諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案

2015年版諾如病毒

標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

技術(shù)方案5/9/20241諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案目錄

前言0

標(biāo)本前處理1

核酸提取2

諾如病毒核酸檢測(cè)方法3

諾如病毒ELISA檢測(cè)方法（糞便、嘔吐物）45/9/20242諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案前言

諾如病毒完整的檢測(cè)及分型流程包括標(biāo)本前處理、RNA提取、Real-timeRT-PCR檢測(cè)、傳統(tǒng)RT-PCR檢測(cè)、測(cè)序和基因分型6個(gè)步驟。Real-timeRT-PCR方法靈敏度和準(zhǔn)確度高，是檢測(cè)諾如病毒的金標(biāo)準(zhǔn)。用傳統(tǒng)RT-PCR可對(duì)Real-timeRT-PCR陽性標(biāo)本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過序列分析確定諾如病毒的基因群和基因型。在發(fā)生聚集或暴發(fā)時(shí)，ELISA方法可作為輔助的手段快速檢測(cè)諾如病毒抗原。食品、水、環(huán)境涂抹樣檢測(cè)方法的靈敏度不穩(wěn)定，僅作為參考方法。5/9/20243諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.1糞便、嘔吐物1.3環(huán)境涂抹樣1.2水1.4.1貝類1.4.2三文魚1.4.3草莓、藍(lán)莓1.4.4生菜和苗芽菜1.4食品5/9/20244諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.1糞便、嘔吐物1.1.1設(shè)備和材料

微量移液器、無菌過濾器、漩渦振蕩器、微量離心機(jī)、1.5ml無菌離心管、磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）10mMpH7.0-7.4。1.1.2操作方法（1）離心管每管分裝0.5mlPBS。用一次性移液管（或無菌棒）添加豌豆大小的糞便（約0.1克），稀釋成約10％至20％（重量/體積）的糞便懸浮液。當(dāng)糞便樣品是液態(tài)時(shí)，不必在PBS中稀釋，直接使用500ul的樣品。（2）漩渦振蕩每個(gè)樣品1分鐘。在5000rpm下5/9/20245諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理

離心5分鐘，使得固體沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或貯存于-70℃。（3）取澄清的上清液200ul進(jìn)行RNA提取。5/9/20246諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.2水通過陰離子濾膜過濾水樣品。用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05M甘氨酸（pH9.0）緩沖液洗脫附在膜上的病毒。使用Microsep100TM或CentriconTMcolumns離心管進(jìn)一步濃縮洗脫液。1.2.1設(shè)備和材料DEPC水、新配制次氯酸鹽（至少1%）或等效消毒劑、MilliporeHAfilter（孔徑0.45um、）、換膜過濾器、真空泵、計(jì)時(shí)器、PH值酸度計(jì)、磁力攪拌器及轉(zhuǎn)子、低溫冰箱（-20℃、-70℃）、Microsep100Kcolumns（PALL公司）、CentriprepYM-50（Millipore公司）、洗脫液（BE-0.05GlypH7.0）、PBS(pH7.2)、離心機(jī)、DEPC水是用DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水，無色液體。經(jīng)檢測(cè)不含雜質(zhì)RNA、DNA和蛋白質(zhì)。5/9/20247諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理

氯仿、丁醇。1.2.2操作方法1.2.2.1過濾裝置準(zhǔn)備（1）使用無菌的鑷子將濾膜放在濾器架上，濾膜有三層，型號(hào)分別為MilliporeHAfilter、AP15和AP20，放置順序?yàn)镸illiporeHAfilter→AP15→AP20。注意：暴露出濾膜表面使其能與水樣接觸，請(qǐng)將濾膜光滑表面的那邊向下。所有的玻璃器皿應(yīng)干凈無菌。每批水樣使用不同的漏斗。5/9/20248諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理（2）將濾膜置中，將有刻度的漏斗放在濾器的上邊。（3）使用不銹鋼濾器夾進(jìn)行水的密封。（4）真空泵連接1000ml的錐形瓶。注意：為防止氣溶膠的污染，應(yīng)在無菌的環(huán)境中過濾，在生物安全柜進(jìn)行操作。（5）向?yàn)V器中倒入20ml無菌水（DEPC水）檢查濾膜的密封情況。（6）打開泵，調(diào)整水的流速至形成緩慢的細(xì)流。5/9/20249諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.2.2.2水樣品的過濾（1）向玻璃漏斗里倒水樣，當(dāng)水樣完全濾過立刻關(guān)閉真空泵。（2）用不銹鋼的濾器夾，小心移開濾膜上的刻度漏斗。1.2.2.3用酸漂洗濾膜將膜用無菌的鑷子夾放在有200ml0.05mMH2SO4（pH3.0）的無菌500ml燒杯中進(jìn)行漂洗濾膜去除Mg2+。1.2.2.4洗脫（1）將膜夾出放在無菌的60mm培養(yǎng)皿中，加

