第4講細胞融合與體細胞雜交

第4講細胞融合與體細胞雜交新品種培育技術(shù)雜交1.通過不同的基因型的個體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個體的方法。2.兩條單鏈DNA或RNA的堿基配對。雜交優(yōu)勢：兩個遺傳基礎(chǔ)不同的植物或動物進行雜交，其雜交后代所表現(xiàn)出的各種性狀均優(yōu)于雜交雙親，比如抗逆性強、早熟高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等。一般情況下，通過生殖細胞相互融合而達到這一目的過程稱為雜交。較多的是種間、種內(nèi)雜交。由體細胞相互融合達到這一結(jié)果的過程稱為體細胞雜交。部分野生品種的塊莖、果實雖不能食用，但它們的植株具有較強的抗病蟲害、抗鹽堿性和耐寒能力。因此，用野生馬鈴薯和番茄分別與馬鈴薯、番茄作物雜交，培育出了生存能力較強的雜交系植物。雜交玉米等雜交植物比它們的親本更為健壯，產(chǎn)量更高。雜交擬南芥（中間）比其親本（左和右）要大《自然》（Nature）2008年11月23日：中美科學家近日研究發(fā)現(xiàn)雜交植物比其親本生長更大更好的原因:負責光合作用和淀粉代謝的基因在白天要更為活躍不親和性不親和性：在有性生殖過程中，由于生物個體的細胞或組織水平上的不協(xié)調(diào)而使受精或接合不能正常進行，或是受精后不能產(chǎn)生后代的現(xiàn)象。例如：生殖細胞不能融合，或受精卵不能發(fā)育，或子代無繁殖能力等。是雙親個體間基因型的不協(xié)調(diào)或是染色體組非同源性在生殖生理表型上的一種反映。不親和性是穩(wěn)定物種的重要機理之一。種間不親和性：異種、異屬生物個體之間的生殖不親和現(xiàn)象常由染色體組的不同所造成。一般地說，越是遠緣則不親和性越高，直到完全不能受精。種內(nèi)不親和性：種內(nèi)個體間的不親和現(xiàn)象往往是受不親和基因所制約而并不是染色體組不同的結(jié)果。遠源雜交遠緣雜交：不同種屬之間，或是地理上遠緣的種內(nèi)亞種之間個體的交配稱為遠緣雜交。由于種屬間存在著種種隔離機制，致使遠緣雜交常表現(xiàn)不親和或獲得的遠緣雜種表現(xiàn)不育。體細胞雜交是解決遠源雜交不親和性的有力手段之一，更好地利用自然界基因資源，培育新物種視頻：/special/show_3043714/ACRkYAQc9LIhIUwv.html第一部分細胞融合一定義與意義細胞融合（Cellfusion）是指使用人工方法使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的技術(shù)。對于植物也叫“原生質(zhì)體融合”。親本細胞是體細胞，也叫“體細胞雜交（somaticcellhybridization）”。由于它不僅能產(chǎn)生同種細胞融合，也能產(chǎn)生種間細胞的融合，因此細胞融合技術(shù)在創(chuàng)造新細胞、培育新品種方面意義重大。二細胞融合的分類1.材料：原生質(zhì)體（去除了細胞壁的裸露的細胞）、動物細胞。2.從親本來源：（1）同核體（Homokaryon）：基因型相同的細胞融合成的融合細胞稱為。（2）異核體（Heterokaryon）：來自不同基因型的融合細胞。3.從融合效果：（1）對稱融合（Symmetricfusion）：兩個完整的細胞間的融合。（2）不對稱融合（Asymmetricfusion）：利用物理或化學方法使某親本的核或細胞質(zhì)失活后再與另外一個完整細胞進行融合。三發(fā)展歷史自發(fā)融合現(xiàn)象最初在動物細胞中發(fā)現(xiàn)。1858年發(fā)現(xiàn)正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞情況。動物體內(nèi)的破骨細胞也是自發(fā)融合形成的多核細胞。1962年日本學者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞的現(xiàn)象。20世紀70年代初，華裔加籍科學家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能促使植物原生質(zhì)體融合，開拓了植物細胞融合的研究。20世紀80年代，齊默曼（Zimmerman）等建立電場誘導細胞融合方法。主要環(huán)節(jié)（1）親本選擇（單細胞或原生質(zhì)體制備）（2）兩原生質(zhì)體或細胞互相靠近，粘附（3）質(zhì)膜融合形成細胞橋（4）胞質(zhì)滲透（5）細胞核融合（6）融合細胞篩選原生質(zhì)體及其制備（1）定義：去除細胞壁后裸露的細胞稱之為原生質(zhì)體（protoplast）。（2）特點：無細胞壁，可以方便地進行遺傳操作、人工誘變、細胞器轉(zhuǎn)移、細胞融合等操作。具有全能性，能再生細胞壁。（3）制備（4）分離、鑒定與活力分析（1）分離飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll等。離心法：低速離心，收集沉淀。（2）鑒定與活力分析低滲爆破：爆破后是無形的。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。染色發(fā)法：有活力的原生質(zhì)體吸收不同染料顯示與死亡細胞不同的顏色來分析。FDA（二乙酸熒光素）能自由地穿越細胞質(zhì)膜，在活細胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細胞的觀察確定細胞活性。關(guān)鍵：細胞核的融合五細胞融合方法1.生物法病毒誘導細胞融合：研究最早的細胞融合誘導方法。主要是由于病毒會與宿主細胞膜直接融合，同時進入兩個細胞就會打破兩個細胞膜的隔閡，引發(fā)細胞質(zhì)的交流，進而達到細胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣與動物細胞膜相似，病毒外殼上的某些糖蛋白有促進細胞融合的功能。仙臺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙臺病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。缺點：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細胞。因此，目前已經(jīng)很少使用病毒誘導法進行細胞融合。原理與過程（1）足夠量的病毒顆粒附著在細胞膜上起搭橋作用，使細胞聚集在一起。（2）通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相融合。粘結(jié)部位質(zhì)膜被破壞，不同細胞間形成通道，細胞質(zhì)流通并融合（病毒也隨之進入細胞質(zhì)）。（3）有絲分裂，細胞核融合，形成雜種細胞。2化學法可以采用的化學誘導劑包括：NaNO3、高pH的高濃度Ca2+離子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明膠、抗體、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。細胞膜電荷平衡被打破。（1）NaNO3誘導融合1909年，凱斯特（Kuster）發(fā)現(xiàn)機械分離的發(fā)生了質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細胞原生質(zhì)體在NaNO3溶液中可以恢復并伴隨著細胞融合。1972年，卡爾森（Carlson）利用NaNO3誘導融合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質(zhì)體，培育出世界第一株體細胞雜種。NaNO3的鈉離子可以中和原生質(zhì)體表面負電荷，引起原生質(zhì)體聚集，促進細胞融合。NaNO3對原生質(zhì)體無損害，但融合效率低，一般小于4%。（2）高pH的高濃度Ca2+離子誘導融合1973年，凱勒（Keller）和梅爾切斯（Melchers）發(fā)現(xiàn)采用強堿性（例如pH10.5）的高濃度鈣離子溶液（50mmol/LCaCl2?2H2O）在37℃下處理兩個品系的煙草葉肉原生質(zhì)體，很容易促使融合，融合率可以達到10%。鈣離子中和原生質(zhì)體膜或細胞膜表明表面電荷，使彼此緊密接觸，決定質(zhì)膜的穩(wěn)定性和可塑性；高pH能改變質(zhì)膜的表面電荷，利于細胞融合。（3）PEG誘導聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在200－20,000之間，分子量1,000以下者為液體，1,000以上者為固體。

