第二章 DNA重組克隆的單元操作課件

第二章

DNA重組克隆的單元操作2014年2月第二章-DNA重組克隆的單元操作本章節(jié)內(nèi)容DNA重組的載體(裝載DNA的工具）DNA的體外重組（切、連）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定（檢測(cè)）目的基因的克?。üw中的目標(biāo)DNA的克?。┑诙?DNA重組克隆的單元操作第一節(jié)DNA重組的載體質(zhì)粒載體λ雙鏈?zhǔn)删wDNA載體M13單鏈?zhǔn)删wDNA載體噬菌體-質(zhì)粒雜合載體第二章-DNA重組克隆的單元操作載體的功能為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力為外源基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制、擴(kuò)增或整合能力（指DNA拷貝數(shù)的增加）（所有載體必須具備的能力）為外源基因提供在受體細(xì)胞中的表達(dá)能力（指基因的表達(dá)，使外源基因通過(guò)mRNA和蛋白質(zhì)在受體細(xì)胞中發(fā)揮功能，進(jìn)而可發(fā)現(xiàn)基因在生物體內(nèi)發(fā)揮的作用）。第二章-DNA重組克隆的單元操作載體必須具備的三個(gè)條件具有復(fù)制原點(diǎn)或整合位點(diǎn)，能使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。既有多種單一的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)，multi-clonesite,MCS)。具有合適的選擇性標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測(cè)。第二章-DNA重組克隆的單元操作一、質(zhì)粒載體（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)存在于細(xì)菌或真菌的細(xì)胞質(zhì)粒是染色體外穩(wěn)定遺傳的復(fù)制體，其特點(diǎn)共價(jià)、閉環(huán)，雙鏈DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。大多數(shù)質(zhì)粒具有復(fù)制原點(diǎn)，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制，不依賴寄主的細(xì)胞復(fù)制周期質(zhì)粒第二章-DNA重組克隆的單元操作（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)質(zhì)粒通常賦予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。選擇性標(biāo)記(selectablemarker):由于質(zhì)粒攜帶的基因，可供實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行選擇的一些標(biāo)記。如抗性，營(yíng)養(yǎng)元素的利用等。顯性質(zhì)粒與隱性質(zhì)粒.一、質(zhì)粒載體第二章-DNA重組克隆的單元操作（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)1、質(zhì)粒的自主復(fù)制性：含有Ori或replicon質(zhì)粒在特定的宿主細(xì)胞中維持恒定的拷貝數(shù)。A、反義RNA進(jìn)行調(diào)控的機(jī)制B、關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進(jìn)行調(diào)控的機(jī)理一、質(zhì)粒載體第二章-DNA重組克隆的單元操作A、反義RNA進(jìn)行調(diào)控的機(jī)制（plasmidColE1）RopdimerPRNAIIRNAIIa、在復(fù)制起點(diǎn)處，RNAII（長(zhǎng)555個(gè)堿基）與質(zhì)粒DNA形成RNA-DNA復(fù)合物，RNA酶H可降解RNAII，露出3’自由羥基，質(zhì)粒復(fù)制起始。在該區(qū)域還能反向轉(zhuǎn)錄形成RNAI，I和II為互補(bǔ)的RNA。第二章-DNA重組克隆的單元操作B、如果RNAI和RNAII形成雙鏈RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNAII，復(fù)制不能進(jìn)行。RopdimerPRNAIIRNAII第二章-DNA重組克隆的單元操作c、當(dāng)質(zhì)粒的濃度比較高的時(shí)，Rop蛋白促進(jìn)RNAI和RNAII形成雙鏈RNA螺旋，使質(zhì)粒的復(fù)制不能起始。d、當(dāng)質(zhì)粒的比較低時(shí)，RNAII與質(zhì)粒DNA形成RNA-DNA復(fù)合物，RNA酶H降解RNAII質(zhì)粒復(fù)制起始。e、突變RNAI或去除Rop基因?qū)е沦|(zhì)粒的拷貝數(shù)增加。第二章-DNA重組克隆的單元操作B、關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進(jìn)行調(diào)控的機(jī)理（pS101質(zhì)粒）a)復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域含有3～7拷貝的長(zhǎng)度為17～22bp的重復(fù)區(qū)域，R1、R2、R3等。第二章-DNA重組克隆的單元操作B、關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進(jìn)行調(diào)控的機(jī)理

b)復(fù)制原點(diǎn)附近有一個(gè)編碼基因repA,編碼RepA蛋白。RepA是雙功能的蛋白：與復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域的重復(fù)序列結(jié)合，起始DNA的合成；與自身基因的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制自身的轉(zhuǎn)錄。第二章-DNA重組克隆的單元操作質(zhì)?？截悢?shù)由RepA蛋白濃度和質(zhì)粒自身的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)。

如果質(zhì)?？截悢?shù)高，RepA蛋白與自身的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄，RepA蛋白合成受阻，DNA的復(fù)制受到抑制。RepA蛋白通過(guò)結(jié)合到兩個(gè)質(zhì)粒的重復(fù)序列把它們連接起來(lái)，避免復(fù)制起始。細(xì)胞分裂后，拷貝數(shù)和RepA蛋白的濃度降低，RepA蛋白自身合成增加，結(jié)合到重復(fù)區(qū)域起始DNA的合成。B、關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進(jìn)行調(diào)控的機(jī)理

