臨床酶學(xué)檢驗技術(shù)

臨床酶學(xué)檢驗技術(shù)

臨床酶學(xué)的實際應(yīng)用可以追溯到上世紀(jì)初，至今已有百年的歷史。到

上世紀(jì)30年代，脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMY）、堿性磷酸酶（ALP）、

酸性磷酸酶（ACP）開始用于臨床。尤其在1959年，Karmen、LaDue、

Wroblewski等人建立了分光光度法，使得丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、

門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LD）

等酶活性測定應(yīng)用于肝膽疾病、心臟疾病的診斷。他們建立的連續(xù)監(jiān)

測法和酶偶聯(lián)技術(shù)直到現(xiàn)在仍是最常用的酶活性檢測方法。酶這一生

物催化劑，在正常機(jī)體代謝中起著重要的作用。在病理情況下，尤其

一些細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)細(xì)胞損傷時會釋放到體液中造成體液中酶量或酶活

性的改變，這就是酶可作為診斷指標(biāo)的依據(jù)。因為有一些酶在不同器

官、組織、細(xì)胞內(nèi)的分布和定位存在明顯差異，而且在細(xì)胞內(nèi)外有明

顯濃度梯度差，所以酶與其它指標(biāo)相比具有更高的診斷特異性和靈敏

度，這就引起臨床病理學(xué)家和臨床醫(yī)生的極大關(guān)注，使酶學(xué)得到迅猛

發(fā)展。上世紀(jì)60年代以后，人們發(fā)現(xiàn)同工酶及同工酶亞型比總酶活

力具有更高的診斷特異性和靈敏度，使臨床酶學(xué)領(lǐng)域有了更廣闊的發(fā)

展前景。隨著免疫學(xué)和其它技術(shù)的滲透，測定酶質(zhì)量成為可能。測定

酶質(zhì)量與測定酶活性相比，可以測定無活性的酶，且不受抑制劑的影

響，因此，可以提供新的臨床信息。酶具有高效催化性和高度特異

性決定了酶作為試劑的生物化學(xué)方法具備很多優(yōu)點：如反應(yīng)條件溫

和，不需強(qiáng)酸強(qiáng)堿，不需高溫；方法特異性高，可直接測定體液中某

組分；反應(yīng)速度快；靈敏度高等等。因此，以酶試劑方法為代表的生

物化學(xué)法必將取代化學(xué)法。酶作為催化劑，在反應(yīng)前后無明顯變化，

即酶可反復(fù)使用，近年來以固相酶技術(shù)為核心的生物傳感器技術(shù)的應(yīng)

用和開發(fā)研究正如火如荼地進(jìn)行，可以預(yù)測我們將很快進(jìn)入生物傳感

器時代。

第一節(jié)酶含量的表示方法

酶具有高效催化性，極少量的酶可催化大量底物進(jìn)行反應(yīng)。理論上說,

在底物足夠和酶未失活的前提下，酶與底物孵育足夠長的時間可以產(chǎn)

生足夠量的產(chǎn)物。若檢測單位時間的產(chǎn)物或底物變化量要比直接測定

酶蛋白量顯然容易得多。這種用酶促反應(yīng)的速度來間接反應(yīng)酶含量的

方法就是通常所說的酶催化活性的測定。根據(jù)酶催化活性來表示酶含

量的方法也稱為相對定量法。"相對”的含義還包括酶催化活性易受測

定條件的影響。由于酶催化活性的測定方法簡便快速，因此絕大多數(shù)

的酶都是用此法測定。

一、酶的催化活性

(-)酶活性單位歷史上曾經(jīng)使用很多酶催化活性的"慣用單位"，

是以方法提出者的姓氏來命名的，他們根據(jù)當(dāng)時的實驗條件，提出各

自的時間單位和產(chǎn)物或底物量的單位。例如谷丙轉(zhuǎn)氨酶就有賴氏單位

(Reitman-Frankel)>金氏單位(King)、卡門氏單位(Karmen)、穆

氏(Mohun)單位等等。1963年國際生化協(xié)會酶學(xué)委員會通過廣泛討

論，提出一個國際單位(IU)來表示酶量的多少。國際單位定義：在

特定條件下，1分鐘能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物(Umol/min)的酶量為一

個國際單位。由于測定條件（如溫度）不同，所轉(zhuǎn)化底物的量將有明

顯差異。為避免臨床上誤認(rèn)為只要是同一國際單位的酶量在國際上無

論何處所測結(jié)果都相同，目前大多數(shù)實驗工作者常省略國際二字（簡

寫也由IU改為U）。幾乎都習(xí)慣用U/L來表示體液中酶活性即酶活性

濃度。1979年，國際生化協(xié)會為了使酶活性單位與國際單位SI制相

一致，提出了Katai單位，即每秒鐘轉(zhuǎn)化1個摩爾底物（mol/s）的酶

量。國際單位和katal間關(guān)系如下：

1U=1umol/min=1X10-6/60s=16.67nkatal（二）正常上限升

高倍數(shù)

酶催化活性或活性濃度是一個相對的概念，與測定方法及測定條件有

關(guān)。不同的測定方法，酶活性的結(jié)果可以相差數(shù)倍。例如，乳酸脫氫

酶用逆向反應(yīng)測得的結(jié)果是正向反應(yīng)的3倍。堿性磷酸酶的不同測定

方法之間僅僅緩沖液不同，其結(jié)果也可以相差1倍以上。即使方法完

全一致，配方也完全一致，由于試劑供應(yīng)商的原料來源不同也會造成

較大的差別，尤其是因工具酶的純度和工具酶活性單位不同而造成。

酶活性測定的影響因素如此之多，以至各實驗室之間的測定結(jié)果難以

比較，參考值也難以統(tǒng)一，給臨床醫(yī)生帶來不少麻煩。為了更直觀地

反映酶含量的變化，很多實驗室開始使用正常上限升高倍數(shù)（upper

limitsofnormal,ULN）這一表示方法。

所謂ULN是指用測得的酶活性結(jié)果除以參考范圍上限。這樣做的好

處是顯而易見的，臨床醫(yī)生可以不要因記參考值范圍而煩惱，但是對

于臨界升高的病情判斷將帶來新問題。在目前尚缺乏統(tǒng)一的校正品或

標(biāo)準(zhǔn)以前，測定方法也不能完全統(tǒng)一的前提下，使用ULN有一定的

好處，但對其臨床意義應(yīng)重新進(jìn)行評價。

二、酶蛋白質(zhì)量

酶的含量嚴(yán)格來說是指酶分子的質(zhì)量濃度，常以酶蛋白濃度來表示

（單位是g/L或mg/L）o人體體液中的酶有幾百種，但總量不超過

lg/Lo除脂肪酶（LPL）、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）、膽堿

酯酶（ChE）、銅氧化酶（CER）外，大多數(shù)酶的含量在Ug/L水平

甚至更低。要想從混合物的體液中分離純化后再測定，顯然是很困難

的。但利用酶蛋白的抗原性，制備特異性抗體后用免疫學(xué)方法可以直

接測定酶蛋白濃度。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）、銅氧化酶（即

銅藍(lán)蛋白Cp）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、前列腺酸性磷酸酶

（PACP）、CK-MB同工酶等。免疫學(xué)方法測得的是酶蛋白質(zhì)量，即

絕對含量。與酶活性相比，有很多優(yōu)點：①靈敏度高，靈敏度達(dá)到

ng/L至ug/L的水平。②特異性高，不象酶活性測定的影響因素那么

多，幾乎不受體液中激活劑、抑制劑的影響，不受藥物的干擾。③可

測定一些酶活性很難測定的酶，如不表達(dá)酶活性的酶原或脫輔基的酶

蛋白或失活的酶蛋白。④與酶活性測定一起，計算免疫比活性，有可

能為臨床應(yīng)用提供新的資料和信息。⑤在同工酶測定中，與電泳法和

層析法相比，免疫學(xué)法測定簡單快速靈敏度高，標(biāo)本量少，重復(fù)性好。

與化學(xué)抑制法相比特異性好。盡管如此，由于制備具有高效價的酶

抗體非常困難，建立免疫學(xué)方法的周期和成本都相當(dāng)巨大。因此，目

前能測定的酶類還非常有限，但這將是一個很有前途的領(lǐng)域。

第二節(jié)酶催化活性的測定方法

一、測定酶促反應(yīng)速度的兩類方法

酶促反應(yīng)速度可以用單位時間的底物消耗量(-d[S]/min)或產(chǎn)物生成

量(d[P]/min)來表示。一種直接用來測定速度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測

法，另一種在一定時間內(nèi)通過測定總變化量再計算出速度的方法稱為

定時法。

(一)定時法

定時法(Fixedtimeassay)酶活性的結(jié)果計算：假設(shè)某一樣品的酶活

性為XU/L,取樣品量Vs毫升與底物緩沖液Vr毫升孵育，經(jīng)過t分

鐘反應(yīng)，加入終止液Ve毫升，檢測到產(chǎn)物凈吸光度增加為A,該產(chǎn)

