發(fā)酵技術(shù)-課程筆記

?利用微生物細胞中的一種或多種酶，作用于某種化合物的特定部位（基團），使之

轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)類似但具有更大經(jīng)濟價值的另一種化合物

?四、微生物特殊機能的利用

?凈化環(huán)境

?保持生態(tài)平衡

?探礦、冶金、石油脫硫等

?基因工程菌株生產(chǎn)動、植物細胞產(chǎn)品

?二、發(fā)酵工業(yè)的范圍

?釀酒；發(fā)酵食品；有機酸；醇及有機溶劑；酶制劑；氨基酸；核酸類物質(zhì)；抗生素；生理

活性物質(zhì)；微生物菌體產(chǎn)品；生物農(nóng)藥與生物增產(chǎn)劑；生物能；環(huán)境凈化；微生物冶煉；

轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品；多糖，糖苗等其他發(fā)酵產(chǎn)品

?一、生物農(nóng)藥與生物增產(chǎn)劑

?微生物殺蟲劑

?除草劑

?生物增產(chǎn)劑

?防治植物病害微生物

?二、環(huán)境凈化

?吸附重金屬

?三、藥物

?分類

?生物來源

?青霉菌

?放線菌

?作用對象

?抗菌藥

?抗腫瘤藥

?抗病毒藥

?除草劑

?酶抑制劑

?免疫調(diào)節(jié)劑

?作用機制

?抑制細胞壁合成

?影響細胞膜功能

?干擾蛋白質(zhì)合成

?抑制核酸合成

?抑制生物能量反應(yīng)

?化學(xué)結(jié)構(gòu)

?抗生素

?微生物

?氨基酸

?核昔酸

?甯體激素

?酶及酶抑制劑

?具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞表面烏苯美司(ubenimex)

?★用于治療高膽固醇血癥的肝臟

--洛伐他定(ovastatin)、普伐他定(pravastatin)及半合成衍生

物---辛伐他定(simvastatin)

?★用于治療糖尿病的唾液腺和胰腺阿卡糖

(acarbose)及半合成品---沃格里堂(voglibose)

?★用于減肥和控制高血脂、高血糖的半合成奧里司他

(orlistat)

?應(yīng)用

?治療和預(yù)防疾病

?作為研究工具

?四、微生物濕法冶金與采油

?參與金屬浸出的微生物：

?1、中溫硫桿菌屬

?2、中度嗜熱的嗜高溫菌硫化桿菌屬

?3、硫化菌屬(Sulfolobus)、酸菌屬(Acidanus)、生金球菌屬(Metallosphaera)及

流球菌屬(Sulfurococcus)中的一些極度嗜熱菌

?第二章工業(yè)微生物

?第一節(jié)工業(yè)用微生物菌種

?一、工業(yè)生產(chǎn)對菌種的要求

?1、遺傳特性穩(wěn)定

?2、生長繁殖能力強

?3、不產(chǎn)生或少產(chǎn)生與目標產(chǎn)品性質(zhì)相近的副產(chǎn)物及其它產(chǎn)物

?4、利用原材料廣泛、價廉

?5、發(fā)酵培養(yǎng)易于控制，產(chǎn)生的泡沫要少

?6、具有抗噬菌體感染的能力

?7、菌種不是病原菌

?二、工業(yè)微生物常用菌種

一桿，，極毛運動r~自養(yǎng)窗一研化畿密科

（假取胞桿首目）-1一異養(yǎng)■r單*桿總科：?臏桿總

——g!KM?：EMKI?S

——大豆?科

L生存于含品、土康、水中——無色桿?科

很少發(fā)落"

L革蘭氏明性篇一桿，，周毛運動生

_套生存在人、動物大崎內(nèi)一融桿?科：大勒桿菌

信”目）

均能發(fā)力甯?糖

寄生（一般_（-好氣——布?氏桿■科：iu#巴氏桿■

不運動）-L專任■氣一擬桿?科

細育一

1—球修，，生奈氏球?料

球,一小球■料：u■球■

發(fā)?產(chǎn)■為孔?（或孔霞和■?）一孔?桿JB科：孔?符曲

一不壇動一發(fā)?產(chǎn)物為丙”一丙或?科：為酸桿■

一草蘭氏陽性?一

棒狀桿■——律狀桿?科：北京棒狀桿■

」短桿■一履桿首科：黃色婀桿的

_____一好氣1■——芽布桿?科、芽拖桿?屬：枯草桿■

11

用毛運動'芽制桿r■氣■—芽毒桿首科、帔秋芽范桿丙*丁靜梭狀

棄拖桿?