第二章-DNA重組克隆的單元操作問(wèn)題：在寄主復(fù)制后，質(zhì)粒是如何分配到子細(xì)胞中？

Par原件會(huì)附著在細(xì)胞膜上，隨著細(xì)胞的分裂，質(zhì)粒正確分配到子細(xì)胞中，維持相對(duì)穩(wěn)定的質(zhì)?？截悢?shù)。第二章-DNA重組克隆的單元操作（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)2、質(zhì)粒的可擴(kuò)增性（質(zhì)粒的拷貝數(shù)）拷貝數(shù)：細(xì)胞中質(zhì)粒的數(shù)量（摩爾數(shù)）與染色體DNA數(shù)量之比

嚴(yán)謹(jǐn)型:少數(shù)拷貝存在于細(xì)胞中（1~幾個(gè)）

松弛型:多個(gè)拷貝存在于細(xì)胞中（≥10）嚴(yán)謹(jǐn)型與松弛型是相對(duì)的。第二章-DNA重組克隆的單元操作（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)3、不相容性在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象，稱為質(zhì)粒的不相容性，或稱為不親和性（Plasmidincom-patibility)。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒第二章-DNA重組克隆的單元操作（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)引起質(zhì)粒的不相容的機(jī)理A具有相同的復(fù)制調(diào)控機(jī)制B控制質(zhì)粒分配的par元件相同,也會(huì)引起質(zhì)粒的不相容不相容群：指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個(gè)群體，一般具有相同的復(fù)制子ColE1/pMB1第二章-DNA重組克隆的單元操作（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)4、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性（p13)第二章-DNA重組克隆的單元操作（二）、質(zhì)粒的改造和構(gòu)建天然的野生質(zhì)粒一般不能直接用作克隆載體，需要改造1、刪除不必要的DNA序列，縮小質(zhì)粒相對(duì)分子量，提高外源DNA片段的裝載量。2、滅活一些質(zhì)粒的基因（如可轉(zhuǎn)移基因），保證重組實(shí)驗(yàn)的安全；滅活質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)控制基因，提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。3、加入選擇性標(biāo)記，便于重組子的檢測(cè)4、加入多克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入5、根據(jù)克隆的目的，加裝特殊的表達(dá)元件或便于蛋白純化的元件（GST標(biāo)簽）第二章-DNA重組克隆的單元操作R7268ApRR1drd19ApRCmRSmRSuRKmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApRTcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApRTcR78pMB1(b)例:第一個(gè)人工構(gòu)建的遺傳載體pBR322第二章-DNA重組克隆的單元操作（三）、質(zhì)粒的分類及用途1、克隆質(zhì)粒：能在宿主細(xì)胞中高拷貝存在（含有氯霉素可擴(kuò)增的松弛型復(fù)制子或解除了對(duì)質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)控制作用）。2、測(cè)序質(zhì)粒:能高拷貝復(fù)制，含有MCS，含有通用的引物序列（如SP6，T7），能形成單鏈模板，便于測(cè)序反應(yīng)的進(jìn)行。3、整合質(zhì)粒：含有整合酶編碼基因以及整合特異性位點(diǎn)序列，克隆在這種質(zhì)粒上的外援基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，能準(zhǔn)確重新整合在染色體DNA的特點(diǎn)位點(diǎn)上（如動(dòng)物植物細(xì)胞中用于目的基因敲除的載體，見(jiàn)第五章、第六章）。第二章-DNA重組克隆的單元操作第二章-DNA重組克隆的單元操作（三）、質(zhì)粒的分類及用途4、穿梭載體（shuttlevector）質(zhì)粒分子上含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記，能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)。如大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒。特點(diǎn)：克隆在這類載體上的外源基因不需要更換載體直接從一種受體菌轉(zhuǎn)入另一種受體菌復(fù)制并且遺傳。第二章-DNA重組克隆的單元操作三、質(zhì)粒的分類及用途5、探針質(zhì)粒：用來(lái)篩選克隆基因的表達(dá)調(diào)控元件。通常含有報(bào)告基因，但缺少相應(yīng)的調(diào)控序列（如啟動(dòng)子或終止子），只有含有啟動(dòng)子或終止子的調(diào)控序列被克隆進(jìn)入載體后，報(bào)告基因才能別表達(dá)，表達(dá)量的大小直接反應(yīng)了克隆進(jìn)入的調(diào)控元件的強(qiáng)弱。第二章-DNA重組克隆的單元操作無(wú)啟動(dòng)子序列報(bào)告基因第二章-DNA重組克隆的單元操作（三）、質(zhì)粒的分類及用途6、表達(dá)質(zhì)粒在多克隆位點(diǎn)的上下游分別裝有兩套轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動(dòng)子、合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）序列以及強(qiáng)有力的終止子結(jié)構(gòu)，使得克隆在合適位點(diǎn)上的任何外源基因均能在受體細(xì)胞中高效表達(dá)。如pET載體。常用的載體見(jiàn)表格2-1（p16)第二章-DNA重組克隆的單元操作MCS復(fù)制原點(diǎn)選擇標(biāo)記高效啟動(dòng)子終止子序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)第二章-DNA重組克隆的單元操作pGEM載體—克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄加入了兩個(gè)短片段，這兩個(gè)片段在限制性酶切位點(diǎn)的兩側(cè)，可被T7噬菌體的RNA聚合酶或SP6T7噬菌體的RNA聚合酶的識(shí)別方便了克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄，便于研究RNA加工，合成蛋白質(zhì)等的研究等6、表達(dá)質(zhì)粒第二章-DNA重組克隆的單元操作pGEM-3Z多拷貝裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子用于外源基因的高效表達(dá)注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如E.coliBL21（DE3）等AproripGEM-3Z2743bplacZ’PT7MCSPSP6第二章-DNA重組克隆的單元操作（四）、質(zhì)粒DNA的制備1基于分子大小的分離2基于構(gòu)象的分離質(zhì)粒有三種構(gòu)型cccDNA(共價(jià)閉環(huán)DNA)：DNA的兩條鏈都是完整的。ocDNA(開(kāi)環(huán)DNA)：只有一條鏈?zhǔn)峭暾?。線性DNA：DNA的兩條鏈均被打開(kāi)。多種細(xì)菌中存在線性的質(zhì)粒DNA。但末端或是通過(guò)重復(fù)序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或通過(guò)共價(jià)結(jié)合蛋白進(jìn)行保護(hù)，避免核酸酶的降解。第二章-DNA重組克隆的單元操作超螺旋DNA松弛cccDNA開(kāi)環(huán)DNA核酸內(nèi)切酶DNA連接酶核酸內(nèi)切酶DNA促旋酶拓?fù)洚悩?gòu)酶第二章-DNA重組克隆的單元操作堿變性用CsCl-EB等密度離心UpperbandcontainingchromosomalDNAandopenplasmidcirclesLowerbandofcovalentlyclosedcirclesplasmidDNAEthidiumbromide(EB)電泳方向cccDNAL-DNAOC-DNACKRZ第二章-DNA重組克隆的單元操作總結(jié)質(zhì)粒載體1、質(zhì)粒載體的基本性質(zhì)：自我復(fù)制能力、拷貝數(shù)的控制、嚴(yán)謹(jǐn)型和松弛型質(zhì)粒、質(zhì)粒的不相容性及機(jī)理2、質(zhì)粒載體具備的特點(diǎn)3、質(zhì)粒載體的分類：克隆載體、測(cè)序載體、穿梭載體、表達(dá)載體和探針載體等的特點(diǎn)第二章-DNA重組克隆的單元操作（一）、噬菌體的生物學(xué)特征λ噬菌體顆粒中的DNA是一線性雙鏈DNA分子，長(zhǎng)48502bp?；虼丶帕芯€λ噬菌體上有些基因可被取代而不影響其生活周期線性λ噬菌體兩端各有12個(gè)堿基的5’凸出黏性末端是互補(bǔ)的,該互補(bǔ)序列相互作用形成cos位點(diǎn)。

