色譜分離技術(shù)

色譜分離技術(shù)

1906年，俄國(guó)植物學(xué)家Tsweet將CaCO3固體粉末裝入豎立的玻璃管中，從頂端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚連續(xù)地沖洗。結(jié)果在柱中出現(xiàn)了顏色不同的色帶。因此，Tsweet把這種方法稱為色譜法。第2頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天如今，色譜法不僅用于有色物質(zhì)的分離，而且大量用于無(wú)色物質(zhì)的分離。所以色譜法已經(jīng)失去原來(lái)的含義。但是，現(xiàn)在仍沿用色譜法這個(gè)名稱。色譜法具有分離及分析兩種功能。它是分析混合物最有力的手段。色譜分離是目前應(yīng)用最廣泛的分離方法。已廣泛地用于石油化工、有機(jī)合成、生理生化、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測(cè)、刑事偵查、生產(chǎn)在線控制，乃至空間探索等許多領(lǐng)域，以解決各種分離分析課題。第3頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天什么是色譜法？色譜法是一種分離、分析方法，有時(shí)又稱為層析技術(shù)。它利用被分離的諸物質(zhì)在互不相溶的兩相中分配系數(shù)等的微小差異進(jìn)行分離。當(dāng)兩相作相對(duì)移動(dòng)時(shí)，使被測(cè)物質(zhì)在兩相之間進(jìn)行反復(fù)多次分配，使原來(lái)微小的差異累加產(chǎn)生了很大的效果，形成差速遷移，使各組分在柱內(nèi)移動(dòng)的同時(shí)逐漸分離，以達(dá)到分離、分析及測(cè)定一些物理化學(xué)常數(shù)的目的。第4頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天兩種組分的理化性質(zhì)原本存在著微小的差異，經(jīng)過反復(fù)多次地吸附→解吸→再吸附→再解吸的過程使微小差異累積起來(lái)，結(jié)果使吸附能力弱的組分先流出色譜柱，吸附能力強(qiáng)的組分后流出色譜柱，從而使各個(gè)組分得到了分離。

吸附→解吸→再吸附→再解吸色譜過程第5頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)復(fù)雜混合物各組分進(jìn)行定量和定性分析第6頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天第7頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜法的特點(diǎn)1．分離效率高：可在很短的時(shí)間內(nèi)分離多達(dá)二、三百個(gè)組分的復(fù)雜物質(zhì)，柱效能可達(dá)106的理論板。2．檢測(cè)能力強(qiáng)：可以檢測(cè)出10-11~10-15克級(jí)的痕量組分，能滿足環(huán)境檢測(cè)、農(nóng)藥殘留等大量日常檢測(cè)分析的需要。3．樣品用量少：樣品用量一般為微升級(jí)，少的可達(dá)納克級(jí)。4．適用范圍廣：幾乎所有與化學(xué)有關(guān)的領(lǐng)域都有其用武之地。第8頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜分類流動(dòng)相與固定相聚集態(tài)第9頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜分類根據(jù)固定相的形狀：紙色譜、薄層色譜和柱色譜。根據(jù)分離操作方式：間歇色譜、連續(xù)色譜第10頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天檢測(cè)器色譜檢測(cè)器是一個(gè)將組分濃度和量信息轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的傳感器，信號(hào)的大小和組分的濃度或量成正比?，F(xiàn)用的液相色譜的檢測(cè)器分為兩種：①普通檢測(cè)器：它是測(cè)定流動(dòng)相加人溶質(zhì)后的某種物理性質(zhì)的變化；②溶質(zhì)性質(zhì)或選擇性檢測(cè)器：它只對(duì)溶質(zhì)的某些性質(zhì)是靈敏的。液相色譜的主要檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)散射光檢測(cè)器等。第11頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天第12頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天檢測(cè)器檢測(cè)下限/(g/ml)線性范圍選擇性梯度淋洗主要特點(diǎn)UV-Vis10-10103～104有可對(duì)流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很??；對(duì)溶質(zhì)的響應(yīng)變化大。熒光10-12～10-11103有可選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、pH和溶劑的影響電化學(xué)10-10103有困難選擇性高；易受流動(dòng)相pH值和雜質(zhì)的影響；穩(wěn)定性較差。蒸發(fā)光散射10-9無(wú)可可檢測(cè)所有物質(zhì)。示差折光10-1104無(wú)不可可檢測(cè)所有物質(zhì)；不適合微量分析；對(duì)溫度變化敏感。質(zhì)譜10-10無(wú)可主要用于定性和半定量。第13頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天氣相色譜氣相色譜法主要利用物質(zhì)的沸點(diǎn)、極性及吸附性質(zhì)的差異，以氣體為流動(dòng)相，以液體或固體為固定相從而達(dá)到分離混合物的色譜方法。第14頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天氣相色譜法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分離效率高、應(yīng)用范圍寬、分析速度快、樣品用量少;