5ml洗脫液。蓋上鋁箔。5/9/202410諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理

注意：要將濾膜的上邊向下（倒置）放在錐形瓶里。（2）將錐形瓶放在恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速45rpm，室溫（23℃±3℃），15min。（3）關(guān)閉搖床，將洗脫液（大約5ml）轉(zhuǎn)移到管子里。1.2.2.5中和洗脫液用1NHCl或1NNaOH調(diào)整洗脫液的pH到7.0-7.4。檢測(cè)前，洗脫液在-70℃儲(chǔ)藏。1.2.2.6二次濃縮5/9/202411諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理方法一：用Microsep100Kcolumns

或CentriprepYM-50

濃縮病毒（1）為防止病毒的附著，先用無病毒粒子的洗脫液浸濕過濾器。（2）將水標(biāo)本濾膜洗脫液（大約5ml）加入到濃縮柱中，5000rpm離心5min。（3）吸取濃縮液（約150μl），轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。5/9/202412諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理方法二：PEG沉淀（1）向標(biāo)本洗脫液中加入NaCl終濃度是0.3mol/L（若洗脫液為5ml加0.08775g的NaCl）,有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000終濃度為12.5％（w/v）（若洗脫液為5ml，加0.0625g的PEG-6000。4℃過夜。（2）4℃，10000rpm離心30分鐘，收集沉淀。（3）MilliporeHAfilter，傾倒并棄掉上清液。每個(gè)離心管添加150-500μlpH7.2（±0.2）PBS重懸沉淀物。將離心管放置在離心管架上，為更好的讓緩沖液與沉淀物接觸，將離心管架成一定角度放置。室溫放置30min。5/9/202413諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理

注意：如果沉淀物沒有溶解，可用緩沖液反復(fù)的輕輕吹打沉淀物。吹打過力會(huì)產(chǎn)生氣泡。（4）向懸液中加入等體積的氯仿/丁醇（1:1vol/vol）混合。去除病毒懸液中的抑制劑。（5）4℃，10000rpm，離心20分鐘。（6）分離出水相（上清液），-80℃儲(chǔ)藏。（7）取200μl上清液進(jìn)行核酸提取。5/9/202414諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.3環(huán)境涂抹樣

將棉簽在PBS里蘸濕，用力涂抹待測(cè)表面（最大面積100cm2）后，立即浸入核酸提取試劑盒裂解緩沖液中（QIAamp試劑盒560μl，Genaid試劑盒400μl），將棉簽用力壓EP管的側(cè)壁，釋放棉簽中的液體。重復(fù)浸入和壓側(cè)壁的步驟3-4次，確保病毒最大釋放量，直接進(jìn)入核酸提取步驟。5/9/202415諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.4.3草莓、藍(lán)莓1.4.2三文魚1.4.1貝類1.4食品1.4.4生菜和苗芽菜5/9/202416諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.4食品1.4.1貝類1.4.1.1設(shè)備和材料

諾如病毒質(zhì)控樣（中國食品藥品檢定研究院）、高速離心機(jī)（可離心15mL~50mL體積）、臺(tái)式離心機(jī)、碎花制冰機(jī)、生物安全柜、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)、眼科剪、眼科鑷、一次性無菌培養(yǎng)皿、恒溫?fù)u床、高壓滅菌器、電磨均質(zhì)器（LX134MO）、一次性研磨杵（上海生工）、15mL去RNAase離心管、1.5mL去RNAaseEppendorf管、20μL、200μL、1000μL微量移液器、PBS溶液pH7.2（Gebico）、蛋白酶K（PCR級(jí)Roche）。5/9/202417諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.4.1.2貝類樣品處理程序樣品采集貝類的解剖及消化腺腸道的剪取消化腺和腸道組織的均質(zhì)RNA提取5/9/202418諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.4.1.3解剖方法