作用：進(jìn)入細(xì)胞的λDNA通過(guò)兩端的黏性末端環(huán)化。

二、λ雙鏈?zhǔn)删wDNA載體第二章-DNA重組克隆的單元操作第二章-DNA重組克隆的單元操作第二章-DNA重組克隆的單元操作第二章-DNA重組克隆的單元操作1、對(duì)野生λ噬菌體的改進(jìn)A、刪除多余的限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)。B、切除一些非必需序列，增加載體的容量。

C、設(shè)計(jì)陽(yáng)性選擇重組子的方法。

D、發(fā)展可以使插入的真核cDNA與β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的載體。

（二）、基于λ噬菌體的克隆載體第二章-DNA重組克隆的單元操作2、λ噬菌體基因組可刪除的部分不影響生存能力λ噬菌體基因組中可以刪除的序列與噬菌體進(jìn)入從裂解狀態(tài)進(jìn)入溶源狀態(tài)以及從溶源狀態(tài)進(jìn)入裂解狀態(tài)有關(guān)，即與噬菌體整合和脫離大腸桿菌的染色體相關(guān)刪除了這部分序列的噬菌體只能進(jìn)行裂解循環(huán)（二）、基于λ噬菌體的克隆載體第二章-DNA重組克隆的單元操作3、重組噬菌體的鑒別（1）lacZ′基因功能選擇方法類似于質(zhì)粒中的藍(lán)白斑篩選（2）cI基因功能選擇法cI插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野生型正常的噬菌斑是“渾濁”的渾濁清亮第二章-DNA重組克隆的單元操作3、重組噬菌體的鑒別（3）Spi-（sensitivetoP2inhibition）正選擇A野生型λ噬菌體，不能在P2噬菌體溶源性細(xì)菌中生長(zhǎng)，為Spi+，即對(duì)在P2噬菌體的抑制呈敏感反應(yīng)。Bλ噬菌體載體中的red和gam區(qū)段被外源片段取代后，λ噬菌體就能在P2噬菌體溶源性細(xì)菌中生長(zhǎng)。第二章-DNA重組克隆的單元操作3、重組噬菌體的鑒別（4）、基于λ基因組大小的篩選包裝體系只能將大小37~52Kb的DNA分子插入到噬菌體的頭部結(jié)構(gòu)中插入型載體通常刪除了噬菌體的中非必須的基因部分，因此中有重組后介于37~52Kb的分子才能被包裝。第二章-DNA重組克隆的單元操作（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）第二章-DNA重組克隆的單元操作根據(jù)噬菌斑的透明度或顏色來(lái)進(jìn)行重組子的篩選第二章-DNA重組克隆的單元操作插入型載體：只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。失去了非必需區(qū)切點(diǎn)又位于報(bào)告基因上，故在切開(kāi)DNA并插入外源基因后，報(bào)告基因失活，即可依此進(jìn)行重組體的篩選可插入長(zhǎng)度為10kb的外源DNA

