外周血單個核細(xì)胞分離

外周血單個核細(xì)胞的分離及(Ji)活力測定IsolationandstorageofPBMCandviabilitytest第一頁，共二十頁。實(Shi)驗原理人外周血單個核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。單個核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細(xì)胞不同。因此利用一種介于1.075-1.090之間的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細(xì)胞在分離液中呈梯度分布,從而分離出PBMC。第二頁，共二十頁。人血液中各種細(xì)胞的密度(Du)如下：紅細(xì)胞：1.093白細(xì)胞：1.092淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞：1.075-1.090血小板：1.030-1.035F/H=1.077±0.001第三頁，共二十頁。肝素抗凝全血(Xue)+等量Hanks液將F/H管稍傾斜將稀釋血液在距分層液界面上1cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面。應(yīng)注意保持兩界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。Ficoll/Hypaque(2:1)1500rpm,20min水平離心第四頁，共二十頁。血小板第五頁，共二十頁。第六頁，共二十頁。⒈簡述補(bǔ)體的概念、分泌細(xì)胞及激活途徑。⒉簡述補(bǔ)體的經(jīng)典激活途徑的具體過程(Cheng)。⒊補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)為什么需分兩階段進(jìn)行？如果將幾種成分反應(yīng)順序顛倒，結(jié)果會如何？⒋參加補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的各已知成分，為什么須預(yù)先滴定？試驗中所設(shè)計的四種對照管有何意義？第七頁，共二十頁。用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色層，沿管壁輕輕吸出該層的單個核細(xì)胞，盛入另一支(Zhi)離心管中。將所得到的PBMC懸液用5倍體積的Hanks液或RPMI-l640洗滌2次，1500rpm5min。第八頁，共二十頁。淋巴細(xì)(Xi)胞濃度（細(xì)(Xi)胞數(shù)/ml）=四個大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/4×104細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞至所需濃度第九頁，共二十頁。臺盼藍(lán)(Lan)染色測定細(xì)胞存活率臺盼藍(lán)（trypanblue）染色法是測定細(xì)胞活力的最簡便的方法。臺盼藍(lán)又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，它不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán)色。細(xì)胞存活率(%)＝無色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%計數(shù)200個細(xì)胞，一般活性應(yīng)在95％以上第十頁，共二十頁。注(Zhu)意事項1.與血液樣品接觸時應(yīng)注意安全防護(hù)，避免血源性傳染病傳染。2.操作應(yīng)輕柔，細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻，避免損傷細(xì)胞活性及細(xì)胞丟失。3.細(xì)胞分層液在室溫下比重為l.077±0.001g/L；應(yīng)避光4℃下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用。使用中應(yīng)避免細(xì)菌污染。4.稀釋血液可降低紅細(xì)胞的凝集，提高淋巴細(xì)胞收獲量，但如果要保留血漿成分作其他實驗用時，則不能稀釋血液，以免影響血漿成分。第十一頁，共二十頁。E玫瑰(Gui)花環(huán)試驗

Erythrocyterosetteformationtest第十二頁，共二十頁。原(Yuan)理T淋巴細(xì)胞表面有綿羊紅細(xì)胞受體（CD2），不需要任何處理可與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合形成花環(huán)，B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞無綿羊紅細(xì)胞受體，因此形成E花環(huán)的細(xì)胞主要是T淋巴細(xì)胞。計算外周血中E花環(huán)形成細(xì)胞的百分率，可從數(shù)量大致推測機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。第十三頁，共二十頁。原(Yuan)理TcellsSRBCE-rosette第十四頁，共二十頁。E玫(Mei)瑰花環(huán)試驗高倍鏡下計數(shù)200個以上的淋巴細(xì)胞中花環(huán)形成細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。凡能結(jié)合三個以上SRBC者為花環(huán)形成細(xì)胞。正常值：60-80%第十五頁，共二十頁。淋巴細(xì)胞功能(Neng)檢測—淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗Detectionoflymphocytefunction：lymphocytetransformationtest第十六頁，共二十頁。原(Yuan)理指體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞與特異性抗原或非特異性促有絲分裂物質(zhì)如植物血凝素（PHA）等接觸后發(fā)生胚變（或返祖）現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞的一種方法。淋巴細(xì)胞在抗原或促有絲分裂原的刺激下淋巴細(xì)胞的DNA合成而分裂增殖，并在細(xì)胞形態(tài)上也向母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此通過形態(tài)學(xué)觀察或同位素?fù)饺敕蓽y得細(xì)胞分裂增殖的程度，從而判斷淋巴細(xì)胞對有關(guān)刺激物的反應(yīng)及其功能，以此了解機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。第十七頁，共二十頁。轉(zhuǎn)化(Hua)的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞第十八頁，共二十頁。意(Yi)義由轉(zhuǎn)化率的高低可以了解人體免疫功能狀況。正常人淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為50－70%，故此試驗可作為某此疾病診斷和治療的參考。第十九頁，共二十頁。內(nèi)容(Rong)總結(jié)外周血單個核細(xì)胞的分離及活力測定。因此利用一種介于1.075-1.090之間的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細(xì)胞在分離