5個(gè)貝類個(gè)體作為一件樣品，分別解剖，取其消化腺和腸道，用于檢測(cè)。如果一件樣品的消化腺和腸道的總質(zhì)量不夠2.0g，應(yīng)適當(dāng)增加取樣量，使得每件樣品檢驗(yàn)的總質(zhì)量達(dá)到2.0g。（1）牡蠣的解剖方法

使用滅菌的刀具將牡蠣殼撬開，使用滅菌的眼科剪和眼科鑷，先將牡蠣的內(nèi)臟部分剪取下來放到一個(gè)滅菌的平皿里，沿腸道將牡蠣軟體部分剪開，暴露出腸道和消化腺，將多余的組織去掉，取其消化腺和腸道用于檢測(cè)。牡蠣的解刨過程及解剖結(jié)構(gòu)見下圖。5/9/202419諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理5/9/202420諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理（2）海虹

用滅菌刀具將雙殼撬開，將消化腺用鑷子直接夾下，同時(shí)盡量將腸道取下。由于海虹的消化腺相對(duì)牡蠣較小，所以需要增加取樣的海虹個(gè)體數(shù)，以使得總質(zhì)量達(dá)到2.0g，用于后續(xù)的檢測(cè)。海虹的解剖結(jié)構(gòu)見下圖，圖中鑷子所指的位置為海虹的消化腺。5/9/202421諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理（3）扇貝、毛蚶與文蛤

扇貝與毛蚶的解剖結(jié)構(gòu)與海虹相似，參照海虹的方法將殼打開后，直接判斷消化腺所處的位置，用眼科鑷和眼科剪，將其消化腺和腸道取下用于諾如病毒的檢測(cè)。文蛤的消化腺包在內(nèi)臟團(tuán)里，在解剖時(shí)可以直接用鑷子在內(nèi)臟團(tuán)消化腺位置撕開，將消化腺取下，同時(shí)將腸道取出，用于檢測(cè)，文蛤的消化腺體積較小，需要適當(dāng)增加取樣量以滿足檢驗(yàn)的要求。1.4.1.4均質(zhì)

將上述解剖下的消化腺和腸道放到50mL滅菌的小燒杯內(nèi)，用電磨均質(zhì)器（LX134MO）將消化腺仔細(xì)打碎，成糊狀。5/9/202422諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.4.1.5蛋白酶K消化

將上述均質(zhì)的消化腺，分別稱取2.0±0.1g，加入15mL的離心管，然后每管加入2mL的PBS溶液，加入20mg/mL蛋白酶K（Roche）溶液10μL進(jìn)行消化，另外取1件樣品加入諾如病毒的陽性質(zhì)控球，作為外部質(zhì)控陽性對(duì)照。1.4.1.6將上述樣品于搖床37℃，320rpm振蕩1h。恒溫水浴60℃，保持15min；將15mL離心管，3000g離心5min，取200μL用于RNA的提取，剩余部分冷凍保存，用于復(fù)檢。5/9/202423諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.4.2三文魚1.4.2.1設(shè)備和材料

諾如病毒質(zhì)控樣（中國食品藥品檢定研究院）、恒溫振蕩器、食品均值器、天平：感量0.1g、高速低溫離心機(jī)（4℃，10000g）、5×PEG8000/NaCl溶液（PEG8000500±2g，NaCl87±1g,先用450mL蒸餾水溶解，稍微加熱，待溶解后定容至1000mL，121℃，15min滅菌）、磷酸鹽緩沖液（PBSpH7.2）、Tris/甘氨酸/牛肉膏緩沖液（TGBE）(Trisbase12.1±0.2g,甘氨酸3.8±0.1g，牛肉膏10±1.0g，蒸餾水1000±1mL，121℃，15min滅菌)、氯仿/正丁醇（1:1體積比）溶液。5/9/202424諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.4.2.2樣品處理程序及方法5/9/202425諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理（1）取三文魚樣品25g，剪碎后置于帶濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中，加人TGBE緩沖液40mL，均質(zhì)均勻，于室溫60r/min震蕩20min。（2）取濾液至50mL新的離心管中，4℃，10000g離心30min。（3）取上清液（小心避開液體表面的油脂層），加入上清液1/4體積的5×PEG/NaCl溶液，顛倒60s，4℃，60r/min震蕩60min。（4）將上述溶液于4℃，10000g離心30min，棄去上清液。向沉淀物中加入PBS溶液700μL，震蕩重懸。5/9/202426諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理（5）加入與上述重懸液等體積的氯仿/正丁醇（1:1）溶液，充分振蕩，室溫孵育5min。于4℃，10000g離心15min。（6）取上層水相液體200μL用于提取病毒RNA。5/9/202427諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.4.3草莓、藍(lán)莓1.4.3.1設(shè)備和材料

