免疫組化技術課件

免疫組織化學技術

5/8/20241免疫組化技術課件

概念:

指在組織細胞原位通過抗原抗體反應和呈色反應，借助可見的標記物，對相應的抗原或抗體進行定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法5/8/20242免疫組化技術課件基本原理

通過免疫學中抗原抗體結(jié)合反應，用特異性抗體（單克隆或多克?。z測組織、細胞內(nèi)相應的抗原物質(zhì)，形成抗原—抗體復合物；此復合物上帶有事先標記的標記物，通過與標記物相對應的檢測系統(tǒng)，如酶底物顯色反應可使之呈現(xiàn)某種顏色，從而可檢測組織細胞內(nèi)的抗原，以達到診斷、鑒別診斷和研究的目的。5/8/20243免疫組化技術課件組織抗原抗體標記物

標記抗體1熒光2酶3親和技術4金標5/8/20244免疫組化技術課件組織抗原

免疫細胞化學反應原理：＋標記抗體標記的抗原抗體復合物5/8/20245免疫組化技術課件間接法

直接法

兩種免疫細胞化學反應方法5/8/20246免疫組化技術課件組織與細胞材料的制備免疫組織化學方法應用5/8/20247免疫組化技術課件組織與細胞材料的制備組織石蠟切片制作組織冰凍切片制作細胞爬片制作細胞涂片制作5/8/20248免疫組化技術課件切片的制作組織的固定組織石蠟包埋切片5/8/20249免疫組化技術課件目的:使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止胞內(nèi)酶活化反應，防止細胞自溶，保持細胞固有形態(tài)與結(jié)構(gòu)，防止細胞脫落，去除干擾抗原抗體反應的類脂，最主要的是保存組織細胞的抗原性，在染色和反復清洗的過程中使抗原不致釋放。組織材料的固定5/8/202410免疫組化技術課件影響固定的因素1.溫度一般固定液固定效果隨溫度升高而加強，以室溫22℃

為常用。2．濃度

10％中性甲醛，4％多聚甲醛固定液3.固定時間

要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時間成正比，固定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。組織固定后，必須徹底沖洗以去除固定液5/8/202411免疫組化技術課件組織的脫水脫水就是用某些溶劑將組織中的水分置換出來的過程。不同的組織應分開脫水，特別是對一些易脆的組織（肝、脾等）應嚴格掌握脫水時間。動物組織的脫水時間應比人體相應標本時間短脫水應按照從低濃度到高濃度的過程。5/8/202412免疫組化技術課件組織的透明、浸蠟、包埋組織透明的目的是便于浸臘包埋組織透明不徹底的原因主要是固定、脫水不良以及透明劑的純度不夠。最常用的透明劑為二甲苯浸蠟包埋是使蠟進入到組織中使其變硬便于切片。蠟的熔點一般為56-58

℃。包埋蠟的溫度應與組織塊溫度接近。5/8/202413免疫組化技術課件大組織：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％乙醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ過夜，無水乙醇Ⅰ30～60min，無水乙醇Ⅱ30～60min，無水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可視觀察結(jié)果而定），石蠟Ⅰ30min,石蠟Ⅱ1～2h，石蠟Ⅲ2～3h。小組織：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ過夜或2h，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min（肉眼觀察），石蠟Ⅰ30min，石蠟Ⅱ30min，石蠟Ⅲ1～2h。組織石蠟包埋5/8/202414免疫組化技術課件切片載玻片的清潔：

清潔液浸泡24小時后依次自來水、雙蒸餾水洗，95%酒精浸泡2小時，擦拭干凈。如需開展原位雜交，還需將玻片240℃烤2h。切片粘合劑的使用：

多聚賴氨酸（分子量200KD）：0.05%濃度，浸泡5分鐘，60℃烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥備用。