圖27發(fā)解工業(yè)常見細菌的分類綱要

一、細菌

?枯草芽抱桿菌

?是生產(chǎn)淀粉酶的主要菌種

?是生產(chǎn)中性蛋白酶和制造獨特風(fēng)味食品納豆的主要菌種

?醋酸菌

?(Acetomonas)(Gluconobacter)，能氧化乙醇生成

醋酸且醋酸是最終產(chǎn)品

?（Acetobacter）不僅能將乙醇氧化為醋酸，而且能將產(chǎn)生的醋酸進一步

氧化成CO2和水

?棒狀桿菌

?能以葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸和其它氨基酸

?短桿菌

?是氨基酸、核甘酸工業(yè)生產(chǎn)中常用的菌種，也是生物合成生產(chǎn)輔酶A的

常用菌種

?作用

?用于生產(chǎn)酶制劑、有機酸、氨基酸、核甘酸等

?二、放線菌

?三、醵母菌

?(SaccharomycescerevisiaeHansen)屬于酵母屬(Saccharomyces),麥

芽汁25℃培養(yǎng)3d,細胞多為圓形、卵形、橢圓形到臘腸形

?用于釀造飲料和制造面包外，是主要的酒精發(fā)醵菌，釀造葡萄酒和果酒，也有的用于啤

酒業(yè)、蒸憎酒業(yè)和酵母生產(chǎn)

?四、霉菌

?(MucorRouxianusWehmer)能糖化淀粉且能生成少量酒精

?(Rhizopussto/on/ZerVuillemin)常引起瓜果蔬菜等在運輸中腐爛，甘蔗

腐爛多由該菌造成，其生長的最適溫度為30℃,常用來發(fā)酵豆類和谷類食品；是微生

物轉(zhuǎn)化笛族化合物的重要真菌

?是酒曲上的主要霉菌；青霉屬中的產(chǎn)黃青霉(PeniciHiumchrysogenumThom)

是青霉素最重要的生產(chǎn)菌

?(PeniciHiumurticaeba/Hez)主要用于生產(chǎn)灰黃霉素

?五、擔(dān)子菌

?第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育

?一、生產(chǎn)菌種的分離與篩選

?菌種的分離與篩選主要包括幾個步驟

?L采樣

?1、采樣對象

?2、采樣季節(jié)

?北方：春秋兩季

?南方：秋初為好

?3、采土方式

?離表層5-15cm的土約10-25g

?4、樣本預(yù)處理

?物理方法、化學(xué)方法、誘餌法

?2、增殖培養(yǎng)

?原則：投其所好，取其所抗

?目的：為了提高分離的效率

?3、純化分離

?目的：獲得純種

?方法：

?獲得純菌落：劃線分離法、稀釋分離法

?獲得純菌株：單細胞或單抱子分離法

?純培養(yǎng)驗證

?細胞形態(tài)和習(xí)性水平觀察

?細胞組分水平

?蛋白質(zhì)水平

?基因水平

?4、篩選

?采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得

適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種

?5、性能鑒定

?毒性試驗；生產(chǎn)性能鑒定

?據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為

食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗

?主要步驟

■

調(diào)杳研究（包括杳閱相關(guān)資料）

I

設(shè)計實驗方案

I

采樣（選擇適宜的采樣環(huán)境）

I

增殖培養(yǎng)（選擇適宜的培養(yǎng)條件）

I

初篩（1株1瓶,確定定性或半定量的快速檢測方法）

I

純種分熟

I

原種斜面

I

復(fù)篩（1菌株3?5搖瓶）

I

再復(fù)篩（結(jié)合初步的工藝條件）

I

性能鑒定（包括生產(chǎn)性能、毒性實驗、菌種鑒定）

I

菌種保藏

I

（生產(chǎn)用菌或作為進步育種工作的原始菌株或出發(fā)菌株）

圖2-3菌種的分離與篩選流程

?二、工業(yè)生產(chǎn)菌的育種

?優(yōu)良菌種的選育

?目的

?為生產(chǎn)提供了各種類型的突變株，大幅度提高了菌種產(chǎn)生有利用價值代謝產(chǎn)物的水平

?1、自然選育

?定義

?不經(jīng)過人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程

?原因

?多因素低劑量效應(yīng)

