jìn)一步改善.②離子交換吸附法利用離子交換吸附細(xì)胞常用的載體是離于交換樹脂，例如利用陰離子交換樹脂吸附放線菌含葡萄糖異構(gòu)酶含酶菌株；用Dowea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株；用離子交換纖維素吸附無色桿菌(含頭孢霉素?；妇?以及用離子交換纖維素吸附米曲霉含轉(zhuǎn)化酶菌株等獲得成功.這種方法制備的固定化細(xì)胞，細(xì)胞易脫落，需不斷補充新細(xì)胞.第55頁,共85頁，2024年2月25日，星期天③

不用載體法這是選擇適當(dāng)?shù)臈l件，通過一定處理使酶固定在細(xì)胞內(nèi)的—種方法。如葡萄糖異構(gòu)酶是一種胞內(nèi)酶，將生物細(xì)胞加熱至60℃，10min，其他酶失活，則該酶被固定在細(xì)胞內(nèi)，所以又稱加熱固定化。又如鏈霉菌細(xì)胞用檸檬酸處理使酶固定在細(xì)胞內(nèi)，若再用殼聚糖處理，使之凝聚干燥即成固定化細(xì)胞。2輔基與輔酶的固定方法2.1輔基的固定方法對于與酶結(jié)合牢固的輔基，可以考慮在固定化酶時一般可以將輔基同時固定，但是在一些條件下．如酶蛋白與輔基結(jié)合弱而輔基容易泄露時，或者用于親和層析來分離純化相應(yīng)酶等，必須將輔基固定。輔基固定化過程是，將載體與連接臂連接，再以適當(dāng)反應(yīng)與輔基連接。裁體應(yīng)符合以下條件：第56頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

沒有非專一件吸附，具有多孔性和—定的機械強度；具有適合與臂或輔基結(jié)合的功能基團；具有化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性等.載體大多采用瓊脂糖，也使用纖維素、多孔玻璃珠或合成高分子材料等。連接臂，尚需考慮其疏水性、親水性、離子性和體積、長度等因素。選擇偶聯(lián)反應(yīng)有兩種情況：—是在不影響輔基活性條件下，引入適當(dāng)?shù)墓δ芑鶊F，如羧基或氨基等容易與載體連接；二是如果輔基分子本身具備有參與催化活性的功能基團，無須再引入功能團。如磷酸吡哆醛(胺)、FAD、FMA、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等，大都利用分子本身原有的功能基團。接著，將具有某種功能團的輔基與連接臂結(jié)合，再與活化載體結(jié)合.用瓊脂糖為載體時．有如下反應(yīng)：第57頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2.1.1溴化氰法活化載體可直接與輔基偶聯(lián)。第58頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2.1.2帶羧基載體第59頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2.1.3帶氨基載體第60頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2.1.4帶巰基或二硫基裁體第61頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2.1.5帶芳香氨基線體第62頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2.2輔酶的固定方法輔酶的固定方法主要有兩種：載體結(jié)合法和包埋法。載體結(jié)合法與捕基固定方法相似，主要用于制備親和吸附利。包埋法中，由于輔酶相對分子質(zhì)量小，先將輔酶與水溶性高分子結(jié)合，然后再來包埋。這種包埋和酶的包埋法相似。因此，輔酶固定化包括：引入一個功能基團，生成輔酶衍生物，再與水溶性高分子聚合物結(jié)合。2.2.1引入功能基團對于一些腺苷酸的輔酶，如NAD+、NADP+、CoA和ATP等，在腺嘌呤的第6位或第8位上引入氨基或羧基。其反應(yīng)分別如下：第63頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第64頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第65頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2.2.2高分子化選擇高分子化合物時，首先要考慮的是其溶解度大、分子大小適當(dāng)，既能保持在半適膜內(nèi)，又不會過大地增加粘度而影響活性；其次是，高分子大小、結(jié)構(gòu)、親水性、解離基團、結(jié)合量等都影響高分子化輔酶的活性。一般引入羧基的輔酶，用碳二亞胺縮合反應(yīng)使其與聚Lys、聚乙亞胺結(jié)合，形成水溶性高分子化合物；引入氨基的輔酶，一般用BrCN活化后，再與水溶性多糖類(如右旋糖苷)結(jié)合，而高分子化。酶反應(yīng)器中，使用高分子輔酶衍生物還有捕酶的再生問題。一般采用與主反應(yīng)共組合和獨立進(jìn)行二種方式來解決。如下頁圖：