諾如病毒質(zhì)控樣（中國食品藥品檢定研究院）、PEG8000（Polyethyleneglycol）、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO3）、磷酸氫二鈉（Na2HPO3）、NaOH溶液（5M）、HCl溶液（1M）、純水（MilliQ系統(tǒng)凈化）、氯仿（Methenyltrichoride）、丁醇（1-Butanol）、牛肉膏（BeefExtract）、甘氨酸（Glycine）、蛋白酶K（ProteinaseK）、果膠酶（Pectinasefrom

Aspergilusniger，Sigma）、5×PEG/NaCl緩沖液（PEG8000500±2g，NaCl87±1g,5/9/202428諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理

先用450mL蒸餾水溶解，稍微加熱，待溶解后定容至1000mL，121℃，15min滅菌）、TGBE緩沖液(Trisbase12.1±0.2g,甘氨酸3.8±0.1g，牛肉膏10±1.0g，蒸餾水1000±1mL，121℃，15min滅菌)、DHZ-D型冷凍恒溫振蕩器、FE20K型酸度計(jì)、小型高速離心機(jī)、CR22E型高速冷凍離心機(jī)。1.4.3.2樣品處理程序及方法（1）取樣稱取25g草莓（藍(lán)莓）樣本放入濾膜均質(zhì)袋中，加入40mlTGBE緩沖液，（取一份樣本5/9/202429諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理

作為陽性對(duì)照，可在這步加入諾如病毒的陽性質(zhì)控球），以及30單位果膠酶（PectinasefromAspergilus

niger,Sigma）。（2）樣品提取室溫振蕩孵育10min，測(cè)量pH值。若pH<9.0，用NaOH(5M)溶液小心調(diào)節(jié)至9.5，再振蕩孵育10min。每調(diào)節(jié)一次pH值后，孵育10min，直至pH>9.0；將流出液倒至離心管中（必要情況下使用2個(gè)離心管），4℃，10000g離心30min；上清移至一新管或瓶，用HCl(1M)調(diào)節(jié)pH至7.0±0.5。5/9/202430諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理（3）樣品富集濃縮加入1/4體積的5×PEG/NaCl緩沖液，在4℃條件下，于振蕩孵育器孵育60min；4℃，10000g離心30min（必要情況下將液體分裝于2只離心管）。

棄去上層溶液，4℃，再次10000g離心5min以使顆粒緊湊。

棄去上層溶液，用500μlPBS重懸沉淀。如果一個(gè)樣品分兩管離心，則用同樣體積PBS依次重懸。

將重懸液移至新的EP管中，加入等體積的氯仿/丁醇溶液，渦旋混勻，室溫孵育5min。4℃，10000g離心15min，小心將水相轉(zhuǎn)移至新管待提取RNA。5/9/202431諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理1.4.4生菜和苗芽菜1.4.4.1設(shè)備和材料

食品均質(zhì)器（可拆卸、可清洗、可高壓滅菌）、電子天平（感量0.01g）、臺(tái)式離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速15000g）、微型離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋（0-100℃）、渦旋振蕩器、實(shí)時(shí)熒光PCR儀、Roche，LightCycler480。1.4.4.2樣品處理程序及方法（1）同一批次的生菜或苗芽菜樣品，隨機(jī)抽取樣品數(shù)不少于5件，并用滅菌處理的剪刀剪碎至5/9/202432諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理