?指在自然環(huán)境中存在著低劑量的宇宙射線、各種短波輻射、低劑量的誘變物質(zhì)

和微生物自身代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)等的作用引起的突變

?互變異構(gòu)效應(yīng)

?四種堿基第六位上的酮基或氨基的瞬間變構(gòu)會引起堿基的錯配

?結(jié)果

?菌種退化

?

?一般程序

?菌種一菌懸液一稀釋法分離單菌落一斜面種子一搖瓶初篩一搖瓶復(fù)篩T測

定單菌落生產(chǎn)能力-選出高水平菌種一菌種保藏

?2、誘變育種

?定義

?利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群，促進其突變率大幅度提高；

然后采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株，以

供生產(chǎn)實踐或科學(xué)研究之用

?方法

?1、誘變劑和誘變處理

?物理誘變劑

?射線如紫外線、X一射線、YT寸線,快中子

?化學(xué)誘變劑：

?化學(xué)因子如堿基類似物、5一氟尿喀咤、烷化劑等

?缺點

?L大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效

?2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的，只需要少量

?3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎

?誘變劑的作用

?1、提高突變頻率

?2、擴大產(chǎn)量變異幅度

?3、使產(chǎn)量變異向正變（提高）或負變（降低）的方向移動

?步驟

出發(fā)菌株

純化/收集菌株

\/離心篩選

細胞或胞子懸浮液的制備，二:玻璃珠震蕩

|、活細胞計數(shù)

致死曲產(chǎn)的測定--誘變劑處理

活細胞計數(shù)

I

中間培養(yǎng)

突變株分離

i

初篩（1菌株1瓶）

初篩（1菌株3-5瓶）

I

生產(chǎn)性實驗

I

菌種保藏

?出發(fā)菌株的選擇

?L,對誘變處理較敏感，容易達到好的效

果

?2、在與野生型較相像，也是良好的出發(fā)

菌株

?3、每：一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提

高

?4、出發(fā)菌株，在處理比較后，將更適合的

出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變

?5、要盡量選擇來作出發(fā)誘變細胞,

這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因

?6、根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為

同一誘變劑的重復(fù)處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降

?處理菌懸液的制備

?這一步驟的關(guān)鍵是制備單細胞和單抱子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為

此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾

?誘變處理

?根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘

變處理方案

?中間培養(yǎng)

?在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原

有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表

現(xiàn)出來

?分離和篩選

?篩選分初篩和復(fù)篩

?初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。

?復(fù)篩則是精選,以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就

有差異

?3、雜交育種

?雜交育種：準性生殖；接合；原生質(zhì)體融合

?融合

?通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組

子的過程，亦可稱為""(cellfusion)

*

?原生質(zhì)體融合

?原生質(zhì)體再生

?

?4、代謝控制育種

?應(yīng)用生物化學(xué)和遺傳學(xué)原理，深入研究生物合成代謝途徑及代謝調(diào)控的機制，設(shè)計篩

選出篩子，通過遺傳育種技術(shù)獲得解除或繞過了微生物正常代謝途徑的突變株，及定

向選育某種特定的突變型，以達到大量積累有益產(chǎn)物的目的

?5、基因工程育種

?第三節(jié)工業(yè)生產(chǎn)菌種的復(fù)壯與保藏

?一、工業(yè)生產(chǎn)菌種退化現(xiàn)象及原因

?菌種退化的本質(zhì)是染色體的變異

?生產(chǎn)菌株遺傳標記的丟失及生產(chǎn)能力的下降稱為一菌種退化

?一、退化表現(xiàn)