靈敏度高、分離和測(cè)定一次完成、自動(dòng)化程度高.缺點(diǎn)：不適用于高沸點(diǎn)（>450℃）、有生物活性的物質(zhì)的分離測(cè)定不適用于制備.第15頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天第16頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天待測(cè)樣品在高溫的氣化室氣化后在惰性氣體的帶動(dòng)下進(jìn)入色譜柱，色譜柱內(nèi)含有液體或固體固定相每種組分都傾向于在流動(dòng)相和固定相之間形成分配或吸附平衡。但由于載氣是流動(dòng)的，這種平衡實(shí)際上很難建立。由于載氣的流動(dòng)，使樣品組分在運(yùn)動(dòng)中進(jìn)行反復(fù)多次的分配或吸附、解吸。結(jié)果是在載氣中分配濃度大的組分先流出色譜柱，而在固定相中分配濃度大的組分后流出色譜柱，進(jìn)入檢測(cè)器。第17頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天甲醇和乙醇混合樣色譜圖第18頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。第19頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效色譜儀第20頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來(lái)，由此得到液相色譜圖。第22頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)第23頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天笨和丙酮混合樣的色譜圖第24頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天液相色譜的主要特點(diǎn)是：分離效率高；選擇性好，適用于多種多元組分復(fù)雜混合物的分離；應(yīng)用范圍廣。從無(wú)機(jī)物到有機(jī)物，從天然物質(zhì)到合成產(chǎn)物，從小分子到大分子，從一般化合物到生物活性物質(zhì)等。第25頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換色譜法——

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離。

例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。主要色譜方法第26頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝膠滲透色譜親和色譜分子印跡色譜技術(shù)第27頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜理論研究色譜過程中分子運(yùn)動(dòng)的規(guī)律，探討微觀分子運(yùn)動(dòng)與色譜分離的內(nèi)在聯(lián)系。熱力學(xué)動(dòng)力學(xué)分離條件的選擇和優(yōu)化第28頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天吸附平衡溶質(zhì)吸附受眾多因素影響，不同模型根據(jù)不同的假設(shè)對(duì)吸附過程進(jìn)行描述。平衡吸附：線性函數(shù)：非線性函數(shù)：第29頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜相關(guān)術(shù)語(yǔ)

試樣經(jīng)色譜柱獲得分離，按先后次序經(jīng)過檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)器就將流動(dòng)相中各組分濃度變化轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，由記錄儀記錄下信號(hào)—時(shí)間曲線，稱為色譜流出曲線或色譜圖。第30頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜相關(guān)術(shù)語(yǔ)由色譜流出曲線可直接得到的相關(guān)術(shù)語(yǔ)：

