重組技術基礎

重組技術基礎與基因工程學科建立相關的1、4個里程碑事件：2、3大技術發(fā)現/發(fā)明：第2頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第二章重組ＤＮＡ技術基礎第3頁,共66頁，2024年2月25日，星期天DNA組成與結構一級結構堿基的排列順序二級結構DNA的雙螺旋形式高級結構DNA的超螺旋形式核酸分子組成DNA的分子結構第4頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（一）核酸的分類90%以上分布于細胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的基因型(genotype)。參與細胞內DNA遺傳信息的表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。第5頁,共66頁，2024年2月25日，星期天１.戊糖（構成RNA）1′2′3′4′5′

-D-呋喃核糖(ribose)（構成DNA）

-D-2-脫氧呋喃核糖

(deoxyribose)第6頁,共66頁，2024年2月25日，星期天2.堿基嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)第7頁,共66頁，2024年2月25日，星期天核苷：AR,GR,UR,CR脫氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR3.核苷(ribonucleoside)堿基——核糖（脫氧核糖）

連接方式：C——N糖苷鍵堿基（9/1位）——戊糖（1，位）

1′1第8頁,共66頁，2024年2月25日，星期天核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

４.核苷酸(ribonucleotide)核苷（脫氧核苷）——磷酸磷酸酯鍵第9頁,共66頁，2024年2月25日，星期天5′端3′端５.核苷酸的連接３，－５，磷酸二酯鍵CGA第10頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、核酸的一級結構定義：

核酸中核苷酸的排列順序（堿基序列）。5′端3′端CGA第11頁,共66頁，2024年2月25日，星期天AGP5

PTPGPCPTPOH3

書寫方法5

pApCpTpGpCpT-OH

3

5

ACTGCT

3

豎式橫式簡化式第12頁,共66頁，2024年2月25日，星期天DNA的空間結構第13頁,共66頁，2024年2月25日，星期天一、DNA的二級結構

（一）雙螺旋結構第14頁,共66頁，2024年2月25日，星期天DNA雙螺旋結構模型要點（Watson,Crick,1953）兩條DNA單鏈分子反向平行環(huán)繞，右手螺旋走向，表面大溝與小溝相間。螺旋直徑為2nm，

主鏈：戊糖－磷酸骨架位于外側

側鏈：堿基對位于內側堿基平面垂直于螺旋軸堿基距：0.34nm；螺距：3.4nm；周長：10對堿基。第15頁,共66頁，2024年2月25日，星期天堿基形成氫鍵配對，配對形式為：A=T;G

C）。第16頁,共66頁，2024年2月25日，星期天堿基互補配對TACG第17頁,共66頁，2024年2月25日，星期天穩(wěn)定因素：1.氫鍵維持橫向穩(wěn)定性，2.堿基堆積力維持縱向穩(wěn)定性。3.介質中陽離子可以有效地屏蔽磷酸基之間的靜電斥力

第18頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（二）與DNA堿基順序相關的特殊結構堿基順序顛倒重復而具有2倍對稱的DNA段落第19頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共66頁，2024年2月25日，星期天鏡像重復序列第22頁,共66頁，2024年2月25日，星期天tsDNA是在DNA雙螺旋結構的基礎上形成的，三條鏈均為同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy），即整段的堿基均為嘌呤或嘧啶。（三）三股螺旋DNA

（tsDNA,也稱H-DNA

）

第23頁,共66頁，2024年2月25日，星期天Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中穩(wěn)定，較多見

第24頁,共66頁，2024年2月25日，星期天(四)酶活性DNA1995年Cuenoud等發(fā)現了具有酶活性的DNA，再次豐富了酶學。Cuenoud根據共有序列設計并合成了由47個核苷酸組成的單鏈DNA-E47，以此連接兩個底物DNA——S1和S2第25頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、DNA的超螺旋結構及其在染色質中的組裝（一）DNA的超螺旋結構超螺旋結構(superhelix或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結構。正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同負超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反第27頁,共66頁，2024年2月25日，星期天意義DNA超螺旋結構整體或局部的拓撲學變化及其調控對于DNA復制和RNA轉錄過程具有關鍵作用。第28頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（二）原核生物DNA的高級結構第29頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（三）DNA在真核生物細胞核內的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質構成，其基本單位是核小體(nucleosome)。DNA：約200bp

組蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4核小體的化學組成第30頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共66頁，2024年2月25日，星期天RNA的結構StructureofRNA第33頁,共66頁，2024年2月25日，星期天RNA的種類、分布、功能第34頁,共66頁，2024年2月25日，星期天mRNArRNAtRNA第35頁,共66頁，2024年2月25日，星期天一、mRNA的結構與功能hnRNA內含子(intron)mRNA

外顯子(exon)第36頁,共66頁，2024年2月25日，星期天*真核細胞mRNA結構特點5′末端有甲基化鳥苷帽子結構：m7GpppNm-

2.3′末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。第37頁,共66頁，2024年2月25日，星期天帽子結構第38頁,共66頁，2024年2月25日，星期天促進mRNA由胞核向胞質的轉位維持mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始的調控帽子結構和多聚A尾的功能第39頁,共66頁，2024年2月25日，星期天*mRNA的功能把DNA的堿基序列翻譯成蛋白質的氨基酸順序。DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞細胞質細胞核DNA內含子外顯子轉錄轉錄后剪接轉運mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細胞第40頁,共66頁，2024年2月25日，星期天*

tRNA的一級結構特點含10~20%稀有堿基，如DHU3′末端為—CCA-OH5′末端大多數為G

具有T

C二、轉運RNA的結構與功能第41頁,共66頁，2024年2月25日，星期天*tRNA的二級結構——三葉草形

氨基酸臂

DHU環(huán)

反密碼環(huán)額外環(huán)

TΨC環(huán)氨基酸臂額外環(huán)第42頁,共66頁，2024年2月25日，星期天*tRNA的三級結構——倒L形*tRNA的功能活化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質的翻譯。第43頁,共66頁，2024年2月25日，星期天*rRNA的結構三、rRNA的結構與功能*rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質生物合成的場所。第44頁,共66頁，2024年2月25日，星期天rRNA的種類真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNAS（沉降系數）：單位時間內的沉降速度第45頁,共66頁，2024年2月25日，星期天核酸的理化性質ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid第46頁,共66頁，2024年2月25日，星期天1.核酸的溶解度核酸是極性分子，微溶于水，不溶于乙醇或異丙醇。DNA+蛋白質→脫氧核糖核蛋白（DNP）：在1mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。RNA+蛋白質→核糖核蛋白（RNP）：在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。一、核酸的一般理化性質第47頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

核酸屬于兩性電解質，但因為磷酸的酸性較強，因此總體呈現較強的酸性。具有較低的等電點。當溶液的pH

4時，呈多負離子狀態(tài)，容易與金屬離子結合形成鹽。2.酸堿性第48頁,共66頁，2024年2月25日，星期天3.核酸的高分子性質粘度：DNA>RNAdsDNA>ssDNA4.核酸的紫外吸收(OD260)單核苷酸>ssDNA(或RNA)>dsDNA第49頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共66頁，2024年2月25日，星期天5.核酸的化學性質核酸中的嘌呤和嘧啶能進行脫氨、聚合、烷基化等反應等。脫氨：C→U第51頁,共66頁，2024年2月25日，星期天脫氨：C→UATCGAATTGCATUGAATTAC千萬年后，G–C將不復存在第52頁,共66頁，2024年2月25日，星期天聚合紫外光誘導兩個相鄰嘧啶之間形成二聚體第53頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、DNA的變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質變化：OD260增高 粘度下降浮力密度升高酸堿滴定曲線改變生物活性喪失第54頁,共66頁，2024年2月25日，星期天DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂第55頁,共66頁，2024年2月25日，星期天例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應：DNA變性時其溶液OD260增高的現象。第56頁,共66頁，2024年2月25日，星期天熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。第57頁,共66頁，2024年2月25日，星期天Tm：DNA變性時紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。第58頁,共66頁，2024年2月25日，星期天影響Tm的因素：1.G+C含量:

G+C越高，Tm越高

2.DNA樣品均一性：

均一的DNA樣品，Tm范圍較狹窄。

3.核酸的種類：

雙鏈RNA＞RNA-DNA雜交鏈＞DNA雙鏈

4.溶液的離子強度：

離子強度高，Tm值高。第59頁,共66頁，2024年2月25日，星期天三、DNA的復性與分子雜交

DNA復性(renaturation)的定義在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現象稱為復性。減色效應

DNA復性時，其溶液OD260降低的現象。熱變性的DNA