芽孢桿菌用于防治大口黑鱸嗜水氣單胞菌病的測試

大口黑鱸（Micropterussalmoides），又稱加州鱸，是我國重要的淡水經(jīng)濟魚類。在養(yǎng)殖過程中，嗜水氣單胞菌常誘發(fā)大口黑鱸出現(xiàn)“腸道感染、出血、潰爛”等癥狀，嚴重時還會導(dǎo)致大口黑鱸出現(xiàn)大規(guī)模的死亡，帶來巨大的經(jīng)濟損失。通常人們會使用抗生素對細菌病進行治療。但是長期使用也促使了耐藥菌出現(xiàn)，導(dǎo)致菌群平衡失調(diào)等。益生菌在近幾年逐漸走入大眾視野。目前可以將益生菌大致分為四類，分別是乳桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌、鏈球菌等。其中的芽孢桿菌是一類可以產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性菌，能夠耐酸堿、高溫等惡劣條件，具備明顯的生存優(yōu)勢，芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢可以在胃內(nèi)酸性條件下存活，從而經(jīng)過胃到達于小腸，在其中發(fā)揮益生作用，可以有效應(yīng)對病害的發(fā)生，因此被認為是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的潛在益生菌。本測試從大口黑鱸腸道中選擇芽孢桿菌作為拮抗嗜水氣單胞菌的益生菌，這是區(qū)別于傳統(tǒng)藥物使用的一種防治方法，具備新穎的應(yīng)用研究視角。一

測試方法本次實驗所需的大口黑鱸樣品從廣州市番禺區(qū)某養(yǎng)殖場采集，魚體規(guī)格100~200g；指示菌種：嗜水氣單胞菌，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院提供。首先選取10組患病塘，采集健康及患病的大口黑鱸各5組，每組采集6尾大口黑鱸，共采集60份樣本；然后取出腸道，無菌條件下置于冰盒保存。最后將部分樣品混合。委托廣東美格基因科技有限公司對樣品進行高通量測序。分析比較健康與發(fā)病的樣本腸道菌群差異，發(fā)現(xiàn)益生菌。二

測試結(jié)果健康組與患病組的大口黑鱸的腸道內(nèi)容物中的細菌種類存在差異，其中芽孢桿菌的差異最為顯著，在健康魚腸道內(nèi)容物中芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）豐度較高。1.細菌分離及鑒定結(jié)果經(jīng)劃線純化，共分離出6株潛在的芽孢桿菌，均為革蘭氏陽性菌，呈桿狀，長短不一。2.貝萊斯芽孢桿菌抑菌結(jié)果在大口黑鱸腸道內(nèi)分離出的6種芽孢桿菌中（如圖1），4種對嗜水氣單胞菌的生長無明顯抑制作用，1種有抑制作用但效果不明顯，1種貝萊斯芽孢桿菌的抑菌效果最為顯著。圖16株芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌的抑菌結(jié)果3.攻毒實驗結(jié)果連續(xù)21d對大口黑鱸進行飼喂實驗，記錄每日大口黑鱸的存活情況，繪制Kaplan-Meier生存曲線，如圖2所示。圖2大口黑鱸Kaplan-Meier生存曲線（CK組：不攻毒，投喂普通飼料；A組：攻毒，投喂拌有貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液的飼料；B組：攻毒，投喂普通飼料。）其中對照組（CK組）的大口黑鱸無死亡情況；對實驗組（A組）的大口黑鱸投喂普通飼料并浸泡攻毒，累計死亡率為82.5%；對實驗組（B組）的大口黑鱸投喂拌有貝萊斯芽孢桿菌菌液的飼料并浸泡攻毒，累計死亡率為62.5%，同A組的死亡率相比下降了20.0%；貝萊斯芽孢桿菌對大口黑鱸的保護率為24.2%。由此得出，在人工感染的過程中，將貝萊斯芽孢桿菌拌料投喂大口黑鱸可以延緩大口黑鱸的死亡，并降低大口黑鱸的死亡率。三