（三）、λ噬菌體載體分類第二章-DNA重組克隆的單元操作兩種報(bào)告基因的插入型載體cI基因內(nèi)保留HindIII和EcoRI單酶切位點(diǎn)，當(dāng)有外源DNA在這酶切位點(diǎn)插入時(shí)，使cI基因失活，感染hfⅠ-大腸桿菌后可形成空斑（如λgt10）。在噬菌體DNA插入的lacZ基因末端設(shè)有單一的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。在此處插入外源基因，可表達(dá)β-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特異性抗體或DNA測(cè)序方法可篩選重組DNA。這類載體適宜構(gòu)建cDNA文庫(kù)(如λZAPII)（三）、λ噬菌體載體分類第二章-DNA重組克隆的單元操作cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A第二章-DNA重組克隆的單元操作取代型載體：具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA所取代?？煽寺〉钠未?，最大可達(dá)25kb，而質(zhì)粒最大僅10kb左右；λDNA的長(zhǎng)度介于野生型λ噬菌體DNA長(zhǎng)度的75％而不超過(guò)其105％時(shí)，才能被包裝成噬菌體顆粒，當(dāng)DNA的長(zhǎng)度短于野生型的75%或超過(guò)105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降，因此要求λ載體DNA和外源DNA長(zhǎng)度之和在39～53kb之間。（三）、λ噬菌體載體分類第二章-DNA重組克隆的單元操作LacZEcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40第二章-DNA重組克隆的單元操作（四）λ克隆載體的體外包裝

（補(bǔ)充知識(shí)）體外包裝：模擬λ噬菌體DNA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的包裝過(guò)程，將重組的λ噬菌體DNA分子包裝成成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒必要性：

λ噬菌體重組分子直接感染大腸桿菌的效率較低，而在試驗(yàn)過(guò)程中，因內(nèi)切酶的處理，DNA的連接產(chǎn)生的有效分子等原因，使得轉(zhuǎn)染效率更低第二章-DNA重組克隆的單元操作（四）λ克隆載體的體外包裝第二章-DNA重組克隆的單元操作（四）λ克隆載體的體外包裝單菌株體系缺陷型λ噬菌體在cos位點(diǎn)有突變，λ噬菌體的DNA復(fù)制不能完成，但可形成外殼蛋白，可以制備包裝所必須的各種外殼蛋白。第二章-DNA重組克隆的單元操作（四）λ克隆載體的體外包裝雙菌株的體外包裝原理Aλ噬菌體的頭部和尾部的包裝是分開(kāi)進(jìn)行B頭部基因發(fā)生突變的噬菌體只能形成尾部C尾部基因發(fā)生突變的噬菌體只能形成頭部D兩種不同突變的噬菌體混合起來(lái)，能在體外裝備形成有活性的噬菌體顆粒第二章-DNA重組克隆的單元操作Lyse,mixAddATPandconcatemerizedλDNAMaturephageparticles第二章-DNA重組克隆的單元操作（五）λ-DNA分離與純化1、含有乳糖和MgCl2的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌2、加入合適滴度的重組λ噬菌體懸浮液3、用LB繼續(xù)培養(yǎng)，至溶液從渾濁變?yōu)榍辶?、加入固體NaCl和PEG8000,離心獲得噬菌體顆粒5、蛋白酶K處理噬菌體懸浮液，去除蛋白質(zhì)6、乙醇或異丙醇沉淀λ噬菌體DNA第二章-DNA重組克隆的單元操作總結(jié)有關(guān)λ噬菌體改造的載體λ噬菌體的生物學(xué)特點(diǎn)改造野生型λ噬菌體稱為載體需要去除和加入的功能元件有哪些？λ噬菌體重組體的篩選有哪些方法？λ噬菌體載體的類型和特點(diǎn)。第二章-DNA重組克隆的單元操作三、M13單鏈?zhǔn)删wDNA載體（一）M13噬菌體一般特點(diǎn)僅6407個(gè)核苷酸，10個(gè)基因有雙鏈環(huán)狀，單鏈環(huán)狀存在形式基因組采取滾環(huán)復(fù)制形式適合做載體具有比λ噬菌體更大的裝載能力單鏈形式在某些實(shí)驗(yàn)過(guò)程很重要，如測(cè)序、體外突變等第二章-DNA重組克隆的單元操作RFDNA第二章-DNA重組克隆的單元操作第二章-DNA重組克隆的單元操作（二）M13-DNA的改造1、定點(diǎn)誘變的方法封閉重復(fù)的酶切位點(diǎn)2、引入合適的選擇標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因，LacZ’3、引入多克隆位點(diǎn)4、在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)引入測(cè)序引物第二章-DNA重組克隆的單元操作野生型M13RF-DNAM13mp系列載體polylinkerlacZ'IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII第二章-DNA重組克隆的單元操作宿主菌缺陷型缺失N端第11－41位氨基酸：β-半乳糖苷酶沒(méi)有生物活性未插入外源基因的M13mp1與該缺陷型基因可以產(chǎn)生互補(bǔ)插入外源基因的M13mp1與宿主不互補(bǔ)編碼β-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因序列M13mp系列載體polylinkerlacZ‘第二章-DNA重組克隆的單元操作Blue-whiteselection第二章-DNA重組克隆的單元操作四、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體（一）粘粒載體（柯斯質(zhì)粒載體，cosmidvector）

