熒光顯微鏡使用和顯微攝影

熒光顯微鏡使用和顯微攝影2、熒光顯微鏡的裝置A、可以提供特定波長的光源裝置，使被檢物體得到理想的激發(fā)發(fā)出強(qiáng)的熒光。B、可以吸收或反射短波光的一系列濾光片。第2頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共56頁，2024年2月25日，星期天八、倒置顯微鏡第5頁,共56頁，2024年2月25日，星期天九、顯微攝影1、按不同類型顯微鏡的調(diào)節(jié)方式，對拍攝部位初步對焦。2、視場光闌內(nèi)切。3、選擇光路（包括顯微鏡的與取景器旁的）4、安裝膠卷5、設(shè)置自動(dòng)曝光裝置6、彩色照像要調(diào)色溫，調(diào)電壓或用濾光片第6頁,共56頁，2024年2月25日，星期天7、屈光度調(diào)節(jié)8、按曝光按鈕9、取出膠卷第7頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共56頁，2024年2月25日，星期天生物電子顯微鏡技術(shù)

第一節(jié)透射電子顯微鏡技術(shù)一、顯微鏡的分辨率與放大倍數(shù)分辨率：d=0.61λ/η·sinα第9頁,共56頁，2024年2月25日，星期天電子的波長：

λ=h/mv

h—普朗常數(shù),6.62×10-27爾格/秒

m—電子質(zhì)量,9.1×10-28

克

v—電子運(yùn)動(dòng)速度根據(jù)能量守恒定理：

1/2mv2=eU

e—電子電量,4.8×10-10

靜電單位

U—電壓第10頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

電子顯微鏡的電壓50—100千伏。電子波長為0.053—0.007?。最佳孔徑角為10-2—10-3弧度。電鏡的最高分辨率可達(dá)2—3?。有效放大倍數(shù)可達(dá)100萬倍。

12.25λ=(?)U第11頁,共56頁，2024年2月25日，星期天入射電子直接透射電子小角度彈性碰撞電子大角度彈性碰撞電子小角度非彈性碰撞電子背散射電子俄歇電子二次電子陰極發(fā)光X—射線掃描電鏡透射電鏡

1、電子與樣品作用后產(chǎn)生的信息X—射線能譜分析二、電子成像原理樣品第12頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2、樣品的成像樣品中質(zhì)量密度小的區(qū)域，電子直接透射，形成亮區(qū)。樣品中質(zhì)量密度大的區(qū)域，由于電子散射，形成暗區(qū)。

3、電磁透鏡的放大作用電子顯微鏡的透鏡：電子的外加磁場。第13頁,共56頁，2024年2月25日，星期天磁透鏡使電子會聚的原理OO’z電子在磁透鏡中的運(yùn)動(dòng)軌跡AC第14頁,共56頁，2024年2月25日，星期天所有從O點(diǎn)出發(fā)的電子類似的軌跡運(yùn)動(dòng)，在v一定時(shí)，當(dāng)軌跡與軸的角度很小時(shí)，電子會聚在O’點(diǎn)（O）的象。O象物O’baα平行光軸電子束經(jīng)透鏡成象a-b為磁場作用區(qū)域。第15頁,共56頁，2024年2月25日，星期天三、電鏡的像差

1、球差球差是由于電子透鏡的中心區(qū)域和邊沿區(qū)域?qū)﹄娮拥臅勰芰Σ煌斐傻摹＿h(yuǎn)軸的電子通過透鏡時(shí)折射得比近軸電子要厲害的多，以致兩者不交在一點(diǎn)上，結(jié)果在象平面成了一個(gè)滿散圓斑2、衍射差電子通過光闌發(fā)生衍射。增大孔徑角可以減小衍射差。最佳孔徑角為10-2—10-3弧度。第16頁,共56頁，2024年2月25日，星期天αP’象P’’透鏡物P光軸球差第17頁,共56頁，2024年2月25日，星期天3、色差入射電子的速度不同，未能會聚于一點(diǎn)。電子的能量不同，從而波長不一造成的，電子透鏡的焦距隨著電子能量而改變，因此，能量不同的電子束將沿不同的軌跡運(yùn)動(dòng)。第18頁,共56頁，2024年2月25日，星期天能量為E的電子軌跡象1透鏡物P光軸色差能量為E-E的電子軌跡象2第19頁,共56頁，2024年2月25日，星期天4、象散磁場不對稱時(shí)，就出現(xiàn)象散。圓形物點(diǎn)的象就變成了橢圓形的漫散圓斑消像散器可減弱。第20頁,共56頁，2024年2月25日，星期天平面BPA透鏡平面物P光軸PBfA平面A象散第21頁,共56頁，2024年2月25日，星期天四、透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)電子光學(xué)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、供電系統(tǒng)電子光學(xué)系統(tǒng)照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)電子槍聚光鏡樣品室物鏡第一中間鏡第二中間鏡投影鏡觀察室照相艙自動(dòng)曝光裝置（一）電子光學(xué)系統(tǒng)第22頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

1、照明系統(tǒng)

a、電子槍陰極、陽極、柵極陰極：0.1mm粗的鎢絲，v型，2,227oC時(shí)，產(chǎn)生電子發(fā)射。陽極：相對于陰極有50—100千伏的正電位差，加速電子流。柵極：相對于陰極有100—500伏的負(fù)電位。調(diào)節(jié)到達(dá)陽極的電子量，并使電子束會聚一點(diǎn)。陰極陽極柵極第23頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

b、聚光鏡兩個(gè)電磁透鏡聚光鏡的作用是將電子束會聚在樣品上，控制照明束斑的大小及孔徑角。第24頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