基線

色譜峰

色譜時(shí)間由色譜流出曲線可間接得到的相關(guān)術(shù)語(yǔ)：

色譜體積

相對(duì)保留值第31頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天基線(Baseline)在色譜操作條件下，僅有流動(dòng)相通過檢測(cè)器時(shí)，由記錄儀得到的信號(hào)—時(shí)間曲線。基線漂移：基線隨時(shí)間定向緩慢的變化。基線噪聲：由于各種原因引起的基線波動(dòng)。不論有無(wú)組分流出，其噪聲均存在，它是一種背景信號(hào)。第32頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜峰(Chromatographicpeak)流動(dòng)相帶著組分通過檢測(cè)器時(shí)，由記錄儀得到的信號(hào)—時(shí)間曲線。峰底(Peakbase)：從峰的起點(diǎn)到峰的終點(diǎn)之間連線。峰高(Peakhight)：峰的頂點(diǎn)至峰底的垂直距離,通常用h表示。峰面積（Peakarea）：峰與峰底之間的面積，用A表示。第33頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜峰區(qū)域?qū)挾?Peakwidth)是色譜流出曲線的一個(gè)重要參數(shù)，它直接反映了分離條件的好壞。習(xí)慣上有下面三種表示方法：1）標(biāo)準(zhǔn)偏差：峰高0.607處色譜峰寬度的一半,用σ表示。2）峰寬或基線寬度：通過峰兩側(cè)的拐點(diǎn)作切線與峰底相交的寬度，用Y表示。與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為：Y=4σ。3）半峰寬：峰高一半處色譜峰的寬度,用Y1/2表示。與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為：Y1/2=2σ(2ln2)1/2。第34頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜時(shí)間色譜時(shí)間主要有：死時(shí)間（Deadtime）：不被固定相吸附或溶解的惰性組分，從進(jìn)樣到出峰的峰頂點(diǎn)之間測(cè)得的時(shí)間,用tM表示。保留時(shí)間（Retentiontime）：從進(jìn)樣到組分峰頂點(diǎn)之間測(cè)得的時(shí)間，用tR表示。調(diào)整保留時(shí)間(AdjustedRetentionTime)：調(diào)整保留時(shí)間指組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后的時(shí)間，用tR’表示。tR’=tR-tM第35頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜體積色譜體積主要有：死體積（DeadVolume）：死體積指色譜柱填充固定相后的空隙體積，又指在死時(shí)間內(nèi)流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的體積。死體積通常用Vm表示。

Vm=tM×FCFc表示流動(dòng)相的體積流速（mL/min）保留體積（RetentionVolume）：保留體積指從進(jìn)樣開始，到檢測(cè)器中樣品濃度最大時(shí)，流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的體積。通常用VR表示。

VR=tR×FC調(diào)整保留體積(AdjustedRetentionVolume)：調(diào)整保留體積指保留體積扣除死體積后的體積。通常用VR’

表示。

VR’=tR’

×FC第36頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天相對(duì)保留值（RelativeRetentionValue）相對(duì)保留值指某組分i與基準(zhǔn)組分s的調(diào)整保留值之比。通常用ris表示。第37頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天塔板理論它把色譜柱看成一個(gè)分餾塔．分餾塔是分離沸點(diǎn)不同的混合物的一種裝置，一般有十幾層塔片。在塔的底層加熱，利用各組分的揮發(fā)性不同，在塔片上經(jīng)過多次氣液平衡，最終低沸點(diǎn)組分在塔頂?shù)牧鞒鲆褐泻扛?，而高沸點(diǎn)組分在塔底層含量高。塔板理論，是人為的認(rèn)為在色譜柱中存在著塔片。在每個(gè)塔片高度的間隔內(nèi)，樣品混合物的各組分，在流動(dòng)相與固定相達(dá)到分配平衡。而后各組分被流動(dòng)相攜帶轉(zhuǎn)移至另一層塔片，再達(dá)分配平衡。第38頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天經(jīng)多次轉(zhuǎn)移平衡，各組分按分配系數(shù)大小的順序，依次流出色譜柱（分配系數(shù)小的先出柱）。由于一根色譜柱的塔片數(shù)比精餾塔多得多（103－104片），因此，只要分配系數(shù)間存在微小的差別，則可獲得很好的分離。第39頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天塔板理論是由Martin等人在平衡色譜理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。他們假定：1．流動(dòng)相按前進(jìn)方向以脈沖式通過柱子，最小單位為一塔板體積;2.組分在柱內(nèi)兩相間的分配系數(shù)是恒定的，與組分濃度及在柱內(nèi)的位置無(wú)關(guān);3.組分在所有塔板上的兩相平衡在瞬間建立;4.流動(dòng)相不能被壓縮；5.