1、定義人工構(gòu)建的含有λDNA的cos（cohesive-endsite)位點(diǎn)序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。第二章-DNA重組克隆的單元操作pHC796.4kb柯斯質(zhì)粒載體pHC79圖由pBR322質(zhì)粒DNA與λ噬菌體DNA的cos位點(diǎn)及其控制包裝作用的序列構(gòu)成第二章-DNA重組克隆的單元操作2、柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)（1）只具有λ噬菌體的包裝特性，重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞按λ噬菌體的方式進(jìn)行。（2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子、抗生素基因和相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)）；（3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb,克隆極限可達(dá)45kb左右）廣泛應(yīng)用于基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建。（一）粘粒載體（柯斯質(zhì)粒）第二章-DNA重組克隆的單元操作（二）噬菌粒載體1、一般特點(diǎn)由絲狀噬菌體DNA復(fù)制起始位點(diǎn)序列與質(zhì)粒組合形成的雜合分子。將M13噬菌體基因II和IV之間的DNA復(fù)制起始、終止和包裝識(shí)別序列克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體，形成噬菌粒。第二章-DNA重組克隆的單元操作（二）噬菌粒載體2、優(yōu)點(diǎn)A、具有質(zhì)粒的基本性質(zhì)，便于外源DNA的克隆和重組子的選擇B、具有更高的裝載容量C、比M13-DNA重組分子更具有遺傳穩(wěn)定性，在復(fù)制時(shí)不會(huì)發(fā)生DNA缺失第二章-DNA重組克隆的單元操作五、人工染色體載體1、BAC（bacterialartificialchromosome）A、以大腸桿菌（E.coli）F性因子為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體。B、特點(diǎn)：容納大約200Kb的片段可以像大腸桿菌的質(zhì)粒一樣繁殖（低拷貝，嚴(yán)謹(jǐn)型）在宿主細(xì)胞中不會(huì)發(fā)生重組第二章-DNA重組克隆的單元操作五、人工染色體載體2、P1以及PAC載體（Pl-derivedArtificialChromosome）組件：

包裝位點(diǎn)（pac）：體外包裝重組子成為噬菌體粒子所必需。

兩個(gè)loxP位點(diǎn)：能被噬菌體重組酶（cre基因的產(chǎn)物）所識(shí)別具有P1和F-因子的特性能插入100-300Kb片段第二章-DNA重組克隆的單元操作補(bǔ)充知識(shí)點(diǎn)Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp（EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X03453），編碼38kDa蛋白質(zhì)。是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。LoxP（locusofX-overP1）序列：來(lái)源于P1噬菌體，是有兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過(guò)程中與DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下：

ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT第二章-DNA重組克隆的單元操作+CrerecombinaseproteincircularizesinjectedDNAattheloxPsites.DNA-replicatesusingplasmidreplicon,PlasmidcopynumberisincreasedbyinductionofP1lyticreplicon.PacextractcleavesatpacsiteandinsertsDNAintop1heads.TailsareattachedAllowphagetoadsorbtohoststrainandinjectDNAintocre+hostcell.第二章-DNA重組克隆的單元操作正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲(chóng)端粒（tel)*酵母自主復(fù)制序列（ARS)*酵母著絲點(diǎn)(CEN)*酵母的選擇標(biāo)記(TRP1、URA1)YAC載體第二章-DNA重組克隆的單元操作第二節(jié)DNA的體外重組目標(biāo)DNA與載體在體外連接，形成新的DNA分子。涉及到各種工具酶第二章-DNA重組克隆的單元操作一、序列特異的DNA限制性內(nèi)切核酸酶

λ噬菌體E.coli菌株λKλCλBK110-410-4B10-4110-4C111（一）限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第二章-DNA重組克隆的單元操作（一）限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

—宿主細(xì)胞的限制和修飾作用1、宿主細(xì)胞的限制和修飾作用：兩種不同來(lái)源的入-噬菌體λK；λB，能高頻感染各自大腸桿菌宿主細(xì)胞（K株，B株）。當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)，感染下降數(shù)千倍。一但λK噬菌體在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,不能感染原來(lái)K株.第二章-DNA重組克隆的單元操作(二)限制和修飾作用的分子機(jī)制1．大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，B株，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。

1）

它們均有三個(gè)連續(xù)的基因位點(diǎn)控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）

hsdR編碼限制性核酸內(nèi)切酶---識(shí)別DNA分子特定位點(diǎn)，將雙鏈DNA切斷。

3）

hsdM編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位點(diǎn)的堿基甲基化反應(yīng)。

4）

hsdS表達(dá)產(chǎn)物的功能是---協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。第二章-DNA重組克隆的單元操作(二)、限制和修飾作用的分子機(jī)制2.入噬菌體長(zhǎng)期生長(zhǎng)在大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，B株中，