物的摩爾消光系數(shù)為￡(終點法的摩爾消光系數(shù)一般可通過帶標(biāo)準(zhǔn)

求得)比色皿光徑為bcm。

根據(jù)其中：C為產(chǎn)物的濃度，Vt為反應(yīng)總體積，，[P]為產(chǎn)物的總

變化量，產(chǎn)物生成速度樣品中酶催化能力表示為：

酶活性....................................2.1

若把A/t以△A/min表示，則此定時法測定酶活性的計算公式與連續(xù)

監(jiān)測法相同

定時法有別于終點法(end-pointassay)和兩點法(two-pointassay)。

終點法是指反應(yīng)基本達(dá)到平衡，信號變化很小，但可以不需要終止反

應(yīng)，例如化學(xué)反應(yīng)或酶試劑測定代謝物，只能說明反應(yīng)所需的某一組

分已接近耗盡。而定時法的特點是經(jīng)過一定時間(固定的時間)反應(yīng)

后終止反應(yīng)。兩點法是監(jiān)測反應(yīng)過程中的兩個點，即某一段時間內(nèi)的

底物或產(chǎn)物的變化。

（二）連續(xù)監(jiān)測法

連續(xù)監(jiān)測法（Continuousmonitoringassay）是將酶與底物在特定條件

（緩沖液、溫度等）下孵育，每隔一定時間（2-60s）連續(xù)測定酶促

反應(yīng)過程中某一底物或產(chǎn)物的特征信號（如NADH在340nm的吸光

度）的變化，從而計算出每分鐘的信號變化速率。一個典型的酶促反

應(yīng)過程一般包括延滯期（lagphase）、線性期（linearphase）和非線性

期（nonlinearphase）（見圖3-1）。

圖3-1酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線

1.延滯期對單一酶促反應(yīng)而言，是指酶促反應(yīng)開始到達(dá)最大反應(yīng)速

度所需要的時間，包括酶催化位點的暴露、底物解離后與酶結(jié)合位點

的結(jié)合、酶與輔酶的結(jié)合、酶的激活等等；對于酶偶聯(lián)反應(yīng)而言，延

滯期還包括中間產(chǎn)物堆積到一定程度后，導(dǎo)致指示反應(yīng)速度增加，直

到與待測酶酶促反應(yīng)速度達(dá)到平衡所需的時間。一般來說，輔助酶越

多，延滯期越長。

2.線性期是指酶促反應(yīng)速度保持恒定的時期，不受底物濃度的影響。

此期底物雖被不斷消耗但還不足以明顯改變酶促反應(yīng)的速度，即以初

速度進(jìn)行。初速度是指底物的消耗量小于5%時的速度。不過線性期

也僅僅是一個相對的概念，在實際工作中往往需要人為地設(shè)定非線性

度。

3.非線性期隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物消耗越來越明顯，反應(yīng)速度明顯

下降而進(jìn)入非線性期。酶濃度越高在選定條件下線性期就越短。其他

造成進(jìn)入非線性期的原因有可逆反應(yīng)增強(qiáng)、產(chǎn)物抑制增加、酶變性失

活增加、酶聚合或解離增加等等。連續(xù)監(jiān)測法根據(jù)連續(xù)測得的數(shù)據(jù),

可以只選擇線性期的底物或產(chǎn)物變化速率用于計算酶活力。而定時法

測得的酶活性是酶促反應(yīng)的整個過程中的平均速度，有可能包括延滯

期和非線性期。由于酶活性只與線性期的反應(yīng)速度（初速度）成正比

例，定時法很難避開延滯期，非線性期也不能完全避開，因此連續(xù)監(jiān)

測法測定酶活性比定時法更準(zhǔn)確。延滯期、非線性期的速率低于線性

期，所以定時法測得的結(jié)果往往偏低。自動生化分析儀能自動獲取規(guī)

定時間內(nèi)的信號，自動判斷非線性度，所以連續(xù)監(jiān)測法更適合于自動

化儀器。

連續(xù)監(jiān)測法酶活性的結(jié)果計算：假設(shè)某一樣品的酶活性為XU/L,取

樣品量Vs與底物緩沖液Vr孵育，延滯期為tO分鐘，測定間隔時間

為tl分鐘，讀數(shù)次數(shù)為n,每間隔時間吸光度變化平均值為A,該產(chǎn)

物的摩爾消光系數(shù)為￡比色皿光徑為bcm。反應(yīng)速度分別用產(chǎn)物的

生成速度和樣品中酶的催化能力來表示：

兩者含義一致，經(jīng)過整理，將（Vs+Vr）記為Vt,A/tl=AA/min,

可得到以下公式：

酶.........................................2.2

設(shè)：；酶活性（u/L）=△A/minXK...........................................2.3

2.3式就是自動生化分析儀測定酶活性需要設(shè)定K值的計算公式。

2.2式與2.1式對比，兩者完全一致。連續(xù)監(jiān)測法需要連續(xù)監(jiān)測，對

儀器要求較高，需要具有恒溫裝置和連續(xù)記錄吸光度裝置。相反，定

時法對儀器要求不高，一般的分光光度計就能滿足要求。由于一般的

光度計所測得的摩爾消光系數(shù)與理論值差別較大，在實際工作中常常

需帶標(biāo)準(zhǔn)一起測定。連續(xù)監(jiān)測法可以根據(jù)2.3式由理論的摩爾消光系

數(shù)計算出理論K值。在發(fā)表的各種酶活性測定方法中，幾乎每個酶

都有定時法和連續(xù)監(jiān)測法可供選擇，從測定準(zhǔn)確度出發(fā)，應(yīng)優(yōu)先選擇

連續(xù)監(jiān)測法。隨著自動生化分析儀的普及，連續(xù)監(jiān)測法已逐步取代定

時法，成為目前最常用的方法。

二、底物或產(chǎn)物濃度的檢測

不管是定時法還是連續(xù)監(jiān)測法，都要通過測定底物或產(chǎn)物來實現(xiàn)。測

定底物或產(chǎn)物的手段并不是酶促反應(yīng)所特有，根據(jù)在酶促反應(yīng)中任一

底物或產(chǎn)物有特征性的物理化學(xué)特性（如顏色、濁度、吸光度、pH、

氣體、熒光、放射性等等），設(shè)計一些檢測裝置。常用的檢測裝置有

比色計、濁度儀、分光光度計、熒光分光光度計、量積儀、電位滴定

儀、生物傳感器等，其中分光光度法最常用。表3-1列舉了曾經(jīng)使用

的一些檢測技術(shù)。

表3-1酶促反應(yīng)中底物或產(chǎn)物濃度的檢測

測定項目方法原理測定手段

膽堿酯酶氯化乙酰膽堿做底物產(chǎn)生乙酸根電位滴定法

脂肪酶三油酸甘油酯懸乳液做底物，生成油酸甘油一酯，濁度下降

濁度法

淀粉酶淀粉做底物，一定時間后，剩余的淀粉不足以使碘呈蘭色時

間滴定法

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶賴氏法，利用丙酮酸與2.4二硝基苯肌形成苯腺

比色法

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶IFCC推薦法，利用NADH在340nm的光吸收特

性分光光度法

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶固定化谷氨酸氧化酶膜生成過氧化氫，利用過氧

化氫電極生物傳感器

N-乙酰-氨基葡萄糖昔酶4-甲基傘形酮N-乙酰-D-氨基葡萄糖甘做底

物，

生成熒光物4-甲基傘形酮熒光

葡萄糖6磷酸脫氫酶NADPH在365nm激發(fā)下產(chǎn)生熒光熒光

三、酶活性測定方法原理

如前所述，酶促反應(yīng)速度用單位時間底物消耗量或產(chǎn)物生成量來表

示。通過底物或產(chǎn)物一些特殊的理化性質(zhì)設(shè)計檢測方法，分為直接法

和間接法：(一)直接法是指待測酶酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物有特

征性的理化性質(zhì)，然后通過特殊的儀器直接檢測。常用的原理有：

1.基于NADH或NADPH的反應(yīng)原理NADH或NADPH在340nm

處有特異吸收峰,而NAD+或NADP+只在260nm處有明顯的吸收峰,

監(jiān)測340nm吸光度變化可以反應(yīng)NADH或NADPH的變化。利用該

原理可以測定以NAD(P)+或NAD(P)H為輔酶的氧化還原酶。

例如LD、葡萄糖6磷酸脫氫酶(G-6-PD)、a-羥丁酸脫氫酶(a-HBD)、

醇脫氫酶（AD）、山梨醇脫氫酶（SD）、谷氨酸脫氫酶（GLDH）等

2.基于人工合成色素原底物反應(yīng)原理一些水解酶類或轉(zhuǎn)移酶類經(jīng)過

酶促反應(yīng)將化合物中的某一基團(tuán)水解或移去，使無顏色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