在實踐中，許多重要的生物活性物質(zhì)或生化藥物的生物合成中，尚需輔酶參加酶反應(yīng)，所以，輔酶的固定化和固定化輔酶的再生是酶工程的一項重要任務(wù)。目前．尚未見用于工業(yè)生產(chǎn)的報道。第66頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第67頁,共85頁，2024年2月25日，星期天3動植物細(xì)胞固定化3.1植物細(xì)胞固定化

植物細(xì)胞比菌體細(xì)胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。80年代開始研究，目前一般采用吸附法和包埋法(下表)。第68頁,共85頁，2024年2月25日，星期天3.1.1吸附法吸附法是將植物細(xì)胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)。或吸附于中空纖維外壁上。如將植物細(xì)胞定置在中空纖維的外壁與容器內(nèi)壁之間，培養(yǎng)液及O2在中空維管內(nèi)流動，透過中空纖維管壁(具半透膜性)，傳遞給附著于外壁的細(xì)胞，細(xì)胞代謝產(chǎn)物亦透過外壁隨管內(nèi)培養(yǎng)液流出。利用此法固定的豌豆細(xì)胞和胡蘿卜細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)多酚化合物的研究，可連續(xù)使用1個多月。又如將洗凈、滅茵后的泡沫塑料放進(jìn)辣椒細(xì)胞培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一段時間，細(xì)胞吸附于塑料孔洞內(nèi)，并能生長繁殖。3.1.2包埋法包埋法是將植物細(xì)胞包埋于瓊脂、海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、明膠和角叉菜膠等多孔凝膠中。Brodelius等(1979)首次用海藻酸鈣包埋制備了固定化長春花細(xì)胞、毛地黃細(xì)胞、海巴戟細(xì)胞。第69頁,共85頁，2024年2月25日，星期天3.2動物細(xì)胞固定化動物細(xì)胞比菌體細(xì)胞、植物細(xì)胞更嬌嫩．需要最溫和的固定化方法。目前,動物細(xì)胞固定的方法有吸附法和包埋法兩種，其中吸附法用的最多。3.2.1吸附法由于大多數(shù)動物細(xì)胞屬于附著細(xì)胞，它們在培養(yǎng)過程中趨向于附著固體表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動物細(xì)胞。主要載體及固定方法有：(1)轉(zhuǎn)瓶法。轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成。其表面經(jīng)一定處理而帶有電荷，如用高錳酸鉀等氧化劑，強酸、強堿或紫外輻射等表而處理，可使動物細(xì)胞附著于表面，轉(zhuǎn)瓶以一定旋轉(zhuǎn)速度進(jìn)行培養(yǎng).若在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)增大表面積，可提高生產(chǎn)能力。(2)微載體法。微載體是指直徑為100—200um，相對密度接近于1.0的顆粒固定化載體。它是由表面帶有電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微載體具有較大的表面，對細(xì)胞生長和物質(zhì)傳遞特別有利，但強度不夠．易破碎，使用時間較短，已用于固定多種細(xì)胞。如用于生產(chǎn)p—干擾素、人纖溶酶原活化劑白細(xì)胞介素及各種疫苗的細(xì)胞固定化。第70頁,共85頁，2024年2月25日，星期天(3)中空纖維法中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。將細(xì)胞胞置于管外壁扣容器外殼之間，則細(xì)胞附著于外壁上，培養(yǎng)液從管內(nèi)流動，能透過管壁進(jìn)行質(zhì)熱傳遞，中空纖維起著體內(nèi)微血管的作用，有利細(xì)胞生長及其新陳代謝。已有多種中空纖維固定化細(xì)胞用于生產(chǎn)各種單克降抗體和疫苗等。3.2.2包埋法包埋法根據(jù)載體與方法不同，亦有凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種.(1)凝膠包埋法。用于動物細(xì)胞固定化的凝膠主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖蛋白等。瓊脂糖包埋法是，將1％一2.5％的瓊脂糖加熱溶解后冷至37—38℃,與一定量動物細(xì)胞混合后．分布于石蠟油中.使溫度湖37℃降至10℃左右，可得到直徑為0.1—0.3mm的微球狀固定化細(xì)胞，用于單克隆抗體、白細(xì)胞介素等的生產(chǎn)。第71頁,共85頁，2024年2月25日，星期天海藻酸鈣凝膠包埋法是，將動物細(xì)胞與一定濃度的海藻酸凝膠溶液混合均勻后，用注射器將混合液滴到一定CaCl2溶液中即成。血纖蛋白包埋法是將動物細(xì)胞與血纖蛋白混合后加入凝血酶而固定化。