1）宿主細(xì)胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護(hù).2）封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)（修飾）3．當(dāng)外來(lái)DNA入侵時(shí)，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異降解（限制）4.由于降解不完全，外來(lái)少數(shù)DNA分子在宿主細(xì)胞中繁殖過(guò)程中被宿主細(xì)胞的甲基化酶修飾，雖然是外來(lái)卻不被降解。第二章-DNA重組克隆的單元操作5．但喪失在原宿主細(xì)胞中的存活能力，因?yàn)榻邮芰诵滤拗骶谆揎椀耐瑫r(shí)喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記(一但λK噬菌體在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,不能感染原來(lái)K株)6．細(xì)菌利用限制和修飾系統(tǒng)來(lái)區(qū)分自身DNA與外來(lái)DNA。C株不能產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶，其它來(lái)源入-噬菌體可以感染C株，在C株繁殖，其產(chǎn)生噬菌體則在K株和B株受到嚴(yán)格的限制作用(二)限制和修飾作用的分子機(jī)制第二章-DNA重組克隆的單元操作(三)限制性內(nèi)切酶的分類I類酶II類酶III類酶酶分子三亞基雙功能內(nèi)切酶與甲基化酶分離二亞基雙功能識(shí)別位點(diǎn)二分非對(duì)稱序列4-8bp序列，回文結(jié)構(gòu)5-7bp非對(duì)稱序列切割位點(diǎn)距識(shí)別位點(diǎn)1000bp在識(shí)別位點(diǎn)中或靠識(shí)別位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp限制性反應(yīng)與甲基化反應(yīng)互斥分開(kāi)反應(yīng)同時(shí)竟?fàn)幭拗谱饔眯枰枰恍枰诙?DNA重組克隆的單元操作酶的命名3.

命名（1973年Smith原則、Ⅱ型酶）根據(jù)分離此酶微生物的學(xué)名，一般取3個(gè)字母。第一個(gè)字母大寫(xiě)該微生物屬名前的第一個(gè)字母第二、三個(gè)字母小寫(xiě)該微生物種名前的2個(gè)字母第四個(gè)字母大寫(xiě)有變種或品系的第一個(gè)字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種限制酶，按發(fā)現(xiàn)順序排列如EcoRⅠ是指從大腸桿菌（Escherichiacoli）R株分離得到的第一種限制酶。第二章-DNA重組克隆的單元操作（四）限制性內(nèi)切酶Ⅱ切割特點(diǎn)1、識(shí)別位點(diǎn)一般為4-8個(gè)bp的回文序列大多數(shù)酶作用于底物DNA雙鏈，位點(diǎn)在識(shí)別序列中或靠近識(shí)別序列少數(shù)酶能作用于回文序列相應(yīng)DNA單鏈序列第二章-DNA重組克隆的單元操作限制性內(nèi)切酶Ⅱ切割特異位點(diǎn)的機(jī)理第二章-DNA重組克隆的單元操作（四）限制性內(nèi)切酶Ⅱ切割特點(diǎn)平末端：兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心，形成的DNA片段具有平末端。黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來(lái)。

5’突出的黏性末端

3’突出的黏性末端第二章-DNA重組克隆的單元操作平末端的DNA片段不易重新環(huán)化第二章-DNA重組克隆的單元操作已知有兩種不同的限制酶都可產(chǎn)生粘性末端：5’-P端突出：3’-OH端突出：第二章-DNA重組克隆的單元操作同尾酶一組來(lái)源不同識(shí)別序列各異的，但能夠切割形成相同粘性末端的核酸內(nèi)切限制酶。第二章-DNA重組克隆的單元操作HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’同裂酶（isoschizomers）有一些來(lái)源不同的限制性內(nèi)切酶能識(shí)別并切割相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。第二章-DNA重組克隆的單元操作限制酶識(shí)別與切割的靶點(diǎn)序列及其隨后的連接同DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)，即不帶有種的特異性，對(duì)各種DNA普遍適用。根據(jù)這一特性，才能將不同來(lái)源的DNA片段重組成新的重組體分子或是新的基因。第二章-DNA重組克隆的單元操作（五）甲基化酶對(duì)內(nèi)切酶識(shí)別的影響為限制性內(nèi)切酶的伙伴，其識(shí)別位點(diǎn)與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶相同，并在識(shí)別序列內(nèi)使某位堿基甲基化，對(duì)基因組甲基化后，內(nèi)切酶識(shí)別發(fā)生的變化：1）封閉了內(nèi)切酶的切口。如M.EcoRⅠ2）一些依賴甲基化的限制性內(nèi)切酶的切口產(chǎn)生5′—TCGATCGA—3′5′—TCGA*TCGA*—3′5′—AGCTAGCT—3′5′—A*GCTA*GCT—3′TaqITaqIDpnI第二章-DNA重組克隆的單元操作（五）甲基化酶對(duì)內(nèi)切酶識(shí)別的影響3）增加了部分酶的識(shí)別特異性。大腸桿菌基因組內(nèi)存在兩種甲基化酶,Dam和Dcm5′—ATCGAT—3′ClaI5′—GA*TCGAT—3′5′—ATCGA*TC—3′4）部分酶對(duì)其識(shí)別序列內(nèi)的堿基是否甲基化，不影響切割5′—(C/T/A)ATCGAT(T/A/G)—3′ClaI第二章-DNA重組克隆的單元操作二、連接酶第二章-DNA重組克隆的單元操作（一）DNA連接酶的作用模式1、連接酶：能夠催化兩條雙鏈DNA鏈之間形成3′