有顏色的產(chǎn)物。人們把這類底物稱為色素原底物。根據(jù)這一原理，人

們有意識地合成一系列底物用來測定酶活性，即人工合成色素原底

物，利用這類底物測定的酶見表3-2。

表3-2人工合成色素原底物與待測酶

人工合成色素原底物待測酶產(chǎn)物的毫摩爾吸光系數(shù)

4-硝基磷酸酚鈉鹽（PNPP-Na2）堿性磷酸酶（ALP）4-硝基酚PNP

（405nm）18.5

3-竣基-丫谷氨酰對硝基苯胺Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）5-氨基-2-

硝基苯甲酸

（405nm）9.87,pH為8.10

2-氯-硝基苯-a-半乳糖-麥芽糖甘淀粉酶（AMS）2-氯酚2-CP

（405nm,pH6.0）6.1

2-氯-硝基苯-a-巖藻糖昔a一巖藻糖昔酶（AFU）2-CP（405nm,

pH6.5）6.2

甘氨酰脯氨酰-對硝基苯胺-對甲苯磺酸甘氨酰脯氨酸二***氨基***

酶（GPDA）對硝基苯胺4NA（405nm）9.88

3.基于氧的消耗氧化酶在催化反應(yīng)時會不斷消耗氧氣，可以設(shè)計氧

電極來連續(xù)監(jiān)測氧的消耗速度。

4.其他膽堿酯酶催化乙酰膽堿產(chǎn)生乙酸，造成pH下降，可以用pH

差示法測定膽堿酯酶。脫竣酶在反應(yīng)過程中產(chǎn)生CO2,可以用量積法

測定。（二）間接法是指酶促反應(yīng)底物和產(chǎn)物之間沒有特征性的

理化性質(zhì)，需通過另一個化學(xué)反應(yīng)或生化反應(yīng)，將底物或產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為

有明顯特征理化性質(zhì)的另一個化合物。用直接法來測定的酶類非常有

限，很多情況下不得不使用間接法。

1.化學(xué)法大多數(shù)定時法都是在酶促反應(yīng)終止后加入另一個試劑與底

物或產(chǎn)物反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為有色化合物，再用分光光度法檢測。也有個別

酶類不終止反應(yīng)，加入與酶促反應(yīng)無關(guān)的試劑，但能與酶促反應(yīng)的某

一產(chǎn)物反應(yīng)生成有特征性的化合物。例如：①膽堿酯酶催化酰基硫代

膽堿類底物后，生成的硫代膽堿（SCh）與5,5-二硫代-雙（2-硝基

苯甲酸）（DTNB）反應(yīng)，生成黃色陰離子5-筑基2硝基苯甲酸

（5-TNBA）。②酸性磷酸酶測定，利用a-蔡酚磷酸鹽做底物，經(jīng)酸

性磷酸酶水解后釋放蔡酚，與試劑中的固紅TR發(fā)生偶氮反應(yīng)，生成

黃色化合物。

2.酶偶聯(lián)法在酶活性測定時，常采用另一個（指示酶）或幾個酶（輔

助酶和指示酶）將測定酶的某一產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為新的產(chǎn)物，當(dāng)其他酶的反

應(yīng)速度與待測酶反應(yīng)速度達(dá)到平衡時，可以用指示酶的反應(yīng)速度來代

表待測酶的活性。可以表示為：

Ex為待測酶，Ea為輔助酶，Ei為指示酶，指示酶是指能監(jiān)測反應(yīng)速

度的酶，輔助酶在酶偶聯(lián)反應(yīng)中可以一個或多個，也可以不需要輔助

酶。由于NAD（P）+或NAD（P）H在340nm的光吸收特性，很容

易進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，因此它是最常用的指示反應(yīng)，過氧化物酶（POD）

也可做指示酶。表3-3例舉了需要指示酶的酶偶聯(lián)方法來測定酶活性

表3-3用酶偶聯(lián)方法來測定的酶

待測酶測定方法輔助酶指示酶

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶IFCC推薦法無LD

門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶IFCC推薦法LD*MD

肌酸激酶IFCC推薦法HKG6PD

5,-核昔酸酶5,-AMP做底物

ADA-GLDH法腺昔脫氨酶ADAGLD

淀粉酶EPS底物法無多功能a-葡萄糖甘酶

脂肪酶GK-GPO-POD法GK、GPO、共脂肪酶POD

5,-核甘酸酶5,-IMP做底物

NP-XOD-POD法核昔磷酸化酶（NP）

黃喋吟氧化酶（XOD）POD

*LD并不是真正意義上的輔助酶。

第三節(jié)酶活性測定的影響因素與最適條件的確定

一、方法因素的影響

（一）正向反應(yīng)與逆向反應(yīng)選擇正向反應(yīng)還是逆向反應(yīng)，并不是

隨心所欲。一般根據(jù)測定底物或產(chǎn)物的難易程度來決定。原則上選擇

對底物親和力大，酶轉(zhuǎn)換率高的方向。當(dāng)然，還應(yīng)考慮內(nèi)源性干擾、

底物價格和穩(wěn)定性等諸多因素。肌酸激酶就是一個很好的例子，因其

逆向反應(yīng)是正向反應(yīng)的6倍，而且不受ATP酶、ALP、內(nèi)源性丙酮

酸干擾，所以，目前普遍采用逆向反應(yīng)。但是，乳酸脫氫酶的測定選

擇正向或逆向反應(yīng)，目前尚有爭議。國內(nèi)多采用正向反應(yīng)（L-P）,

與IFCC在2001年發(fā)表的操作手冊一致。理由是經(jīng)常被組合在心肌

酶譜中，正向反應(yīng)有利于LD1的活性表達(dá)，有更高的診斷敏感性，

試劑穩(wěn)定性好。而以前國外常用方法卻是逆向反應(yīng)（P-L）,理由是

反應(yīng)速度是正向的3倍，而且試劑成本低廉，雖然NADH價格高昂

但用量很少。

（二）檢測底物或檢測產(chǎn)物

同樣，選擇測定底物或產(chǎn)物的方法主要取決于哪個更方便。原則上應(yīng)

選擇測定產(chǎn)物的生成量而不是底物的消耗量。為了讓全部的酶能夠與

底物結(jié)合，底物量往往很高，而且酶促反應(yīng)測定的是初速度，時間較

短。若測定底物的消耗量（起始底物濃度-剩余底物濃度）一方面要

求起始底物濃度不能太高，另外在很短的時間內(nèi)，底物的消耗并不明

顯，測定誤差大。而測定產(chǎn)物因為產(chǎn)物從無到多，檢測敏感度必然增

加。這也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐漸被色素源底物所取代的原因之

-o除了測定NADH減少可以看成測底物的消耗量外，已很少項目

采用測定底物消耗量。若有兩個以上產(chǎn)物，選擇測定哪個產(chǎn)物，也要

從測定的方便性、內(nèi)源性干擾等方面綜合考慮。例如ALT催化下列

反應(yīng)：

丙氨酸+a-酮戊二酸——■*谷氨酸+丙酮酸

既可以測定谷氨酸的生成速度，也可以測定丙酮酸的生成速度，IFCC

推薦法是測定后者。從理論上講，測定谷氨酸也是可行的。可以偶聯(lián)

谷氨酸脫氫酶，測定NADH在340nm的增加速度。反應(yīng)式如下:

谷氨酸+NAD+——fa-酮戊二酸+NH3+NADH

但是該法至少有以下缺點：①a-酮戊二酸作為待測酶ALT的底物又

是指示酶GLDH的產(chǎn)物。根據(jù)待測酶對底物的要求，a-酮戊二酸的

用量往往較大，這樣對于指示反應(yīng)來說是極其不利的，過量的a-酮

戊二酸肯定會抑制指示酶的反應(yīng)速度，結(jié)果使延滯期延長，指示酶用

量必須加大。②待測酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的最適pH與指示酶谷氨酸

脫氫酶最適pH相差較大，要快速達(dá)到平衡，也需要增加指示酶的用

量。而待測酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與乳酸脫氫酶的最適pH接近。③內(nèi)

源性干擾問題。IFCC推薦法測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶存在內(nèi)源性的丙