所有組分濃度以起始塔板中的濃度為基準(zhǔn)第40頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天由塔板理論可得到：在色譜過程中色譜峰是要展寬的，展寬的寬度平方值和理論板高H成正比。即相達(dá)成“平衡”所需的距離H值越大，則色譜峰展寬也就越嚴(yán)重。反之，若理論板高H值越小。而就一定柱長(zhǎng)而言，組分在兩相間的“平衡”次數(shù)就越多，色譜柱的分離效率就越高，因此理論板高H值是衡量色譜柱效率的一個(gè)很好的指標(biāo)。塔板理論回答了影響色譜峰保留時(shí)間和峰寬度這二個(gè)重要問題，但它沒有回答寬度也就是相應(yīng)的理論板高究竟受哪些操作條件的影響。第41頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天

理論塔板數(shù)越大，峰形越窄，柱效越高。塔板高度表示單位柱長(zhǎng)下的柱效。塔板高度越小，表明柱效越高，理論塔板數(shù)越多。二項(xiàng)分布正態(tài)分布N>50第42頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1952年Lapidus等對(duì)填充柱色譜過程做了較詳細(xì)的研究，指出色譜過程中引起組分寬度擴(kuò)張的因素主要是：1.沿柱流動(dòng)方向的縱向擴(kuò)散效應(yīng)；2.組分在兩相間的平衡不能瞬時(shí)達(dá)成，即它在兩相交換時(shí)傳質(zhì)速度是有限的。非平衡速率理論第43頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天這就是著名的范底姆特方程。也可把VanDeemter方程描述為：