5/8/202415免疫組化技術課件切片：

石蠟切片：

(1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/3。

(2)60℃烤片3-8h。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)編上號

(6)切片可在4℃保存數(shù)年

冰凍切片：

5/8/202416免疫組化技術課件細胞爬片制作將處理好的蓋玻片放入接種了細胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內(nèi)。待細胞生長達到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上?？杉痈视头獯嬷糜诹阆?0度保存。5/8/202417免疫組化技術課件細胞涂片制作離心將細胞收集出來，用預冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS將細胞重懸。吸取30－50ul（可根據(jù)細胞量調(diào)整）滴至處理過的載玻片上，然后涂抹均勻。待稍微風干以后加4％多聚甲醛溶液覆蓋細胞，固定2－4小時。在細胞上加一層甘油放-20℃保存。5/8/202418免疫組化技術課件抗原暴露和修復石蠟包埋材料大都用甲醛固定保存，固定劑甲醛使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固,在發(fā)生凝固的過程中可引起自身和不同蛋白質(zhì)之間通過甲基化橋使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),導致蛋白質(zhì)三級或四級結(jié)構(gòu)的折疊方向發(fā)生改變,并形成網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)而掩蓋抗原決定蔟。染色不理想，甚至出現(xiàn)假陰性，因而在進行免疫組化反應之前，需要抗原暴露和修復，可使抗原決定簇重新裸露。

抗原暴露和修復常用方法有二種,一是用酶消化,二是用熱處理(微波輻射法、高壓法及隔水加熱法)5/8/202419免疫組化技術課件直接加熱法

最常用,操作方法是將介質(zhì)溶液用燒杯在電爐上加熱至100℃,放入切片并保持95～100℃20min,在室溫中自然冷卻20min即可。熱修復熱介質(zhì)0.01mol/LPH6.0檸檬酸緩沖液,最常用。5/8/202420免疫組化技術課件微波輻射抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘。⑤待修復液自然降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學的染色方法進行染色。

5/8/202421免疫組化技術課件高壓抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入抗原修復液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)1－4分鐘。

⑤待修復液自然或冷水沖洗恢復至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學染色方法進行染色。

5/8/202422免疫組化技術課件隔水熱抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水鍋中加熱，其間應不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復液的溫度達到有效溫度后（92℃↑）。即開始計時，持續(xù)40分鐘。

⑤待抗原修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進行染色。

5/8/202423免疫組化技術課件胃蛋白酶消化法：

主要用于細胞間質(zhì)抗原的檢測,如纖維蛋白及各類膠原的現(xiàn)示。使用工作濃度為0.4％。配制方法:稱取400mg胃蛋白酶加入到100ml0.01mol/LHCl中,組織切片在37℃消化30～60min。

5/8/202424免疫組化技術課件胰蛋白酶消化法：

最常用,主要用于細胞內(nèi)抗原的檢測。使用工作濃度為0.05～0.1％。配制方法:稱取0.05g或0.1g胰蛋白酶及0.1g無水氯化鈣,加入到100ml蒸溜水中,待溶解后用0.1mol/LNaOH調(diào)PH值至7.6。組織切片在37℃消化10～40min。

5/8/202425免疫組化技術課件蛋白酶K消化法主要用于原位雜交前標本的處理,常用的工作濃度為0.025mg/ml(25ug/ml)。配制方法:稱取0.025mg蛋白酶K加入到1mlPK緩沖液中。(PK緩沖液:1mol/LPH8.0的Tris-Hcl10ml;0.5mol/LEDTA10ml;雙蒸水80ml,三液充分混合即可)。5/8/202426免疫組化技術課件組織切片中內(nèi)源性酶的阻斷內(nèi)源性過氧化物酶主要存在于紅細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和組織內(nèi)。阻斷方法：最常用0.3%~0.5%H2O2-甲醇液，作用15~30min，阻斷液必須使用時新鮮配制。由于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶常同時導致被測抗原變性（使特異性著色減弱），而大部分組織不含有內(nèi)源性過氧化物酶，所以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶一般不必作為常規(guī)步驟。5/8/202427免疫組化技術課件免疫染色標記抗體與標本中抗原反應并形成抗原抗體復合物；用緩沖液沖洗去未結(jié)合的成分；直接在顯微鏡下觀察結(jié)果（免疫熒光直接法），或待標本顯色后再用顯微鏡觀察結(jié)果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫組化技術的關鍵步驟。5/8/202428免疫組化技術課件免疫組織化學方法熒光標記免疫組織化學酶聯(lián)免疫組織化學5/8/202429免疫組化技術課件熒光標記免疫組織化學

直接法間接法5/8/202430免疫組化技術課件

免疫熒光技術將

熒光素作為標記物使組織細胞中形成的抗原抗體復合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質(zhì)的定位