酮酸干擾，但是，內(nèi)源性谷氨酸的干擾更常見。綜合以上因素，通常

測定丙酮酸的生成速度而不是測定谷氨酸的生成速度。不過，生物傳

感器的方法是通過測定谷氨酸的生成速度，原因是氨電極的技術(shù)比較

成熟。

（三）定時法與連續(xù)監(jiān)測法

如前所述，連續(xù)監(jiān)測法可以選擇線性期的反應(yīng)速度（初速度）來計算

酶活性，因此，測定結(jié)果更可靠，而且一般不需做樣品空白，干擾相

對較小，是首選的方法。但儀器要求相對較高，在我國基層單位還經(jīng)

常使用定時法。在不具備分析儀的單位，某些酶采用定時法測定也

可以得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果。例如：堿性磷酸酶的測定就是一個典型的

例子。IFCC推薦法以4-硝基磷酸酚鈉鹽（PNPP-Na2）為底物，以

2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP）做緩沖液。由于①該法延滯期短，小

于1分鐘；②線性期長，400U的樣品，線性期可達(dá)15分鐘；③產(chǎn)物

對硝基酚有標(biāo)準(zhǔn)品供應(yīng)，④終止液NaOH不會對產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)

有影響。因此，很容易在酶促反應(yīng)條件不變的情況下，將連續(xù)監(jiān)測法

改為定時法。兩法的結(jié)果準(zhǔn)確性相當(dāng)，唯一的缺點是需加做樣品空白。

（四）底物啟動模式與樣品啟動模式底物啟動模式是指樣品先與部

分試劑（缺乏某個底物）預(yù)孵育一定時間，然后加入這個底物，樣品

中的待測酶酶促反應(yīng)才開始啟動。這樣做的好處是在待測酶酶促反應(yīng)

開始之前，可以除去某些干擾物，包括內(nèi)源性干擾物和外源性干擾物。

需要雙試劑劑型，IFCC推薦法多采用底物啟動模式。而樣品啟動模

式是指反應(yīng)所需的試劑先混合在一起，然后加入樣品，依靠樣品中的

待測酶來啟動酶促反應(yīng)，只是在延滯期去除部分干擾物，可采用單一

試劑劑型，需要注意的是某些雙試劑劑型是基于試劑穩(wěn)定性考慮，并

沒有將底物單獨作為第二試劑，也起不到消除內(nèi)源性干擾的作用。

二、測定條件的影響與最適條件的確定

酶的催化活性只與酶促反應(yīng)的最大速度成正比例，推導(dǎo)如下：

酶促反應(yīng)的整個反應(yīng)過程可簡化為：

式中Kp可看成為ES的解離常數(shù).Michaelis和Menten通過推導(dǎo)可得

出下式：

此式中V為最大反應(yīng)速度，，為米氏常數(shù)。上式也可改寫為:

在底物[S]?Km時;Km值由于相對很小可忽略不計:

由于底物網(wǎng)濃度很大，使酶飽和。ES已達(dá)極限，反應(yīng)速度不再增加，

故此時反應(yīng)速度為最大反應(yīng)V。

此時反應(yīng)速度才和酶量E成正比例。也只有在此基礎(chǔ)上建立起來的測

定方法才是可靠的、準(zhǔn)確的。

國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(IFCC)和不少國家包括我國的一些學(xué)會建立

了測定酶活性濃度的推薦或參考方法。都毫無例外地提出酶活性濃度

測定方法所選擇的測定條件應(yīng)是酶反應(yīng)的"最適條件"。所謂最適條件

是指能滿足酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度所需的條件。包括：①合

適的底物和最適底物濃度；②理想的緩沖液種類和最適離子強(qiáng)度；③

反應(yīng)液的最適pH；④最適反應(yīng)溫度；⑤合適的輔因子、激活劑濃度;

⑥若是酶偶聯(lián)反應(yīng)，還需要確定指示酶和輔助酶的用量；⑦合理的測

定時間，包括延滯期盡量短暫，有足夠的線性期；⑧合適的樣品與反

應(yīng)試劑的比例；⑨足夠的檢測范圍；⑩盡量去除各種抑制劑等。

(-)底物種類和濃度

1.底物種類的選擇不同酶對底物的專一性有很大的區(qū)別。丙氨酸氨

基轉(zhuǎn)移酶對底物有立體結(jié)構(gòu)選擇性，只能催化L型丙氨酸。若選擇

DL丙氨酸，要達(dá)到同樣的反應(yīng)速度，則需2倍于L型丙氨酸的用量。

對于這些特異性很高的酶而言，選擇底物的種類比較簡單。但對于一

些特異性較差的酶來說，底物種類的選擇必須要有理論依據(jù)。例如堿

性磷酸酶是一組非特異的磷酸酯酶，能將磷酸鹽從一個化合物轉(zhuǎn)移到

另一個化合物。歷史上用于堿性磷酸酶的底物有：B-甘油磷酸鈉、

磷酸苯二鈉、蔡酚磷酸鹽，而目前使用最多的是人工合成底物對硝基

酚磷酸鹽。底物選擇的原則是：（1）選擇Km最小的底物：最好是

酶的天然底物，要使酶達(dá)到同樣反應(yīng)速度的底物用量最低，不受溶解

度和價格的限制。

（2）要有足夠的溶解度：例如GGT測定，過去用Y-L-谷氨酰對硝

基苯胺做底物，由于它溶解度差而被Y-L-谷氨酰-3-竣基對硝基苯胺

所取代。

（3）酶對底物特異性高：例如淀粉酶的測定，以2-氯-4-硝基酚-麥芽

三糖甘做底物，不需要偶聯(lián)酶可以直接測定淀粉酶，但因為它也是體

內(nèi)a-葡萄糖甘酶的底物而不能成為淀粉酶測定的參考方法。若以2-

氯-硝基苯-a-半乳糖-麥芽糖昔做底物，就不會被a-葡萄糖甘酶所催

化，也不需偶聯(lián)酶，可以直接測定淀粉酶。

（4）底物穩(wěn)定性好：例如用于淀粉酶測定的人工合成底物很多，但

都存在一個共同的缺點，即底物本身可以自發(fā)水解。淀粉酶測定的參

考方法-亞乙基封閉的對硝基酚麥芽庚糖普做底物（EPS法）的優(yōu)點

就是底物的穩(wěn)定性好。

另外，也要考慮選有較高臨床價值的底物。例如臨床上測定酸性磷酸

酶主要目的是診斷前列腺癌，所選的底物應(yīng)對前列腺酸性磷酸酶有較

高的特異性。在常用的底物中以麝香草酚磷酸鹽最合適。乳酸脫氫酶

幾乎存在于全身各個組織，對臟器疾病的診斷特異性不高。對底物的

選擇性也不高，除丙酮酸外，a-酮丁酸也是它的底物。a-羥丁酸脫

氫酶測定實質(zhì)上就是以a-羥丁酸做底物，反映乳酸脫氫酶的H亞基

的活性。

2.底物濃度的確定（1）單底物酶促反應(yīng)：根據(jù)Michaclis-Menten

方程很容易得出以下結(jié)論：在反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度V一半時，[S]

=Km,此時的底物就相當(dāng)于酶的米氏常數(shù)Km。以mol/L表示之，

大多數(shù)酶Km在10-3至10-5mol/L之間；若[S]=10Km,則反應(yīng)速度

達(dá)到最大反應(yīng)速度的90.9%；若兇=20Km,則反應(yīng)速度達(dá)到最大反

應(yīng)速度的95.2%；只有當(dāng)時無窮大時，反應(yīng)速度才達(dá)到最大反應(yīng)速度,

這在實際工作中是不可能的。因此，底物濃度的確定原則是選擇兇

=10Km?20Km,此時反應(yīng)速度基本達(dá)到最大反應(yīng)速度，測定的誤差

可以接受。某些水解酶如堿性磷酸酶測定，由于另一底物是水，可以

按單底物酶促反應(yīng)看待。

（2）雙底物酶促反應(yīng)：雙底物酶促反應(yīng)動力學(xué)與單底物相比更復(fù)雜，

可以分為乒乓機(jī)制、序列有序機(jī)制和隨機(jī)機(jī)制等，底物濃度的確定以

動力學(xué)方程為基礎(chǔ)。有關(guān)動力學(xué)方程可以參考相關(guān)論著。所有雙底物

酶促反應(yīng)的動力學(xué)方程可以用下式表示：

F是指v/V,即反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的程度，一般要求90%?