(2)半透膜包埋法。利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細(xì)胞包埋．形成微囊形固定化動物細(xì)胞。例如：先用海藻酸鈣包埋動物細(xì)胞制成膠粒后，再在外面包一層聚Lys膜，然后放入檸檬酸鈉溶液中去除海藻酸鈣，便可獲得由多聚Lys包埋的動物細(xì)胞。第72頁,共85頁，2024年2月25日，星期天3.3原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體固定化，首先要制備較穩(wěn)定的原生質(zhì)體，然后用凝膠進(jìn)行包埋。（1）瓊脂多孔醋酸纖維固定法用生理鹽水配制3％一4％的瓊脂，加熱，溶解，滅菌后冷至50℃左右，勺等體積一定濃度的原生質(zhì)體混合，將混合液滴加于多孔醋酸纖維上，置冰箱冷卻凝固。（2）海藻酸鈣凝膠固定法以3％一6％海藻酸鈣溶液與等體積—定濃度的原生質(zhì)體混合，混合液滴入CaCl2溶液中，并浸泡1—2h。即成。（3）角叉萊膠固定法配制1％一8％角叉菜膠．加熱溶解，滅菌后，冷卻至50℃左右，與等體積原生質(zhì)體混合，混合液滴入一定濃度的預(yù)冷KCl中，即得球狀固定化原生質(zhì)體。（4）光交聯(lián)樹脂固定法配制30％一60％濃度的光交聯(lián)樹脂預(yù)聚體．加熱溶解后，在50℃左右加人1％光敏劉與等體積的原生質(zhì)體混合后，攤成薄層經(jīng)紫外光照射，聚合后形成小塊，制成片狀的固定化原生質(zhì)體。固定化原生質(zhì)體用于生產(chǎn)各種氨基酸、酶和生物堿等物質(zhì)以及甾體轉(zhuǎn)化等。第73頁,共85頁，2024年2月25日，星期天4固定化酶的性質(zhì)4.1固定化酶活力與其溶液酶相比，大多數(shù)固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有：酶與不溶性載體相結(jié)合引起結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；酶活性中心的重要氨基酸殘基與裁體相結(jié)合。這兩者造成的酶活力下降可以適當(dāng)條件加以克服。載體與酶結(jié)合后，酶雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻，從而使活力下降。這個影響難以克服。另外，在包埋法中，酶活性的下降可能是在酶的固定過程中有變性所致。4.1.1酶固定化效果的測定固定化酶活力測定基本上與溶液酶相似，也以反應(yīng)初速度表示．即每毫克干重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化1umol底物量或形成1umol產(chǎn)物的酶量為一個單位(umol/mg·min)，對于酶管、酶膜、酶板等，則以單位面積（cm2）的初速度來表示。4.1.2偶聯(lián)效率偶聯(lián)效率以載體結(jié)合酶量(或酶活力)的百分?jǐn)?shù)表示：第74頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

由于在偶聯(lián)反應(yīng)中酶往往會有些失活，因此，測定殘留活力還不能正確反映與載體結(jié)合的酶活力，所以，仍以測定蛋白量較為難確。在酶固定化操作中，當(dāng)酶與載體結(jié)合后，用適量適當(dāng)?shù)木彌_液淋洗固定化酶，以洗除未固定的酶，收集洗脫液，并測定其中蛋白量(或酶活力)，即為殘留的蛋白量(或酶活力)。第75頁,共85頁，2024年2月25日，星期天4.1.3活力回收和相對活力酶固定化—般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分?jǐn)?shù)稱為活力回收。第76頁,共85頁，2024年2月25日，星期天4.2固定化酶的穩(wěn)定性大多數(shù)酶在固定化后都不同程度地提高了穩(wěn)定性．延長了有效壽命。這是由于：第一，固定化增加了酶構(gòu)象的牢固程度。第二、擋住了不利因素對酶的侵襲。第三，限制了酶分子間的相互作用。但是，如果固定化觸及到酶活性敏感區(qū)域，也可能導(dǎo)致酶穩(wěn)定性下降