2.5cm×2.5cm×2.5cm大小的形狀，稱量25g放入帶有濾膜均質(zhì)袋一側(cè)中，作為待試樣品。另稱取200g樣品放入50mL離心管中，-80℃保存，留作備樣，并做好標(biāo)記。（2）向上述均質(zhì)袋中加入40mLTGBEbuffer，均質(zhì)器拍打混勻，尼龍?jiān)鷰Х饪诤?，室溫振蕩約20min。（3）將均質(zhì)袋濾膜一側(cè)液體傾入50mL離心管，4℃條件下10000×g離心30min。（4）離心結(jié)束后，將上清轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管，加入1/4倍體積的5×PEG/NaCl溶液，室溫條件振蕩60min。5/9/202433諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案1標(biāo)本前處理（5）振蕩完畢，4℃條件下10000×g離心30min。（6）離心結(jié)束，棄上清，繼續(xù)4℃條件下10000×g離心5min壓實(shí)沉淀。（7）向沉淀加入500μLPBS溶液以溶解沉淀。吸取溶解沉淀后的PBS溶液200μL轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，作為試樣。剩余的溶液分裝到離心管中標(biāo)記作為備樣，-80℃凍存。5/9/202434諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案2核酸提取

各類樣品經(jīng)前處理后，每個(gè)樣品分別取200ul，下面表格中提供的RNA提取試劑盒供參考，按試劑盒說明書操作提取RNA。5/9/202435諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.1糞便、嘔吐物、肛拭子、水、環(huán)境涂抹樣3.1.1諾如病毒雙重Real-timeRT-PCR分析3.1.2諾如病毒傳統(tǒng)RT-PCR分析3.2.1反應(yīng)體系及儀器設(shè)置3.2食品諾如病毒熒光定量PCR3.2.2諾如病毒熒光定量PCR結(jié)果判讀5/9/202436諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.1糞便、嘔吐物、肛拭子、水、環(huán)境涂抹樣3.1.1

諾如病毒雙重Real-time（TaqMan?）RT-PCR分析3.1.1.1使用范圍：ABI7500realtimePCR、Smartcycler(Cepheid),Mx3005P,Mx3000P(Stratagene)和ICycleriQTMReal-TimePCR檢測(cè)系統(tǒng)(BioRad)等。本設(shè)計(jì)應(yīng)用QuantiTectMultiplexRT-PCRKits(Qiagen)，引物和探針濃度分別被優(yōu)化為終濃度400nM和200nM。每個(gè)試劑盒特異的RT最適環(huán)境和活化步驟，需要遵循制造說明書使用。5/9/202437諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法

該試驗(yàn)方法來自美國CDC諾如病毒暴發(fā)網(wǎng)絡(luò)（CaliciNetUSA）雙重Real-timeRT-PCR操作標(biāo)準(zhǔn)，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)。3.1.1.2設(shè)備和材料

渦流混合器、微量離心機(jī)、移液器（量程為P20、P200和P1000）、Real-timePCR儀可以是ABI7500(ABI)、Smartcycler(Cepheid)、Mx3005PorMx3000P(Strategene)或BioRadiCycleriQTMReal-Time

PCR檢測(cè)系統(tǒng)(BioRad)。一次性手套、帶濾芯槍頭、無菌1.5ml微量離心管、RNA酶去除劑、96-孔反應(yīng)板、蓋子或薄膜。5/9/202438諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.1.1.3諾如病毒寡核苷酸引物/探針*GITaqMan?探針：5’端用FAM熒光素標(biāo)記，3’端用BHQ淬滅基團(tuán)標(biāo)記;BHQ淬滅基團(tuán)1更好。**GIITaqMan?探針：5’端用JOE（HEX或VIC等）熒光素標(biāo)記，3’端用BHQ淬滅基團(tuán)標(biāo)記。5/9/202439諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.1.1.4操作方法（1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備用RNA酶去除劑擦拭工作臺(tái)表面、移液器和離心機(jī)除去潛在的RNA酶污染。RealtimePCR儀開機(jī)預(yù)熱15分鐘。（2）試劑準(zhǔn)備①所有試劑冰浴。②輕彈管壁混合2×QuantiTectMultiplexRT-PCRMasterMix反應(yīng)液。③渦旋所有引物和探針5秒鐘。④QuantiTectMultiplexRTMix、引物、探針置于冰上。5/9/202440諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法（3）對(duì)照設(shè)立

每一次實(shí)驗(yàn)都要包括無模板對(duì)照(NC)（第一個(gè)和最后一個(gè)孔各設(shè)一個(gè)）和陽性對(duì)照(PC)

（GI和GII諾如病毒核酸或標(biāo)準(zhǔn)品）。（4）檢測(cè)