95%,Ka、Kb分別代表兩個底物的米氏常數(shù)，在反應(yīng)條件確定時，

是個常數(shù)。[A],[B]是兩個待確定的變量，分別代表兩種底物的濃

度，K值在乒乓機(jī)制是常數(shù)1,在其他機(jī)制是變量但接近于1,在實

際工作中為了方便，可以認(rèn)為是常數(shù)1。如果規(guī)定F的值，那么:

也就是說之間的關(guān)系是一條雙曲線，有無數(shù)組數(shù)據(jù)。在實際工

作中，可綜合價格、溶解度等因素，先確定其中一個底物的用量，再

求出另一個底物的用量。

以上所述的底物選擇原則在實際工作中有一定的指導(dǎo)意義，但是需要

注意，酶促反應(yīng)很復(fù)雜，可逆反應(yīng)，產(chǎn)物抑制，其他激活劑和抑制劑

的存在都影響著最適底物濃度的確定。

（二）緩沖液種類、離子強(qiáng)度和最適pH

為了酶與底物很好的結(jié)合，酶和底物都需要合適的解離狀態(tài)。酶催化

基團(tuán)作用的發(fā)揮也需要酶、輔助因子的有效解離，酶的穩(wěn)定性也需要

合適的環(huán)境。這一切都離不開緩沖液的作用。一個酶促反應(yīng)的表現(xiàn)很

大程度上依賴于緩沖液的選擇是否恰當(dāng)。依據(jù)緩沖液對酶活性的影響

可將緩沖液分為活性緩沖液、惰性緩沖液和抑制緩沖液三大類。

在一系列不同pH的最終反應(yīng)體系中，酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大時的pH

稱為最適pHo一般來說，血清中大多數(shù)酶最適pH接近中性。有些

酶在最適pH附近活性變化非常顯著，但多數(shù)酶在一定pH范圍內(nèi)相

對穩(wěn)定。測定酶活性時一定要選擇在最適pH處。最適pH并非是酶

的特征性常數(shù)，易受多種因素影響而改變，如緩沖液種類、底物濃度、

反應(yīng)溫度、樣品與反應(yīng)試劑的比例、各種防腐劑和其它添加劑等等。

緩沖液的離子強(qiáng)度也影響著酶的活性，一般選擇與生理環(huán)境的體液比

較接近的離子強(qiáng)度。Allert曾擬定了一種作用模式，并進(jìn)行數(shù)學(xué)計算,

得出相應(yīng)方程式來說明反應(yīng)體系中電解質(zhì)會影響最大反應(yīng)速度。結(jié)論

是：離子強(qiáng)度越高，電解質(zhì)干擾酶和底物結(jié)合，酶活性將逐步下降，

但離子強(qiáng)度過低也會抑制酶活性。緩沖液的離子強(qiáng)度在堿性磷酸酶測

定中是個特例。按IFCC推薦法規(guī)定，以2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP）

做緩沖液，緩沖液濃度高達(dá)O.85mol/L,這在酶類測定方法學(xué)中極其

罕見。其理由是：AMP是作為磷酸轉(zhuǎn)移作用中的磷酸基受體，不僅

僅起到緩沖作用，還有類似底物的作用。

理想的緩沖液應(yīng)具備以下條件：①有足夠的緩沖容量，較低的離子強(qiáng)

度就可以維持pH的恒定。緩沖液的pKa與最適pH越接近，緩沖容

量越大。有酸堿的產(chǎn)生或消耗的酶促反應(yīng)，對緩沖容量的要求更高。

②純度高，不含有抑制酶活性的雜質(zhì)。③溫度依數(shù)性小，受溫度波動

pH變化小。④對酶活性表達(dá)有促進(jìn)作用則更好。盡量選擇活性緩沖

液或惰性緩沖液，不可選擇抑制型緩沖液。⑤對酶有穩(wěn)定作用。

目前酶制劑中或測定體液中酶活性方法使用最多的是GOOD氏系列

緩沖液。其它常用的緩沖液有三羥甲基氨基甲烷（Tris）、三乙醇胺

（TRA）、二乙醇胺（DEA）、2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP）,而磷酸

鹽緩沖液已越來越少使用，甘氨酸緩沖液對酶有抑制作用，已幾乎不

在使用。

值得注意的是，緩沖液都有溫度依數(shù)性，配制緩沖液時不僅要指出其

pH值，還應(yīng)說明配制溫度，以避免因溫度不同而引起的誤差。

由于最適pH不是酶的特征性常數(shù)，在實際工作中一般做法是，先確

定大致的最適pH,再確定緩沖液的種類，最后重新確定最適pH。

（三）反應(yīng)溫度

溫度越高，反應(yīng)活化能越大，酶與底物結(jié)合的機(jī)會越多，反應(yīng)速度越

快。但是，溫度增高，酶的變性失活就會增加，不同酶的最適溫度可

以不同，至今，對酶活性的測定溫度還未統(tǒng)一。目前常規(guī)實驗室越來

越多的使用37℃,這更多地是從實際工作方便來考慮。因為溫度越

高，反應(yīng)速度越快，靈敏度越高，延滯時間和測定時間都可能縮短，

有利于提高工作效率。尤其目前在常規(guī)實驗室中廣泛使用全自動生化

分析儀，有高效率的恒溫系統(tǒng)，使反應(yīng)系統(tǒng)很快升溫并維持在37℃,

可避免溫度差異引起的誤差。對于生化分析儀而言，每個酶測定的溫

度不同是不現(xiàn)實的。值得注意的是，在比較不同實驗室測定結(jié)果時，

一定要注意溫度不同帶來的差異。

在1986年以前IFCC推薦酶活性測定的溫度是30℃,優(yōu)點是能保

證一定的反應(yīng)速度，又不使酶失活，而且純錢的熔點為29.77C,錢

作為此溫度的基準(zhǔn)物質(zhì)。保證了測定儀器在30C的高度準(zhǔn)確性。

2001年IFCC正式發(fā)表了"37C下檢測酶催化活性濃度的IFCC一級

參考方法操作手冊和參考制品認(rèn)可系統(tǒng)"，包括CK、LD、ALT、AST、

GGT五個酶在內(nèi)。

（四）輔酶、輔基和激活劑

根據(jù)酶催化反應(yīng)最適條件的要求，原則上在酶測定體系中應(yīng)加入

一定量的輔助因子。輔助因子（cofactors）是指酶的活性所需要的一

種非蛋白質(zhì)成分，包括輔酶、輔基和金屬離子激活劑。與酶緊密結(jié)合

的輔因子稱為輔基；不含輔基的酶蛋白稱為脫輔基酶蛋白

(apoenzyme),沒有催化活性，必須加入足量輔基，和它結(jié)合成為全

酶(holoenzyme),才有催化活性。脫輔基酶蛋白與輔基孵育一段時

間后，酶活性才會恢復(fù)，因此，往往需要樣品與試劑中的輔基先預(yù)孵

育的過程。輔基的用量往往較少。

與酶蛋白結(jié)合很松弛，用透析和其它方法很易將它們與酶分開的稱為

輔酶(Coenzyme)。輔酶盡管不同于酶的底物，但在作用方式上和底

物類似，在酶反應(yīng)過程中與酶結(jié)合、分離及反復(fù)循環(huán)。輔酶用量的確

定可將它們按底物處理。例如乳酸脫氫酶中輔酶按雙底物動力學(xué)方程

計算。

激活劑(activator)的化學(xué)本質(zhì)是金屬離子，可以是酶的活性中

心，也可以通過其他機(jī)制激活酶的活性。作為激活劑的金屬離子，其

影響酶促反應(yīng)的動力學(xué)更加復(fù)雜。最常見的是二價金屬離子如Mg2+、

Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等。重金屬離子大多是酶的變性劑。金屬

離子之間往往存在相互拮抗或相互抑制。在酶測定體系中經(jīng)常加入

EDTA目的是螯合一部分非必要的離子。合適的金屬離子濃度是必要

的，過量的離子往往抑制酶反應(yīng)速度。由于激活劑的動力學(xué)往往與酶

的動力學(xué)不同，這就可以解釋不同的樣品與反應(yīng)液的比例，造成酶活

性測定結(jié)果的不呈比例。N-乙酰半胱氨酸對肌酸激酶的激活作用與此

類似。激活劑的用量一般通過反復(fù)實驗來確定。(五)抑制劑

酶活性測定過程中最常見的抑制劑有產(chǎn)物的抑制、底物的抑制，分析

器材或試劑中的重金屬及體液中的藥物等造成的抑制。抑制類型也可

以各種各樣，可以是可逆抑制，也可以是不可逆抑制。按最適條件的

要求，不管哪種抑制，都要盡量去除。采取的措施包括：選用高純度

的原料、高純凈水、器材干凈，在反應(yīng)液中加入金屬螯合劑，甚至可

以引入一個副反應(yīng)來去除產(chǎn)物的抑制作用。

（六）酶偶聯(lián)法中輔助酶、指示酶

酶偶聯(lián)反應(yīng)原理：酶偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)模式如下：