討論與分析1.益生菌的選擇芽孢桿菌能夠通過形成芽孢應(yīng)對惡劣環(huán)境，在水產(chǎn)動物腸道內(nèi)存在時間較長，相較于其他益生菌能夠更大限度的發(fā)揮益生作用，符合篩選要求。結(jié)合實驗的實際情況及高通量測序結(jié)果，最終確定將芽孢桿菌作為分離對象。此外，從腸道中分離芽孢桿菌優(yōu)于從外部水體環(huán)境直接篩選。目前使用的芽孢桿菌是經(jīng)外源添加而非魚體本身具有的，其能否穩(wěn)定存在于腸道發(fā)揮作用以及安全性尚不清楚。從腸道中分離出的芽孢桿菌，側(cè)面反映出了該種芽孢桿菌能夠在腸道中存在，并在自然情況下不會對大口黑鱸造成損害。2.高通量測序分析對健康組和患病組大口黑鱸腸道細菌展開差異性和菌群組成的分析。發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌存在于健康組大口黑鱸的腸道中，并且芽孢桿菌的相對豐度在健康組和患病組中存在明顯差異，健康大口黑鱸的腸道中存在更多數(shù)量的芽孢桿菌。由此可以推斷芽孢桿菌有可能是大口黑鱸的腸道益生菌，在延緩大口黑鱸發(fā)病中發(fā)揮作用。3.攻毒試驗評估為更好模擬養(yǎng)殖過程，本動物實驗采用的浸泡攻毒是慢性攻毒，同注射攻毒相比，試驗周期較長，前期的致死效果不明顯。但浸泡攻毒9d后出現(xiàn)效果，初期大口黑鱸開始死亡，中期連續(xù)多日死亡量陡增，后期趨于平穩(wěn)，該現(xiàn)象與養(yǎng)殖過程中疫病爆發(fā)過程類似。在注射后的1d，A、B兩組均有大口黑鱸死亡。但死亡個體為群體中較小者，可能是魚體自身免疫力較低，未對菌液浸泡的環(huán)境適應(yīng)。對于整個實驗過程和結(jié)果而言，未產(chǎn)生明顯不良影響。本次體外攻毒實驗通過模擬養(yǎng)殖環(huán)境，再次驗證了貝萊斯芽孢桿菌的益生效果，但仍存在一些不足之處：如僅通過死亡率判斷貝萊斯芽孢桿菌所發(fā)揮作用，并未對大口黑鱸腸道微生物的數(shù)量及組成進行再次統(tǒng)計和分析判斷。四

結(jié)果與實際意義本研究借助高通量測序分析不同健康狀況的大口黑鱸腸道微生物差異。先從患病塘口的健康大口黑鱸腸道內(nèi)篩選、分離出9株細菌；再經(jīng)菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色初步判定以及16SrRNA測序鑒定出6株芽孢桿菌，其中的YB-9為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis），對嗜水氣單胞菌的拮抗效果最為明顯。發(fā)酵培養(yǎng)后用菌液拌料連續(xù)10d飼喂大口黑鱸，發(fā)現(xiàn)該菌不會對大口黑鱸的健康造成不良影響；最后進行攻毒實驗，實驗結(jié)果對生產(chǎn)指導(dǎo)意義：一是將貝萊斯芽孢桿菌添加于飼料飼喂大口黑鱸有一定的保護效果，保護率可達24.2%。二是養(yǎng)殖實際過程中應(yīng)注意要預(yù)先拌料投喂，建立起腸道益生菌的保護屏障，實現(xiàn)病害防控。因在實驗過程中筆者發(fā)現(xiàn)浸泡感染嗜水氣單胞菌后的6-7d，實驗組的大口黑鱸開始出現(xiàn)“吃料慢