注意：請(qǐng)?jiān)赑CR清潔區(qū)準(zhǔn)備、配制反應(yīng)體系（mastermix）。①在1.5ml離心管中準(zhǔn)備mastermix。②確定每次分析的反應(yīng)數(shù)(N)，需要多配反應(yīng)數(shù)來彌補(bǔ)重復(fù)移液中的小量丟失：如果樣本數(shù)(n)（包括NC和VC對(duì)照）=1-14,做n+1個(gè)反應(yīng)的mix。5/9/202441諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法如果樣本數(shù)(n)（包括NC和VC對(duì)照）>15,做n+2個(gè)反應(yīng)的mix。③配制Real-timeRT-PCR反應(yīng)混合液22.5μl（表2）5/9/202442諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法④吸打混勻MasterMix。⑤按如下方式排列陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和樣品，在每孔中加入22.5μlMasterMix。*陰性模板對(duì)照(NC)加入第一列，樣本加入后面的11列，檢查加入樣本時(shí)可能的交叉污染。病毒模板對(duì)照(PC在所有樣本和NC密封后加入到最后。5/9/202443諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法⑥加入2.5μlDEPC水到第一個(gè)NC孔，蓋好。⑦將反應(yīng)平板轉(zhuǎn)移到核酸處理區(qū)域或清潔區(qū)外面。⑧將RNA樣本從-70°C冰箱轉(zhuǎn)移在冰上融化;漩渦振蕩5秒鐘之后快速離心5秒鐘，移液2.5μlRNA樣本到標(biāo)記好的孔。例如,加樣本1(S1)到平板位置A2和B2。如果樣本體積小于2.5μl,加DEPC水至反應(yīng)管使總反應(yīng)體積達(dá)到25μl。⑨加2.5μl水到最后的NC孔，蓋好。⑩最后,移液GI和GII諾如病毒陽性對(duì)照各2.5μl到適當(dāng)?shù)腜C孔，蓋好。?小心混合平板。?4℃離心平板500rpm1分鐘，以移除孔中可能存在的氣泡和液滴。5/9/202444諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法?

RT-PCR擴(kuò)增條件：按照ABI7500(orotherplatform)的說明書放置好平板。終反應(yīng)體積為25μl。根據(jù)QuantiTectMultiplexRT-PCRKits說明書，RT-PCR熱循環(huán)程序?yàn)椋?/9/202445諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.1.1.5

結(jié)果解釋（1）陰性對(duì)照（NC）

如果一個(gè)或更多NC反應(yīng)出現(xiàn)假陽性,則可能發(fā)生了污染。這種情況下,檢測(cè)無效，需重復(fù)檢測(cè)。（2）陽性對(duì)照（PC）

陽性對(duì)照產(chǎn)生超過閾值的熒光曲線或擴(kuò)增圖像。（3）檢測(cè)樣本

只有在所有質(zhì)量控制嚴(yán)格準(zhǔn)確時(shí)，如果曲線在Ct值為≤40，則認(rèn)為檢測(cè)樣本為陽性。5/9/202446諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.1.2諾如病毒傳統(tǒng)RT-PCR分析3.1.2.1原理

人諾如病毒分為5個(gè)基因組（Genogroup，G），其中GI、GII和GIV型可感染人。本方案利用衣殼蛋白的部分區(qū)域（regionC）來對(duì)諾如病毒進(jìn)行分型。本方案由四個(gè)引物組成，擴(kuò)增ORF2的5’末端，編碼主要外殼蛋白VP1。引物G1SKF和G1SKR用于GI的檢測(cè)，擴(kuò)增片段330bp。引物和CoG2F和G2SKR用于GII的監(jiān)測(cè)，擴(kuò)增片段387bp。5/9/202447諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.1.2.2設(shè)備與材料

渦流混合器、微量離心機(jī)、移液器、PCR儀、微波爐、電泳儀和制膠器。一次性手套、帶濾芯槍頭、無菌1.5-ml微量離心管、RNA酶去除劑、薄壁PCR管（Rnasefree，0.5ml）、LoadingBuffer、Qiangen

OneStepRT-PCRKit（貨號(hào)：210212）。3.1.2.3諾如病毒寡核苷酸引物/探針（見表3）5/9/202448諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法Y=CorT;H=A,C,orT;R=AorG;I=inosine;S=CorG;N=G,A,T,orC;W=AorT;K=GorT。5/9/202449諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.1.2.4操作方法（1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