免疫熒光技術5/8/202431免疫組化技術課件

１.異硫氰酸熒光素FITC

２.四乙基羅達明３.四甲基異硫氰酸羅達明４.藻紅蛋白

▲呈現(xiàn)不同的熒光：綠色熒光(FITC)

橙色熒光

橙紅色熒光

紅色熒光等

熒光素

作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物5/8/202432免疫組化技術課件

熒光：

在激發(fā)光（熒光顯微鏡提供）的照射下，能發(fā)出較激發(fā)光波長更長的可見光并隨照射停止而消失

熒光顯微鏡：

熒光顯微鏡的光源提供各種激發(fā)光，如紫外光、藍紫光（有不同的波長范圍），使受檢標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)出發(fā)射光5/8/202433免疫組化技術課件海馬細胞

微管蛋白綠色(胞體、樹突)

軸突終末蛋白紅色(突觸)5/8/202434免疫組化技術課件

培養(yǎng)的成纖維細胞微管呈綠色核呈藍色5/8/202435免疫組化技術課件免疫酶組織化學酶標記抗體法非標記抗體免疫酶法多聚螯合物酶法5/8/202436免疫組化技術課件酶標記抗體法是用結(jié)合物將酶標記（共價鍵或非共價鍵方法結(jié)合）在抗體分子上，通過抗原-抗體反應使抗原-抗體復合物上帶有酶分子，再借助酶對底物的特異性催化作用，在抗原-抗體反應部位形成不溶性有色產(chǎn)物，在顯微鏡下觀察組織中抗原的性質(zhì)和分布。可用作標記抗體的酶有多種，但最常用的為辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）和堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AKP）其方法可分直接法和間接法兩種。直接法直接法是將酶（如HRP）直接標記在特異性抗體上，然后與組織中的相應抗原相結(jié)合，形成抗原-抗體-HRP復合物，最后進行顯色。5/8/202437免疫組化技術課件②間接法間接法也稱夾心法，是將酶標記在第二抗體上（第二抗體為抗第一抗體的抗體），形成抗原-第一抗體-第二抗體-HRP復合物，然后進行顯色。該法要求第二抗體與第一抗體應是不同種屬的動物產(chǎn)物。間接法應用廣泛，只需標記一種二抗就可以檢測眾多相同種屬來源的一抗。5/8/202438免疫組化技術課件免疫組化SP法的基本步驟

（1）石蠟切片脫蠟至水。（2）抗原修復（3）3%H2O2室溫孵育5~10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。（4）蒸餾水沖洗，PBS洗。（5）5%~10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10min。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的第一抗體或即用型第一抗體，37℃孵育2h或4℃過夜。（6）PBS沖洗，5min×3次。（7）滴加適當比例稀釋的二抗，37℃或室溫孵育10~30min。（8）PBS沖洗，5min×3次。（9）滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋）或辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30min。（10）PBS沖洗，5min×3次。（11）顯色劑顯色（DAB或AEC）。（12）自來水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，蘇木精復染，中性樹膠封片。5/8/202439免疫組化技術課件2、非標記抗體免疫酶法在酶標記抗體過程中可降低部分抗體和酶的活性，使得抗體的效價降低。另外，血清中的非特異性抗體也可被酶標記，引起非特異性背景。非標記抗體免疫酶法是先用酶（HRP或AKP）去免疫動物，使其產(chǎn)生抗酶抗體，再將該抗酶抗體與酶結(jié)合，形成五環(huán)的復合物，例如PAP（HRP）、APAAP（AKP）等復合物。該復合物由于沒有一個抗體受到共價鍵標記，保留了免疫活性，因此敏感性大大提高。非標記抗體免疫酶常用的有酶橋法，辣根過氧化物酶抗辣根過氧化物酶復合物（peroxidaseantiperoxidasecomplexmethod,PAP）法、堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶復合物（APAAP）法。5/8/202440免疫組化技術課件3．多聚螯合物酶法該法是以高分子葡聚糖多聚化合物或氨基酸為骨架與抗體結(jié)合，將抗體（一抗或二抗）與HRP結(jié)合在一起，形成葡聚糖+HRP+抗體的巨大復合物，然后通過酶的底物進行顯色。該法簡便、敏感性高。其方法包括EPOS法（enhancedpolymerone-stepstaining）、EnVision法（又稱為ELPS法enhancelabelledpolymersystem）、UIP法、PowerVision法。5/8/202441免疫組化技術課件EnVision法是通過葡聚糖將酶與二抗結(jié)合，形成酶-多聚化合物（葡聚糖）-第二抗體巨大復合物。每個復合物中含有約70個分子的HRP和10個分子的第二抗體。因復合物的HRP絕對數(shù)是遠高于其他復合物，故具有高度的放大效果。流程為抗原+第一抗體+第二抗體（標記有葡聚糖合酶）→通過底物顯色。5/8/202442免疫組化技術課件EnVision法步驟石蠟切片至水，PBS洗酶消化或熱處理，作抗原修復3%H2O2甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10-20minPBS洗5min×3次滴加一抗37℃60min或4℃過夜PBS洗5min×3次滴加EnVision復合物30min(濕盒內(nèi)室溫或37℃)PBS洗5min×3次DAB顯色水洗復染，常規(guī)封片5/8/202443免疫組化技術課件免疫組化結(jié)果的判斷免疫組化的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。