?L菌種負突變，典型形狀變得不典型

?2、生長速度緩慢，產(chǎn)抱子減少

?3、代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或?qū)λ拗骷纳芰ο陆?/p>

?4、抗不良環(huán)境能力減弱

?二、退化原因

?L基因突變

?2、分離現(xiàn)象

?3、其他如營養(yǎng)不良、發(fā)酵時間長而積累有害產(chǎn)物等

?三、退化防治

?L從菌種選育方面考慮

?2、控制傳代次數(shù)

?3、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件

?4、利用不易衰退的細胞傳代

?5、采用有效的菌種保藏方法

?四、菌種老化

?其生命力衰退，色素分泌增加，細胞中空泡增多、甚至破裂、菌絲生長慢、抵抗雜菌能

力弱

?特點：老化現(xiàn)象不會傳給子代，這是與退化的最大區(qū)別

?二、工業(yè)生產(chǎn)菌種的復(fù)壯

?一、定義

?對退化的菌種進行分離純化和生產(chǎn)性能測定，從退化的群體中分離篩選到未衰退個體，

進行繁殖使達到恢復(fù)該菌種原有典型形狀的措施。

?二、措施

?1、純種分離法

?2、淘汰已衰退個體

?3、選擇合適的培養(yǎng)條件

?三、工業(yè)生產(chǎn)菌種的保藏

?意義

?可保證研究結(jié)果獲得良好的重復(fù)性；可保證菌種的高產(chǎn)穩(wěn)定

?基本原理

?根據(jù)微生物的生理生化特性，人為創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑、生長繁殖受到

抑制的休眠狀態(tài)以減少菌種的變異

?理想保藏方法應(yīng)具備的條件

?L經(jīng)長期保藏后菌種存活健在

?2、保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物

生產(chǎn)的高產(chǎn)能力

?3、菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空

?一、工業(yè)生產(chǎn)菌種常用保藏方法

?1、低溫保藏法

?2、斜面保藏法和穿剌保藏法

?斜面?zhèn)鞔２胤?/p>

?優(yōu)點

?這種方法簡便易行;不需特殊設(shè)備，能隨時觀察所保存的菌株的存活、退化

及污染情況

?缺點

?保藏時間短，需要比較頻繁的傳代，不僅容易引起菌種的變異和退化，而

且工作量大，費用高，保藏期間還容易通過棉塞長霉引起菌種的污染

?廣泛適用于細菌、放線菌、酵母、絲狀真菌等的短期保藏

?穿刺保藏法

?3、礦物油保藏法

?常用于各種好氣性細菌的保藏

?不適用那些能夠利用石蠟為碳源的微生物，如固氮菌、分枝桿菌、沙門氏菌、毛霉、

根霉等

?4、自然基質(zhì)保藏法

?5、載體保藏法

?沙和土

?適用于產(chǎn)生抱子的絲狀真菌和放線菌,或形成芽抱的細菌

?6、真空冷凍干燥保藏法

?安瓶瓶

?真空冷凍干燥法具備了低溫、真空和干燥的條件，而保存期可長達十年以上，是目前

較理想的保藏方法,是各種保藏機構(gòu)廣泛采用的主要保藏方法

?7、冷凍保藏法

?普遍適用于微生物、動物和植物病毒、細胞系、組織培養(yǎng)，甚至小的動物個體等的

保藏.

?包括

?普通冷凍保藏法

?超低溫冷凍保藏法

?液氮冷凍保藏法

?1、菌懸液的制備

?取對數(shù)生長期后期的菌種，用無菌的10%甘油制成菌懸液，然后分裝

安甑瓶，每管加0.5ml菌液

?2、冷凍與保藏

?用程序控制降溫議(ControlledRateFreezers)控制降溫速度，從室

溫快速降到4℃,從4°(:到-40℃,每分鐘降低1℃;從-40℃到-70℃,

每分鐘降低5℃,然后將安甑瓶迅速放入中液相保藏

?8、寄主保藏法

?適用于專性活細胞寄生微生物

?9.基因工程菌保藏法

?保藏在含一定濃度選擇劑的培養(yǎng)基中

?比較

方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評價

冰箱保藏法低溫各大類X月簡便

（斜面）

冰箱保藏法低溫細菌、酵母菌