第44頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天與氣相色譜不同，液相色譜有其特點(diǎn)，因而其速率理論的表述方式也有區(qū)別：各項(xiàng)分別為：渦流擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散項(xiàng)、傳質(zhì)阻力項(xiàng)（固定相、流動(dòng)流動(dòng)相和滯留流動(dòng)相）第45頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天傳質(zhì)速率控制理論根據(jù)溶質(zhì)從液相主體到吸附劑上吸附點(diǎn)的過程建立模型。液膜傳質(zhì)擴(kuò)散速率控制模型吸附劑表面吸附速率控制模型孔擴(kuò)散速率控制模型第46頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝膠色譜是以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒為固定相，根據(jù)流動(dòng)相中所含各種組分的分子大小不同而達(dá)到物質(zhì)分離目的的一種色譜技術(shù)。凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜第47頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本原理大分子物質(zhì)在凝膠顆粒間隙中運(yùn)動(dòng)小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)結(jié)果使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。第48頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)：操作方便、不會(huì)使物質(zhì)變性、適用于不穩(wěn)定的化合物、凝膠不用再生、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：分離速度較慢。第49頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天分離過程第50頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝膠柱床總體積是各部分體積之和。溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)與被分離物質(zhì)分子大小及凝膠顆粒內(nèi)孔隙大小有關(guān)。Kd值在0~1之間?？赏ㄟ^實(shí)驗(yàn)求出Kd，進(jìn)而判斷溶質(zhì)的行為模式。第51頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝膠色譜介質(zhì)理想的凝膠過濾介質(zhì)具有高物理強(qiáng)度及化學(xué)穩(wěn)定性，能夠耐受高溫高壓和強(qiáng)酸強(qiáng)堿，具有高化學(xué)惰性，內(nèi)孔徑分布范圍窄，珠粒顆粒大小均一度高。凝膠粒度的大小對(duì)分離效果有直接的影響。目前，常用的有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。第52頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是應(yīng)用最廣泛的一類凝膠，國(guó)外商品名為Sephadex。它由葡聚糖Dextran交聯(lián)而得。交聯(lián)劑在原料總質(zhì)量中所占的百分?jǐn)?shù)叫交聯(lián)度。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后體積膨脹越少；反之，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越疏松，吸收量越多，吸水后體積膨脹越大。第53頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠來(lái)源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價(jià)交聯(lián)，是以氫鍵交聯(lián)的。它與葡聚糖不同，孔隙度是以改變瓊脂糖濃度而達(dá)到的。瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離操作的適宜工作條件是在pH為4.5～9，溫度0～40℃。瓊脂糖凝膠對(duì)硼酸鹽有吸附作用，不能用硼酸緩沖液。第54頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)成的。其穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好。洗脫時(shí)不會(huì)有凝膠物質(zhì)被洗脫下來(lái)。在pH2~11范圍穩(wěn)定。缺點(diǎn)是不耐酸，遇酸時(shí)酰胺鍵會(huì)水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)。第55頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.疏水性凝膠常用的疏水凝膠為聚甲基丙烯酸酯凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑的聚苯乙烯(如StyrogelBio-Beads-S)凝膠?！癝tyrogel”商品有11種型號(hào)，具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量1600到40000000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測(cè)定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好。第56頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝膠過濾介質(zhì)的選擇1.分離范圍2.分辨率3.穩(wěn)定性第57頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天操作方法1.凝膠的預(yù)處理市售凝膠必須經(jīng)過充分溶漲后才能使用，如果溶漲不充分，則裝柱后凝膠繼續(xù)溶漲，造成填充層不均勻，影響分離效果。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌、靜置、傾去上層混懸液、除去過細(xì)的粒子。如此反復(fù)多次，直至上層澄清為止。第58頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.層析柱的選擇層析柱的體積和高徑比與層析分離效果的關(guān)系相當(dāng)密切。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞。第59頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.凝膠柱的裝填空柱中應(yīng)留1/5的水或溶劑。所用凝膠必須是經(jīng)過充分溶漲的。開始進(jìn)膠后應(yīng)當(dāng)打開柱端閥門并保持一定流速，太快的流速往往造成凝膠板結(jié)，對(duì)分離不利。進(jìn)膠過程必須連續(xù)、均勻，不要中斷，并在不斷攪拌下使膠均勻沉降。為此，層析柱要始終保持垂直。凝膠懸液濃度也需控制，過稀和過濃都會(huì)產(chǎn)生不利影響。第60頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.樣品處理和加樣分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。加樣時(shí)盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動(dòng)。第61頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.洗脫與收集為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復(fù)性下降，整個(gè)洗脫過程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要穩(wěn)定。洗脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠顆粒的脹縮引起柱床體積變化或流速改變。第62頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝膠色譜的應(yīng)用脫鹽去除小分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。分離純化濃縮第63頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換色譜是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換介質(zhì)中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化目的的方法。該方法分辨率高、容量大、容易操作。第64頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本原理帶電物質(zhì)因電荷力作用而在固定相與流動(dòng)相之間分配得以相互分離。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。當(dāng)pH<pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷；當(dāng)pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷。由于各種蛋白質(zhì)等生物大分子的等電點(diǎn)不同，可以通過改變?nèi)芤旱膒H和離子強(qiáng)度來(lái)影響它們與離子交換樹脂的吸附作用，從而將它們相互分離開來(lái)。第65頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換的基本過程(1)初始穩(wěn)定狀態(tài)(2)離子交換過程(3)洗脫過程(4)介質(zhì)的再生過程第66頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天abcde離子交換的基本過程第67頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換介質(zhì)根據(jù)介質(zhì)材料——多糖、樹脂、MonoBeads系。按活性基團(tuán)分類1)陽(yáng)離子交換樹脂活性基團(tuán)為酸性，對(duì)陽(yáng)離子具有交換能力。