，5′磷酸二酯鍵的酶5’－末端形成DNA－腺苷酸復(fù)合物第二章-DNA重組克隆的單元操作（二）DNA連接酶的兩種類型類型I：E.coliDNA連接酶（只連接粘末端）利用NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）作為能量供體，主要來(lái)源于原核生物類型II：T4DNA連接酶（粘末端和平末端）

利用ATP作為能量供體，主要來(lái)源于真核生物，T4噬菌體也屬于此類在基因工程的實(shí)驗(yàn)中主要用T4DNA連接酶第二章-DNA重組克隆的單元操作（三）條件（1）連接所需的條件一條DNA鏈的3’末端具有一個(gè)游離的羥基（-OH），而在另一條DNA鏈的5’末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（-P）；（2）需要有一種能源分子存在以提供羥基與磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵時(shí)所需的能量。大腸桿菌及其它細(xì)菌中：NAD+（氧化氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）動(dòng)物細(xì)胞及噬菌體中：ATPOH3’5’P第二章-DNA重組克隆的單元操作（四）注意被連接的兩條DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分，DNA連接酶并不能連接兩條單DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子。DNA連接酶只能連接并封閉雙螺旋DNA分子所出現(xiàn)的切口（Nick），即封閉雙鏈DNA上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的斷裂第二章-DNA重組克隆的單元操作GGTAC-OHP-CC-PHO-CATGG5’3’3’5’GG-OHP-CCCCATGG5’3’3’5’GGTACCCCATGG5’3’3’5’第二章-DNA重組克隆的單元操作三、其他用于DNA重組的工具酶1、DNA聚合酶Ⅰ（來(lái)自大腸桿菌）功能：5’→3’的聚合酶活性。5’→3’外切核酸酶活性，3’→5’外切核酸酶利用：5’→3’的聚合酶活性以及5’→3’外切核酸酶活性，切口平移大片段（Klenow片段）：5’→3’的聚合酶活性，3’→5’外切核酸酶小片段DNA聚合酶Ⅰ第二章-DNA重組克隆的單元操作第二章-DNA重組克隆的單元操作TaqDNA聚合酶（來(lái)自耐熱細(xì)菌）具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切核酸酶，高度保真。耐高溫。T4DNA聚合酶：具極強(qiáng)3’→5’外切核酸酶活性，可修平非平頭的DNA分子。測(cè)序酶：具有5’→3’的聚合酶活性，但不具備3’→5’外切核酸酶的T7DNA聚合酶。反轉(zhuǎn)錄酶：以mRNA為模板合成DNA的聚合酶第二章-DNA重組克隆的單元操作2、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶不需要模板的DNA聚合酶，底物為帶有游離3′端的羥基的雙鏈DNA分子。三、其他用于DNA重組的工具酶5′3′OH+Mg2++dATP+TdT5′3′AAAAAAAA5′3′OH5′3′AAAAAAAA+Co2++dATP+TdT5′3′OH+Co2++dATP+TdT5′3′AAAAAAAAA3′突出端平端3′凹端第二章-DNA重組克隆的單元操作3、S1核酸酶以外切或內(nèi)切的方式降解單鏈RNA或DNA。4、Bal31核酸酶三、其他用于DNA重組的工具酶第二章-DNA重組克隆的單元操作三、其他用于DNA重組的工具酶5、堿性磷酸酯酶：除去DNA5′磷酸的酶6、激酶：在DNA或RNA的5′羥基(OH)端進(jìn)行磷酸化的酶（作用結(jié)果是添加磷酸，可用于核酸的末端標(biāo)記）第二章-DNA重組克隆的單元操作四、DNA切接反應(yīng)的影響因素（一）、限制性內(nèi)切酶切割反應(yīng)合適的緩沖液（10~50mMTris-HCl,pH7.5);10mMMgCl2、1mMDTT對(duì)NaCl的濃度要求不同，可以分為低鹽組中鹽組高鹽組雙酶切反應(yīng)的原則A、鹽濃度要求相似的內(nèi)切酶可在一個(gè)反應(yīng)體系中做雙酶切反應(yīng)B、先做低鹽反應(yīng)酶切再做高鹽反應(yīng)的酶切C、考慮雙酶切位點(diǎn)的核苷酸排列第二章-DNA重組克隆的單元操作四、DNA切接反應(yīng)的影響因素星號(hào)活性在非理想條件下，酶的專一性降低，導(dǎo)致內(nèi)切酶切割與其識(shí)別序列相似序列的現(xiàn)象，稱為限制性內(nèi)切酶的星號(hào)活性。如EcoRI5′—GAATTC—3′EcoRI低鹽、高pH值、過(guò)量甘油5′—AAATTC—3′5′—GAGTTC—3′第二章-DNA重組克隆的單元操作四、DNA切接反應(yīng)的影響因素（二）、T4-DNA連接酶的連接反應(yīng)緩沖液體系：50~100mMTris-HCl（pH7.5）10mMMgCl2、1mMDTT，≤1mMATP過(guò)量的甘油抑制反應(yīng)溫度、離子濃度、DNA末端的性質(zhì)、DNA片段的大??；載體和外源基因的摩爾比因大多數(shù)內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端退火溫度在15度以下，故連接反應(yīng)一般在低溫下進(jìn)行（16度以下）。第二章-DNA重組克隆的單元操作（三）重組率及其影響因素1、由同一種酶切割的載體分子和目標(biāo)DNA片段在連接時(shí)會(huì)產(chǎn)生三種連接產(chǎn)物：載體自連外源DNA片段自連載體+外源DNA片段的連接產(chǎn)物（目標(biāo)重組產(chǎn)物）2、提高重組產(chǎn)物的方法：增加外源片段與載體片段的比值（3~8:1)載體DNA的5′去磷酸化用末端轉(zhuǎn)移酶分別處理載體和目標(biāo)片段，使它們帶有互補(bǔ)的末端四、DNA切接反應(yīng)的影響因素第二章-DNA重組克隆的單元操作1、互補(bǔ)黏性末端之間的連接同一限制酶切割位點(diǎn)連接：