PEG分子具有輕微的負極性，可以與具有正極性基團的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。當PEG分子被洗脫時，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團可能與另外一個原生質(zhì)體中帶負電的基團相連，導致原生質(zhì)體融合。（4）高Ca2+和pH誘導PEG結(jié)合誘導細胞融合例子1

甘藍與大白菜的化學誘導融合3物理法電融合誘導法（Electrofusion）：利用電場來誘導細胞彼此連接成串，再施加瞬間強脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進細胞融合的技術(shù)。原理：在直流電脈沖的刺激下，細胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。優(yōu)點：融合率高、重復性與可控制性強。缺點：可能會造成不可恢復的細胞損傷。細胞融合舉例2

——薄荷的電誘導融合六融合細胞篩選因融合的隨機性而成為細胞融合的關(guān)鍵而必需的技術(shù)1篩選的原因與必要性細胞融合是一個隨機的物理過程，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細胞，分離出需要的雜種細胞，從而解決融合細胞的選擇問題。問題：A與B融合過程中，你能預見有哪些形式的細胞嗎？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B，A-A-B,B-B-A等多聚體。未融合的A，B。2雜種細胞篩選方法（1）細胞形態(tài)大小差異（2）選擇性培養(yǎng)基篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細胞的方法。例如：利用抗性標記、酶缺陷型、激素需求差異等。親本原生質(zhì)體生長要求外源激素，而有的雜種細胞由于雙親互補作用會產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使雜種細胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長。（3）再生后雜種與親本形態(tài)、性質(zhì)差異細胞融合例子3：

利用抗性標記進行的融合細胞篩選七細胞融合的應(yīng)用植物：體細胞雜交培育新品種動物：單克隆抗體生產(chǎn)（動物細胞生物制藥講授）第二部分體細胞雜交Somaticcellhybridization一體細胞雜交育種的意義1克服有性不親和性，實現(xiàn)遠源遺傳重組。2問題：與基因工程改造相比有什么優(yōu)點？植物的抗逆性多為多基因控制，因此易于實現(xiàn)多基因控制性狀。二技術(shù)路線關(guān)鍵技術(shù)：細胞融合、組織培養(yǎng)三植物新品種培育解析

文獻討論例子4：屬間體細胞雜交結(jié)果與討論雜種植物的鑒定思考題1.該論文的研究目的和意義是什么？2.作者如何優(yōu)化細胞融合的條件的？3.作者如何優(yōu)化融合體的培養(yǎng)條件的？4.