用RNA酶去除劑擦拭工作臺(tái)表面、移液管和離心機(jī)以去掉潛在的RNA酶污染。（2）試劑準(zhǔn)備①所有試劑冰浴。②輕彈管壁混合5X緩沖液。③離心酶、RNA酶抑制劑和dNTPs后將其放在冰上備用。④渦旋所有引物5秒鐘，離心5秒鐘備用。5/9/202450諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法（3）對(duì)照設(shè)立

每次PCR實(shí)驗(yàn)都應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，包括諾如病毒GI和GII，陽性對(duì)照為陽性糞便樣品。（4）檢測(cè)

注意：在PCR清潔區(qū)配置反應(yīng)體系。

①用1.5ml離心管準(zhǔn)備反應(yīng)體系。

②確定每次分析的反應(yīng)數(shù)(N)，在操作需配置過量的反應(yīng)體系來校正重復(fù)移液中的小量丟失；見下面的樣本:

5/9/202451諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法

如果樣本數(shù)(n)（包括NC和VC對(duì)照）=1-14,做n+1個(gè)反應(yīng)的mix。如果樣本數(shù)(n)（包括NC和VC對(duì)照）>15,做n+2個(gè)反應(yīng)的mix。③將每個(gè)引物對(duì)按以下計(jì)算量添加到反應(yīng)混合液中（表4和5）。5/9/202452諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法表4諾如病毒RegionC反應(yīng)體系-GenogroupI成分體積/反應(yīng)（μl）最終濃度5XRT-PCRBuffer51xdNTPmix1Enzymemix1GISKF(50μM)0.25500nMGISKR（50μM)0.25500nMRnaseInhibitor(30-40U/μl)0.50Rnase-freewater12反應(yīng)體系總體積205/9/202453諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法表5諾如病毒RegionC反應(yīng)體系-GenogroupII成分體積/反應(yīng)（μl）最終濃度5XRT-PCRBuffer51xdNTPmix1Enzymemix1COG2F(50μM)0.25500nMGIGIISKR（50μM)0.25500nMRnaseInhibitor(30-40U/μl)0.50Rnase-freewater12反應(yīng)體系總體積205/9/202454諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法④用移液管上下吹打混合液。⑤向每個(gè)反應(yīng)管中分裝20ul混合液。⑥設(shè)立陰性對(duì)照，加5ulDEPC水。⑦將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到核酸處理區(qū)。⑧將病毒核酸在冰上融化，漩渦振蕩5秒鐘之后快速離心5秒鐘。⑨移取5ul的RNA模板到每一個(gè)相應(yīng)的反應(yīng)管中。⑩最后加5μ陽性對(duì)照。?將所有的反應(yīng)管放置在PCR儀上，按照下面的條件設(shè)置：5/9/202455諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法

?準(zhǔn)備2%的瓊脂糖凝膠，進(jìn)行核酸電泳。（5）解釋

如果陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶，說明可能出現(xiàn)污染，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。陽性對(duì)照在正確位置出現(xiàn)條帶，則判定反應(yīng)體系工作正常。5/9/202456諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.2食品諾如病毒熒光定量PCR（RocheLightMix?KitNorovirusGGⅠ,GGⅡ,MS2

或等效的諾如病毒檢測(cè)試劑盒）3.2.1反應(yīng)體系及儀器設(shè)置反應(yīng)體系的添加按下表：5/9/202457諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法

具體的儀器設(shè)置為檢測(cè)信號(hào)通道FAM通道465nm-510nm，內(nèi)參信號(hào)ROX通道533nm-610nm，做分型的LC670通道498nm-660nm，反應(yīng)具體參數(shù)設(shè)置如下：（1）逆轉(zhuǎn)錄61℃，3min。（2）預(yù)變性95℃，30s。（3）PCR循環(huán)，95℃10s，56℃10s收集信號(hào)，72℃5s，45個(gè)循環(huán)。（4）溶解曲線，95℃30s，40℃2min，85℃1s收集信號(hào)。5/9/202458諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法3.2.2諾如病毒熒光定量PCR結(jié)果判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分析結(jié)果，具體分析標(biāo)準(zhǔn)按下表進(jìn)行。5/9/202459諾如病毒標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案3諾如病毒核酸檢測(cè)方法

在食品類的諾如病毒檢測(cè)方法中，通過諾如病毒質(zhì)控樣的加入作為外部質(zhì)控以判斷RNA的提取過程是否正常；同時(shí)在RT-PCR過程中還含有ROX熒光通道檢測(cè)內(nèi)部質(zhì)控噬菌體pMS2，用以判斷在