對于待測酶Ex,反應(yīng)條件要求滿足最適條件。反應(yīng)開始后，經(jīng)過一

個短暫的延滯期，不斷地產(chǎn)生中間產(chǎn)物B,啟動輔助酶反應(yīng)Ea,同

樣經(jīng)過一個延滯期，產(chǎn)生中間產(chǎn)物C,最后啟動指示反應(yīng)Ei。由于在

最初的反應(yīng)體系中，中間產(chǎn)物B和C的量幾乎為零（不考慮內(nèi)源性

存在），此時輔助酶和指示酶的反應(yīng)速度很小。但是，它們的最大反

應(yīng)速度卻很大（由試劑中加入的酶量來決定），甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于待測酶

的最大反應(yīng)速度。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，中間產(chǎn)物B和C的量逐漸增加，

輔助酶和指示酶的反應(yīng)速度也相應(yīng)增加，直到輔助酶和指示酶的反應(yīng)

速度達(dá)到待測酶的反應(yīng)速度，即進(jìn)入動力學(xué)的線性期，并會維持一定

時間，在此之前的時間稱為延滯期。此時，Vx=va=vi,va和vi是輔

助酶和指示酶此時的有效反應(yīng)速度，并不是它們的最大反應(yīng)速度。這

樣我們就可以監(jiān)測產(chǎn)物D的生成速度或中間產(chǎn)物C的消耗速度，既

vi來反映Vx,求出待測酶的酶活性。

1.指示酶、輔助酶的種類指示酶和輔助酶選擇的依據(jù)是：①考慮特

異性，尤其是指示酶，如果指示酶存在副反應(yīng)，則使測定酶的結(jié)果假

性偏高。②考慮輔助酶的數(shù)量，減少輔助酶就可以縮短延滯期。③酶

偶聯(lián)反應(yīng)的合理性，如能直接與指示酶偶聯(lián)，就沒有必要加入輔助酶。

④所選用的指示酶、輔助酶應(yīng)盡量選擇Km小的酶，可以縮短延滯期。

⑤考慮指示酶、輔助酶的最適條件（尤其是最適pH）盡量與測定酶

的"最適條件"接近。整個體系的測定條件必須以測定酶為準(zhǔn)。⑥還需

考慮價格、來源和純度及酶的穩(wěn)定性。來源不同的酶，Km有明顯差

別，甚至輔酶也不同，耐熱性也有很大的區(qū)別，酶試劑的質(zhì)量很大程

度上取決于工具酶的來源。

2.指示酶、輔助酶的濃度確定輔助酶或指示酶用量不足的后果是延

滯期延長，待測酶的可測范圍變窄，嚴(yán)重時不出現(xiàn)線性期。輔助酶或

指示酶用量過大，成本增加，雜酶的干擾程度增加。所以在酶偶聯(lián)測

定法中，選用適當(dāng)量的工具酶是一個重要的問題。一般可用反復(fù)試驗

法，即試驗性地選用不同量的工具酶直到偶聯(lián)酶反應(yīng)中指示酶反應(yīng)速

度不隨工具酶的增加而升高，并在所選用?quot;最適條件"下，延滯期

合適，有足夠的線性期，待測酶上限符合臨床要求，酶濃度曲線線性

關(guān)系好等。

很多專業(yè)書籍還介紹了一些酶用量的估算方法，這在實際工作中有一

定的指導(dǎo)意義。但是應(yīng)考慮到酶供應(yīng)商的單位定義和測定方法之間是

否存在差別，而且酶在運輸保存中會有酶活性的喪失，測定體系中的

其它條件如緩沖液、保護(hù)劑等都會影響酶的用量。實際用量往往比最

適用量增加1倍以上。

（七）延滯期、線性期的確定

在以上條件都確定以后，動力學(xué)特征和方法的性能基本確定。動力學(xué)

特征包括延滯期、線性期和非線性期。延滯期可以因酶在樣品中所存

在的介質(zhì)不同而略有差別，原因可能是存在內(nèi)源性干擾物，也可能存

在一些抑制劑。延滯期的確定原則是多觀察兒例濃度不等、病理情況

不同的標(biāo)本，選擇延滯期最長者作為確定值。

線性期的確定離不開酶濃度的可測上限，因為酶濃度越高，在同樣時

間內(nèi)消耗底物越多，產(chǎn)生產(chǎn)物越多，底物的不足和產(chǎn)物的抑制將導(dǎo)致

非線性期的提前到來。不過也與非線性度的大小有關(guān)，沒有絕對意義

上的線性期，線性期是以指定的非線性度作為判斷基礎(chǔ)的。線性期如

何確定呢？主要看讀數(shù)次數(shù)和讀數(shù)間隔來決定，為了計算非線性度，

按最小二乘法的計算要求，讀數(shù)次數(shù)應(yīng)不少于4次，讀數(shù)間隔按一般

儀器要求30秒就足夠了，線性期在2分鐘以上即可。中華醫(yī)學(xué)會檢

驗學(xué)會規(guī)定酶活性測定要求線性期不短于2.5分鐘。若規(guī)定線性期不

短于2.5分鐘可以測得酶活性的最高濃度就是該法的測定上限。

（A）樣品與試劑比例

樣品量與反應(yīng)液總量的比例與方法檢測的靈敏度和檢測上限有關(guān)，與

測定誤差也有關(guān)。根據(jù)酶活性計算公式不難看出，改變樣品與反應(yīng)液

總量的比例就可以改變K值。按儀器噪音0.001計算，K值不易過大,

否則會造成檢測誤差加大。

值得注意的是酶活性的發(fā)揮與介質(zhì)有關(guān)，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)改變樣品與反應(yīng)液

總量的比例，測定結(jié)果并不會成正比例地改變，可能與激活劑、抑制

劑、酶的解聚和聚合、酶的穩(wěn)定性等因素有關(guān)。因此，樣品與反應(yīng)液

總量的比例一旦選定，就不能隨意更改。從以上分析中不難看出：

酶促反應(yīng)的影響因素很多，各因素之間有相互影響相互制約，沒有絕

對的"最適條件"，但只要按照最適條件的目標(biāo)，在建立方法時，努力

靠近最適條件，必將縮小方法之間、試劑之間的差別。

三、其他因素對測定結(jié)果影響

(一)儀器不同的儀器，波長的設(shè)置有區(qū)別，帶寬有區(qū)別，比

色杯的透光性在使用過程中也會發(fā)生改變，這些都直接影響儀器對待

測物的摩爾吸光系數(shù)，也就影響K值的準(zhǔn)確性。最好定期檢查儀器

的摩爾吸光系數(shù)。K值的設(shè)置還需考慮稀釋體積、比色杯的光徑、副

波長的影響等。

(―)校準(zhǔn)物

可用作酶活性測定用的校準(zhǔn)物分兩類。一類是產(chǎn)物的基準(zhǔn)物質(zhì)，如對

硝基酚、對硝基苯胺等，可用于校準(zhǔn)儀器的摩爾吸光系數(shù)。產(chǎn)物NAD

(P)H的摩爾吸光系數(shù)可以用葡萄糖測定試劑(己糖激酶法)來校

正。若用雙波長測定則只適用于該雙波長。另一類稱酶校準(zhǔn)物

(Enzymecalibrator),多是用人血清或動物血清作介質(zhì)，與測定標(biāo)本

比較接近。國際上已經(jīng)有5個經(jīng)IFCC認(rèn)可的CRM酶參考物。各試

劑供應(yīng)商所提供的酶校正物的定值應(yīng)可溯源至CRM酶參考物。在實

際工作中，使用酶校正物的優(yōu)點有：①可以縮小因試劑配方差異造成

的誤差。如因保護(hù)劑、原料來源不同等造成的差異。②可以校正在試

劑穩(wěn)定性稍有改變造成的誤差。③可以校正儀器的某些系統(tǒng)性誤差。

如波長帶寬、溫度、加樣誤差等。但是它無法補(bǔ)償分析系統(tǒng)的特異性

缺陷和精密度缺陷，而且在不同的檢測系統(tǒng)應(yīng)有不同的校正物。

（三）實驗參數(shù)實驗參數(shù)的正確理解和編制對測定結(jié)果也有很

大的影響。樣品量、試劑量、延滯期、測定時間、K值等都是很關(guān)鍵

的參數(shù)。對于色素原底物的方法，由于底物的自身水解作用，應(yīng)采用

減試劑空白的速率法；對于輔助酶或指示酶中雜酶引起的干擾，也應(yīng)