2)陰離子交換樹脂活性基團(tuán)為堿性，對(duì)陰離子具有交換能力。第68頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換吸附和解吸條件樹脂選擇pH值離子強(qiáng)度第69頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換樹脂的再生樹脂去雜酸堿處理轉(zhuǎn)型毒化指樹脂失去交換性能且難以恢復(fù)的現(xiàn)象。第70頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天正相色譜與反向色譜如果采用極性固定相和相對(duì)非極性流動(dòng)相，就稱為正相；如果采用相對(duì)非極性固定相和極性流動(dòng)相，則稱為反相。極性化合物更容易被極性固定相所保留，所以正相液-液色譜系統(tǒng)一般可用于分離極性化合物。相反，反相液-液色譜系統(tǒng)一般可用于分離非極性或弱極性化合物。正相色譜的流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出；反相色譜的流出順序正好相反。第71頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天正相色譜和反向色譜的比較第72頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天正相色譜的特點(diǎn)第73頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天反向色譜的特點(diǎn)第74頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天第75頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天介質(zhì)正相色譜常采用氰基柱、氨基柱、硅膠柱和二醇基柱。反向色譜介質(zhì)的代表為具非極性分子層的硅膠體系。第76頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相的選擇極性回收利用不干擾檢測(cè)洗脫方式第77頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)用正相色譜：提純紫杉醇手性拆分反向色譜：乳制品有機(jī)酸分析植物油中維生素分析分離黃酮類物質(zhì)第78頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天疏水色譜利用蛋白質(zhì)上的疏水基團(tuán)或區(qū)域在一個(gè)疏水作用體系中，與介質(zhì)上的疏水基團(tuán)作用，達(dá)到吸附平衡，然后在一定條件下，解吸達(dá)到分離目的。其原因是蛋白質(zhì)和配基疏水基團(tuán)周圍水分子的重排和置換。第79頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天利用樣品中各組份與色譜填料上配基相互作用力的差異,在洗脫時(shí)由于各組份移動(dòng)速度的不同而達(dá)到分離的目的.配基通常是一些疏水性基團(tuán),如丁基、苯基等.蛋白質(zhì)表面多由親水性基團(tuán)組成,也有一些由疏水性較強(qiáng)的氨基酸組成的疏水性區(qū)域.不同種類蛋白質(zhì)的表面疏水性區(qū)域多少不同,疏水性強(qiáng)弱也不同;對(duì)于同一種蛋白質(zhì)在不同介質(zhì)中,其疏水性區(qū)域伸縮程度也不同,從而使疏水性基團(tuán)暴露的程度呈現(xiàn)出一定的差異。疏水相互作用色譜法正是利用鹽-水體系中樣品組份的疏水性基團(tuán)和色譜填料的疏水性配基相互作用力的不同而使樣品組份得以分離的.第80頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天介質(zhì)制備以瓊脂糖和硅膠等為主體，引入丁基和苯基等疏水配基。配基碳數(shù)越多，疏水作用力越大，吸附容量也越大，但解析越難。丁基<苯基<辛基第81頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響因素配基種類和密度第82頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天鹽種類和濃度的影響

有些鹽(如Na2SO4,(NH4)2SO4等)可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,使其溶解度下降,對(duì)蛋白質(zhì)有鹽析效應(yīng),使蛋白質(zhì)與固定相的疏水作用增強(qiáng);有些鹽(如MgCl2)雖然能增加溶劑表面張力,但同時(shí)也增加蛋白質(zhì)的溶解度,并不能增強(qiáng)蛋白質(zhì)與色譜填料的相互作用.鹽的種類不同,不僅影響著蛋白質(zhì)在色譜柱上的保留行為,同時(shí)也影響著蛋白質(zhì)分離純化的效果.

第83頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天平衡液及樣品中的高鹽濃度能促進(jìn)蛋白質(zhì)與配基的相互作用，在一定鹽濃度范圍之內(nèi),蛋白質(zhì)的吸附量與鹽濃度成線性關(guān)系。被吸附的蛋白質(zhì)可以通過降低鹽濃度而被洗脫下來(lái)。第84頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天鹽濃度越高，吸附容量越大；鹽析效果越顯著，影響越大第85頁(yè),共96頁(yè)，2024年2月25日，星期天pH對(duì)疏水色譜的影響

pH的改變必然改變蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)及電荷量，從而影響蛋白質(zhì)與色譜填料間的靜電相互作用，也影響蛋白質(zhì)在色譜柱上的保留行為。