5/8/202444免疫組化技術課件陽性反應的染色特征陽性反應染色分布有四種類型：細胞間質(zhì)、胞漿、細胞核、細胞膜表面。

陽性細胞分布呈灶性和彌漫性。由于細胞內(nèi)含抗原量不同，所以染色強度不一。如果細胞之間染色強度相同，常提示其反應為非特異性。陽性細胞染色定位于單個細胞，且與陰性細胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。切片邊緣、刀痕或皺褶區(qū)域，壞死或擠壓的細胞區(qū)，常表現(xiàn)為相同的陽性染色強度，不能用于判斷陽性。5/8/202445免疫組化技術課件5/8/202446免疫組化技術課件5/8/202447免疫組化技術課件5/8/202448免疫組化技術課件注意事項一、抗體的保存

濃縮抗體：有效期內(nèi)，只需放在4℃冰箱內(nèi)，保存時間可達1-3年。即用型抗體：理論上在4℃冰箱內(nèi)可保存半年左右。

PBS或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般只可放置1-2個月。5/8/202449免疫組化技術課件二、出現(xiàn)假陽性的原因

組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如刀痕裂縫邊緣的組織著色過深，不能作為判斷陽性的依據(jù)。出血和壞死：紅細胞的內(nèi)源性過氧化物酶，壞死細胞釋放的內(nèi)源性過氧化物酶均可出現(xiàn)假陽性反應?？贵w的交叉反應。5/8/202450免疫組化技術課件三、出現(xiàn)假陰性的原因

固定時間過長，浸蠟、烤片溫度過高，導致抗原丟失，無法補救。固定液不合適或濃度不對，導致固定不佳。最好使用10%中性福爾馬林?？贵w濃度過低。孵育時間太短，或孵育溫度太低。緩沖液pH值不正確。5/8/202451免疫組化技術課件四、必須嚴格設置陽性對照和陰性對照。五、DAB有致癌性，用后不應隨處倒棄。5/8/202452免疫組化技術課件免疫組織化學技術操作過程中的注意事項：新購置的抗體需做預實驗，一是摸索一抗的最低工作濃度，如廠家提供的說明書上建議工作濃度為1：100，應設1：50，1：100，1：200進行預實驗，二是觀察一下該抗體的質(zhì)量，是否有陽性表達，有些抗體在制作、運輸、放置等過程中會使抗體效價減低或失活。免疫組織化學操作以手工為主，由于試劑（如緩沖液、顯色液、封閉液等）時間、溫度的不同會出現(xiàn)不同的結(jié)果（常見的為陽性強度、背景及襯染的深度）影響結(jié)果的分析。因此，每批實驗標本應一次性操作完畢，否則會失去每組（實驗組別）之間的可比性。從滴加一抗以后每個步驟切片均不能干涸，否則會出現(xiàn)假陽性或整張切片均呈陽性色。有些抗體，修復抗原時間不宜過度，否則會出現(xiàn)假陽性，如存在胞漿內(nèi)的抗原在核內(nèi)出現(xiàn)陽性表達，或定位于核內(nèi)的蛋白會出現(xiàn)胞漿陽性，這種現(xiàn)象原因很多，抗體不純也可能是一種原因，但也有一些可能目前還沒有發(fā)現(xiàn)的原因。每次實驗需設陽性對照和陰性對照，陽性對照是將明確含有所測抗原的切