采用減試劑空白的速率法；對于內(nèi)源性干擾的反應(yīng)，不同的儀器應(yīng)分

別對待，不能盲目采用減空白的速率法，要區(qū)分是試劑空白還是樣品

空白。其他一些質(zhì)量保證參數(shù)在酶活性測定中也應(yīng)引起重視。

（四）副反應(yīng)NAD（P）H的光吸收特性成為目前使用最多的指示

反應(yīng)。但是，體內(nèi)存在數(shù)以百計的氧化還原酶，它們的輔酶很多是一

致的。若存在內(nèi)源性代謝物，必然會相互干擾。解決副反應(yīng)的干擾，

一直是人們努力的方向。通過加入副反應(yīng)抑制劑、樣品進(jìn)行預(yù)處理等

都是切實可行的手段。雙試劑底物啟動模式因不增加成本、不耗費時

間是最經(jīng)濟(jì)的方法?？傊?，酶催化活性濃度的測定影響因素多，只

有將各種影響因素都控制好，不同實驗室的測定結(jié)果才具有可比性。

要實現(xiàn)全球可比性的目標(biāo)，應(yīng)從以下幾個方面著手：首先，測定方法

要統(tǒng)一，各實驗室都應(yīng)選擇IFCC推薦法或中華醫(yī)學(xué)會推薦的方法。

其次，各試劑供應(yīng)商應(yīng)嚴(yán)格按照IFCC推薦法所規(guī)定的配制方法生產(chǎn)

試劑，并提供本測定系統(tǒng)的酶類校正物。另外，各實驗室的操作人員

應(yīng)合理編制分析儀參數(shù)；參加各地區(qū)組織的酶類室間質(zhì)評工作，不斷

提升實驗室的比對能力；控制樣品采集和保存等實驗前因素；認(rèn)真做

好室內(nèi)質(zhì)量控制，監(jiān)控試劑質(zhì)量和儀器性能。

第四節(jié)代謝物的酶法測定

酶試劑法是以酶作為試劑來檢測與酶促反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)的一類方法。酶

試劑法因具有反應(yīng)條件溫和安全、樣品不需預(yù)處理可直接測定、方法

特異性高、靈敏度高等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于體液中各種有機(jī)物的測定,

如葡萄糖、尿素、肌酊、膽紅素、尿酸、膽固醇、甘油三酯、膽汁酸、

乳酸、丙酮酸、酮體、乙醇、唾液酸、氨等等，也可以用來測定無機(jī)

離子和微量元素如鉀、鈉、氯、無機(jī)磷、碳酸氫根、銅、鋅、鎂等。

一、方法分類

在所有用酶作為試劑的測定方法中，分光光度法仍然是最常用的

測定手段。根據(jù)方法設(shè)計的原理不同可以分為：

(一)直接法在相對應(yīng)的氧化還原酶作用下產(chǎn)生可以直接檢測的信

號的方法稱為直接法。尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在

293nm有特異的吸收峰，膽紅素在膽紅素氧化酶作用下生成膽綠素造

成450nm處的吸光度下降，而乳酸、丙酮酸、酮體、乙醇、碳酸氫

根經(jīng)氧化還原反應(yīng)，使輔酶在氧化型與還原型之間轉(zhuǎn)換，很容易用分

光光度法檢測。體內(nèi)還有很多代謝物可以直接測定，關(guān)鍵是需要相對

應(yīng)的酶。

(二)酶偶聯(lián)法與酶活性測定一樣，直接法測定項目是有限的。而

酶偶聯(lián)法若不限制偶聯(lián)酶的數(shù)量，不考慮酶的來源和價格，從理論上

講幾乎可以測定所有代謝物。而且，每種代謝物可以使用不同的酶而

建立多種檢測方法。如甘油三酯、肌醉都有多種酶試劑法。指示反應(yīng)

主要分為NAD(P)H和過氧化物酶(POD)系統(tǒng)兩大類。

（三）無輔基酶活性恢復(fù)法很多酶必需某些無機(jī)離子、微量元素或

輔酶存在才發(fā)揮其催化活性。將脫去關(guān)鍵無機(jī)離子、微量元素或輔酶

的酶（無活性）與標(biāo)本混合，標(biāo)本中的無機(jī)離子、微量元素或輔酶使

酶重新復(fù)活，復(fù)活的比例可以反映這些無機(jī)離子、微量元素或輔酶的

含量。成功的例子有丙酮酸激酶法或色氨酸酶法測定鉀，a-半乳糖

昔酶法測定鈉、淀粉酶法測定氯、超氧化物歧化酶法測定銅、碳酸甘

酶或堿性磷酸酶法測定鋅、異檸檬酸脫氫酶法測定鎂等。根據(jù)此原理

也可用來測定輔酶。（四）激活劑和抑制劑測定法

根據(jù)酶有否激活劑和抑制劑存在時酶促反應(yīng)動力學(xué)發(fā)生改變來測定

激活劑和抑制劑的含量，成功的例子有己糖激酶法測定鎂、堿性磷酸

酶法測定茶堿等。

二、測定原理

如上所述，酶試劑方法可基于不同的原理來設(shè)計方法，但從監(jiān)測類型

來分，可分為終點法（平衡法）和連續(xù)監(jiān)測法（速率法）。所謂平衡

法是指標(biāo)本中待測物的量有限，經(jīng)過酶促反應(yīng)逐漸被消耗，當(dāng)剩余的

底物量很?。ǎ?%?5%）時，指示反應(yīng)信號逐漸達(dá)到穩(wěn)定，即通常

所說的終點。該法的特點是測定底物的總變化量，即測定的是"濃度"。

連續(xù)監(jiān)測法是測定速度（通常指的是初速度），依據(jù)是當(dāng)?shù)孜锏南?/p>

量較小時（＜5%）,酶促反應(yīng)呈一級反應(yīng)，反應(yīng)速度（v）只與代測物的

濃度成正比例。兩種方法是相互聯(lián)系的，因為平衡法的開始一段時間

都有可能遵循一級反應(yīng)規(guī)律。相反，連續(xù)監(jiān)測法只要時間足夠長，也

會達(dá)到平衡。酶促反應(yīng)速度受很多因素影響，只有在其它因素很好控

制的前提下，反應(yīng)速度（V）才與代測物的濃度成正比例，該法測定

誤差較大。但也具有很多優(yōu)點：①因測定時間短，檢測速度快，不需

把所有底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，酶用量比平衡法小，檢測成本低；②速率法

一般不需做樣品空白，標(biāo)本本身因素影響小。平衡法若要將代測物在

較短時間內(nèi)消耗接近完全，必須使用大量的酶。但其優(yōu)點是試劑酶活

性的下降對測定結(jié)果影響遠(yuǎn)沒有速率法明顯，僅使達(dá)到平衡所需時間

延長，檢測范圍變窄。試劑酶活性下降對速率法來說有時是致命的，

可能導(dǎo)致線性期縮短，甚至一級反應(yīng)喪失。由于以上種種原因，酶試

劑法多選擇平衡法。從以上分析不難看出，對于平衡法來說關(guān)鍵是

確定達(dá)到終點所需的時間。對于速率法來說關(guān)鍵是如何使酶促反應(yīng)成

一級反應(yīng)。下面以單底物一個工具酶為例說明它們的測定原理：（一）

平衡法

將米氏方程改寫為：...................................2.4

積分得：若反應(yīng)達(dá)到平衡，假設(shè)（一般"終點"的要求），[SOHSt]

—[SO],則可簡化為：

說明達(dá)到終點所需的時間與Km、Vm、SO有關(guān)，Km越小、Vm越

大（加入酶量越多）、SO越?。ù鷾y物越少）則達(dá)到終點所需的時

間越短。

若[SO]《Km,2.4式簡化為：

積分得:

若同時做標(biāo)準(zhǔn)管，不管反應(yīng)到達(dá)何種程度，只要標(biāo)準(zhǔn)管與測定管反應(yīng)

時間⑴一致，則有：

若兩者的反應(yīng)程度一致，消耗的比例、剩余的比例與起始的比例一致,

則：

............................2.5

標(biāo)準(zhǔn)管的［SO-St］與待測管的［SO-St］分別代表消耗量，也代表轉(zhuǎn)化為產(chǎn)

物的量，可以用產(chǎn)物的吸光度來表示（As和Au）。標(biāo)準(zhǔn)管的［So］與測

定管的［So］分別表示為Cs和Cuo

.........................................2.6

公式（2.6）平衡法測定代謝物的基本原理，其前提條件是公式（2.5）

成立。當(dāng)［S0HSt］Q［S0］,即反應(yīng)基本達(dá)到平衡，Au和As基本穩(wěn)定

不變，此時測定誤差最小。如果測定管與標(biāo)準(zhǔn)管的反應(yīng)明顯存在基質(zhì)

效應(yīng)，兩者反應(yīng)程度不一，若按公式（2.6）計算就會帶來誤差。

（二）速率法根據(jù)米氏方程：按一級反應(yīng)要求：①［S］《Km,［S］+Km

七Km,②酶量很大，在反應(yīng)過程中，可將V看成不變。貝IJ：

若同時帶標(biāo)準(zhǔn)管，則有：

.....................................2.7

標(biāo)準(zhǔn)管的［So］與測定管的［So］分別表示為Cs和Cu,速度用△A/min

來表示。上式改寫為:

2.8

公式(2.8)就是速率法測定代謝物濃度的原理，其前提條件是測定

初速度。隨著反應(yīng)進(jìn)行，［S］越來越小，v也越來越小。說明要使反應(yīng)

速度與代測物濃度成正比例，必須做到測定的速度是初速度，越偏離

初速度測定，誤差則很大。

三、常用的指示系統(tǒng)

除個別酶試劑法使用色素原做指示系統(tǒng)外，酶試劑法的指示系統(tǒng)主要

使用NAD(P)H或過氧化物酶(POD)系統(tǒng)，前者主要應(yīng)用于速率

法，后者則常用于平衡法。

(一)以還原型輔酶為指示系統(tǒng)

常用的工具酶有乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、

蘋果酸脫氫酶等，該法的優(yōu)點是可以用連續(xù)監(jiān)測法，除在酶偶聯(lián)反應(yīng)

測定酶活性中應(yīng)用較多外，像葡萄糖、尿素、肌醉、甘油三酯、膽汁

酸、乳酸、丙酮酸、酮體、乙醇、唾液酸、氨、鉀、鎂等的酶法測定

都使用該指示系統(tǒng)。但該法的缺陷有：

1.靈敏度較低NAD(P)H的摩爾消光系數(shù)只有6.22X103。為此,

采取一系列措施提高靈敏度。常用的措施有：

(1)利用遞氫體PMS或偶聯(lián)黃遞酶：將NADH上的氫交給四氮唾

鹽如NBT等，即提高了靈敏度，又可以在可見光范圍內(nèi)監(jiān)測，使儀

器要求大大降低。

(2)加入另一個酶，增加供體氫的數(shù)量：如膽汁酸測定中，合并使

用3a-羥類固醇脫氫酶(3a-HSD)和3-氧-5B-類固醇-Z\4-脫氫

酶，使測定靈敏度增加1倍。

(3)酶循環(huán)法：采用酶循環(huán)法(enzymaticcyclingmethods)可大大

提高測定的靈敏度，如旭汁酸的測定，在體內(nèi)的濃度只有微摩爾的水

平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它代謝物的濃度。其原理是：3a-HSD催化膽汁酸和

3一酮類固醇之間的反應(yīng)，正反應(yīng)對輔酶硫代氧化型輔酶I的親和力遠(yuǎn)

遠(yuǎn)大于輔酶I,而逆反應(yīng)對還原型輔酶I的親和力大于硫代還原型輔

酶I,在反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的硫代氧化型輔酶I和還原型輔酶I,只要

有少量的膽汁酸就可生成少量的3-酮類固醇，并在兩者之間構(gòu)成循

環(huán)，不斷產(chǎn)生硫代還原型輔酶I(黃色)，控制好條件，反應(yīng)速度與代

測物膽汁酸呈正比。靈敏度可增加數(shù)十倍。底物足夠多，時間越長產(chǎn)

物越多，直到系統(tǒng)中某一反應(yīng)物耗盡為止。類似的方法還可以測定雌

二醇、微量的乙醇等。循環(huán)酶技術(shù)在試劑生產(chǎn)中還可以不斷補(bǔ)充某些

不穩(wěn)定的組分。

(4)熒光法：NAD(P)H的激發(fā)波長在365nm,發(fā)射波長在

460nm,用熒光監(jiān)測器可以使靈敏度增加100-1000倍。但需要特殊儀

器，實用性差

2.干擾嚴(yán)重NADH系統(tǒng)是體內(nèi)上百種酶的輔酶，若存在內(nèi)源性

干擾物，勢必造成很大的干擾，尤其是樣品用量大的方法。因此，在

某些測定系統(tǒng)中常常加入高濃度的丙酮酸來抑制乳酸脫氫酶的內(nèi)源

性干擾。

3.儀器要求高必須具備340nm的紫外監(jiān)測器。這可通過還原

四氮噗鹽生成甲月贊的方法來解決。

（二）以過氧化物酶為指示系統(tǒng)

利用POD為指示系統(tǒng)已廣泛用于葡萄糖、肌酎、尿酸、膽固醇、甘

油三酯等項目的測定。其共用的指示反應(yīng)最早由Trinder氏等人提出。

其原理是過氧化氫與4-氨基安替比林和酚一起形成紅色的醍亞胺類

化合物。最大吸收峰為500nm,在可見光范圍內(nèi)比色，這是它的最大

優(yōu)點。后來，提出了很多酚類衍生物，目的是提高生色基團(tuán)的穩(wěn)定性

和溶解度、產(chǎn)物的靈敏度和色澤的穩(wěn)定性。也有些生色基團(tuán)的產(chǎn)物是

蘭色醍類，能很好避免溶血等引起的色素干擾。該法的主要缺點是容

易受維生素C、尿酸、膽紅素、谷胱甘***等還原性物質(zhì)的干擾，嚴(yán)

重時測定結(jié)果會出現(xiàn)假性負(fù)值。干擾機(jī)制有競爭過氧化氫、破壞色素、

延遲生色反應(yīng)等，目前一般采用雙試劑劑型，在試劑1中加入抗壞血

酸氧化酶、亞鐵氟化鉀等來消除維生素C、膽紅素的干擾。表3-5例

舉了一些常用的生色基團(tuán)。

表3-5常用的Trinder反應(yīng)生色基團(tuán)

化學(xué)名英文縮寫最大吸收峰（nm）

酚P500

2、4-二氯酚2、4DCP510

N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺EMAE555

N-乙基-N-（2-羥基-3-丙磺酰）間甲苯胺TOOS555

N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3、5二甲氧基苯胺ESPDMA585

第五節(jié)同工酶檢測技術(shù)

1952年，Nielands在乳酸脫氫酶區(qū)帶電泳中發(fā)現(xiàn)了兩種有活性區(qū)帶，

1959年，Markert等人提議用"isozyme”來描述一組具有相同催化功能

而其結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)不同的酶，國內(nèi)曾譯為“同功酶"和"同工酶"，1964

年，國際生化學(xué)會統(tǒng)一用"Isoezyme"來表示"isozyme",由于"Isoezyme"

雖催化同一反應(yīng)，但在不同組織中具有不同的功能，故國內(nèi)譯為"同

工酶"較為合適，并已得到廣泛接受。

同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多***鏈單體、純聚體或

雜化體，具有相同的催化作用，但其分子構(gòu)成、空間構(gòu)像、理化性質(zhì)、

生物學(xué)性質(zhì)以及器官分布或細(xì)胞內(nèi)定位不同的一組酶稱為同工酶。凡

酶蛋白結(jié)構(gòu)不同的同工酶稱為原級同工酶，而將經(jīng)加工或修飾后的同

工酶稱為次級同工酶或酶的多種形式。不管是原級同工酶還是酶的多

種形式，由于它們在組織分布、細(xì)胞內(nèi)定位、發(fā)生發(fā)育等方面都有可

能存在明顯差異，與總酶活性相比它具有更高的診斷特異性和診斷敏

感度，所以沒有必要進(jìn)行嚴(yán)格分類。但在遺傳學(xué)領(lǐng)域中以研究原級同

工酶為主。某些同工酶從組織進(jìn)入體液后在蛋白酶作用下降解成不同

的亞型（isoform）,如CK-MB可分為MB1和MB2兩個亞型，有報

道提示亞型比同工酶更有價值。

同工酶的測定方法可以分為直接法和間接法兩大類。直接法是指利用

同工酶之間酶催化動力學(xué)性質(zhì)或免疫原性的不同，不對同工酶各組分

預(yù)先分離，直接測定某一種同工酶的方法。多采用化學(xué)抑制、免疫抑

制、熱變性等原理。而間接法是依據(jù)同工酶之間理化性質(zhì)（帶電性、

分子大小、糖鏈等）的不同先用電泳技術(shù)、凝膠層析技術(shù)、親和層析

技術(shù)將各種同工酶組分分開，再利用酶催化性質(zhì)對同工酶進(jìn)行定量的

方法。兩者區(qū)別是：直接法只能測定同工酶的某一組分，由于操作方

便，適合于自動生化分析儀。而間接法操作復(fù)雜，需要特殊裝置，不

適合自動生化分析儀，但能同時分析同工酶的各個組分。下面簡單介

紹同工酶分析的常用原理。

一、化學(xué)抑制法

市售的LD1測定試劑盒多采用化學(xué)抑制法，個別采用免疫抑制法。

化學(xué)抑制法的原理是一定濃度某些化學(xué)試劑如750mmol/L的1,6-己

二醇、240mmol/L的硫氟酸月瓜能有效地抑制LD2-LD5各種同工酶的

活性，而