2、成像與放大系統(tǒng)

a、樣品室插入支持銅網(wǎng)的樣品臂。b、物鏡短焦距的強(qiáng)磁透鏡，安裝了光闌和消像散器，決定分辨率。首次成像，放大100Х第25頁,共56頁，2024年2月25日，星期天c、中間鏡及投影鏡中間鏡：弱透鏡，放大20X，用來調(diào)節(jié)放大倍數(shù)。中間鏡越多放大倍數(shù)越大。透射電鏡成像的三級放大投影鏡：高倍放大透鏡，放大100X，越復(fù)雜的電鏡投影鏡越多。第26頁,共56頁，2024年2月25日，星期天3、觀察記錄系統(tǒng)

a、觀察室觀察室前方擋紫外線的鉛玻璃，用于肉眼觀察。底面是熒光屏，投射鏡產(chǎn)生的最終放大像形成在熒光屏上。

b、照相艙在觀察室下面，裝有底片。第27頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1、高壓電線2、電子槍室3、第一聚光鏡4、第二聚光鏡5、光闌6、樣品臂7、物鏡8、第一中間鏡9、第二中間鏡10、投影鏡11、觀察窗12、觀察室13、熒光板14、底片盒照明系統(tǒng)放大系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)第28頁,共56頁，2024年2月25日，星期天(二)真空系統(tǒng)真空泵（機(jī)械泵）油擴(kuò)散泵真空系統(tǒng)管道及自動(dòng)伐門預(yù)抽室、空氣干燥器真空檢測系統(tǒng)第29頁,共56頁，2024年2月25日，星期天(三)電源系統(tǒng)高壓電源電源系統(tǒng)透鏡電源附屬電源第30頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共56頁，2024年2月25日，星期天光源中間象物鏡樣品聚光鏡目鏡電子槍聚光鏡樣品物鏡中間象投影鏡觀察屏照相底板虛象第33頁,共56頁，2024年2月25日，星期天三、透射電鏡的樣品制作（一）超薄切片法主要步驟：取材固定洗滌脫水浸透包埋聚合修塊切片裝網(wǎng)電子染色上鏡觀察1、取材

1mm3（或mm2）活體取材，低溫，4oC。刀片鋒利，動(dòng)作輕巧迅速。第34頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2、固定電鏡常用固定劑：戊二醛、鋨酸固定方法：

戊二醛—鋨酸雙固定第35頁,共56頁，2024年2月25日，星期天前固定

2.5%戊二醛溶液，4oC，1—4小時(shí)。洗滌0.2M磷酸緩沖液，pH7.4，5—6次，每次10分鐘。后固定

1%的鋨酸溶液，4oC，1小時(shí)。洗滌0.2M磷酸緩沖液，pH7.4，3—4次，每次10分鐘。第36頁,共56頁，2024年2月25日，星期天c、注意事項(xiàng)溫度在低溫下進(jìn)行，4oC。時(shí)間與固定液的濃度、種類有關(guān)。不可隨意更改。固定液的pH接近組織的pH。固定液的濃度濃度過低，會發(fā)生組織腫脹、抽提；濃度過高，組織收縮或遭破壞。固定液的滲透壓應(yīng)該接近組織液的滲透壓。第37頁,共56頁，2024年2月25日，星期天3、脫水一定濃度的酒精或丙酮系列30%50%70%80%90%95%100%（2-3次），每步5—15分鐘。注意：

a、70%脫水劑以上各步都在低溫（4oC）下進(jìn)行。b、樣品只有在70%脫水劑，4oC可以存放過夜。c、脫水要徹底。第38頁,共56頁，2024年2月25日，星期天4、浸透

包埋劑成分：樹脂單體（環(huán)氧樹脂618#、Epon812等）、固化劑、增塑劑及加速劑。注意事項(xiàng)：浸透要充分；包埋劑配制時(shí)要混勻各種成分；用具要干燥，防止包埋劑吸潮。浸透過程：無水丙酮?無水丙酮+1/2包埋劑（4小時(shí)）純包埋劑（過夜）。第39頁,共56頁，2024年2月25日，星期天5、包埋與聚合包埋模包埋，加溫聚合。注意：防止產(chǎn)生氣泡；包埋后要干燥，防止吸潮。第40頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6、修塊注意事項(xiàng)：盡量削去樣品周圍的空白介質(zhì)，頂面呈梯形或方形，大小1mm2。梯形或方形的上下兩邊平行。第41頁,共56頁，2024年2月25日，星期天7、切片切片刀有鉆石刀和玻璃刀。

注意事項(xiàng)：切片刀要鋒利，否則切片上會出現(xiàn)劃痕。切片厚度500—1000?，面積1mm2以下。切片連成帶浮在水面上。第42頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共56頁，2024年2月25日，星期天8、裝網(wǎng)載網(wǎng)的類型：第44頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Formvar膜的制備：配制0.3%Formvar（聚乙烯醇縮甲醛）的二氯乙烷（或氯仿）溶液。切片用帶膜的銅網(wǎng)撈取，在顯微鏡下進(jìn)行。第45頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

9、電子染色醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色。10、上鏡觀察第46頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（二）負(fù)染色技術(shù)所謂負(fù)染色，負(fù)染色技術(shù)又稱為陰性染色術(shù)。是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。磷鎢酸滴染

第47頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)掃描電子顯微鏡技術(shù)一、掃描電鏡的結(jié)構(gòu)電子光學(xué)系統(tǒng)信號的收集轉(zhuǎn)換系統(tǒng)信號的顯示與記錄系統(tǒng)。真空和供電系統(tǒng)電子槍電磁透鏡掃描線圈第48頁,共56頁，2024年2月25日，星期天樣品入射電子直接透射電子小角度彈性