由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后產(chǎn)生單鏈突出（5‘突出及3’突出）的粘性末端，同時(shí)酶切位點(diǎn)附近的DNA序列不影響連接，那么，當(dāng)這樣的兩個(gè)DNA片段一起退火時(shí)，粘性末端單鏈間進(jìn)行堿基配對(duì)，然后在DNA連接酶催化作用下形成共價(jià)結(jié)合的重組DNA分子。具有兩個(gè)插入方向兩個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)連接：只可一種方向插入同尾酶切割位點(diǎn)連接：發(fā)生酶切口的焊死作用五、DNA分子重組的方法第二章-DNA重組克隆的單元操作五、DNA分子重組的方法2、平末端之間的鏈接DNA連接酶可催化相同和不同限制性核酸內(nèi)切酶切割的平端之間的連接。原則上講，限制酶切割DNA后產(chǎn)生的平端也屬配伍末端，可彼此相互連接；若產(chǎn)生的粘性末端經(jīng)特殊酶處理，使單鏈突出處補(bǔ)齊或削平，變?yōu)槠蕉?，也可?shí)行平端連接。操作方法同黏性末端之間的鏈接，增加酶的用量。提高連接反應(yīng)溫度；增加DNA平頭末端的濃度等。第二章-DNA重組克隆的單元操作3、將粘末端加到平末端分子上DNA接頭同聚物加尾產(chǎn)生粘性末端PCR產(chǎn)物的克隆連接（特例）五、DNA分子重組的方法第二章-DNA重組克隆的單元操作DNA接頭第二章-DNA重組克隆的單元操作

同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后進(jìn)行粘性末端連接。這是一種人工提高連接效率的方法，也屬于粘性末端連接的一種特殊形式。dATPdTTP同聚物加尾產(chǎn)生粘性末端第二章-DNA重組克隆的單元操作PCR產(chǎn)物的克隆連接PCR反應(yīng)中所使用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，通常在3’末端加上A。經(jīng)特使處理的載體具有3’突出T堿基，通過(guò)T/A互補(bǔ)，進(jìn)行克隆。屬于黏性末端的連接，該克隆方式特稱TA克隆。第二章-DNA重組克隆的單元操作從生物秀網(wǎng)站下載第二章-DNA重組克隆的單元操作4、定向克隆將外源DNA按正確的方向插入載體。通常采用不同的內(nèi)切酶分別處理載體和片段，使線性載體和片段的兩段帶有不同的粘性末端，通過(guò)載體與片段之間的連接，實(shí)現(xiàn)定向克隆。第二章-DNA重組克隆的單元操作第三節(jié)重組DNA分子的轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增第二章-DNA重組克隆的單元操作一、概念將重組DNA分子，導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，該導(dǎo)入過(guò)程及操作系統(tǒng)稱之為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。兩個(gè)條件：可轉(zhuǎn)化的DNA分子受體細(xì)胞第二章-DNA重組克隆的單元操作細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過(guò)程（革蘭氏陽(yáng)性菌）1、感受態(tài)的形成細(xì)胞分泌激活蛋白→與細(xì)胞表面受體結(jié)合→誘導(dǎo)特征性蛋白質(zhì)（如細(xì)菌溶素）合成→細(xì)胞壁部分溶解→暴露細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白和核酸酶2、轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合：細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白與雙鏈DNA特異結(jié)合。第二章-DNA重組克隆的單元操作3、轉(zhuǎn)化因子吸收：DNA+蛋白質(zhì)→激活核酸酶→DNA一條鏈被降解，另一條鏈進(jìn)入到受體細(xì)胞中4、整合復(fù)合物前體的形成：?jiǎn)捂淒NA+細(xì)胞中游離蛋白質(zhì)→形成整合復(fù)合物前體結(jié)構(gòu)（避免細(xì)胞內(nèi)各種核酸酶的攻擊）→引導(dǎo)進(jìn)入受體細(xì)胞染色體DNA處。5、同源重組的方式置換受體DNA的同源區(qū)域細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過(guò)程（革蘭氏陽(yáng)性菌）第二章-DNA重組克隆的單元操作二、受體細(xì)胞的選擇1、限制缺陷型的細(xì)胞：將相應(yīng)細(xì)胞中的內(nèi)切酶失活（如大腸桿菌中的hsdR，使之變成hsdR-

突變株系）2、重組缺陷型細(xì)胞轉(zhuǎn)入的外源DNA分子能夠自主復(fù)制，一般不需要將DNA重組到染色體DNA，因此受體細(xì)胞應(yīng)該是重組相關(guān)的酶的突變株系(如大腸桿菌中recA-,recB-,recC-第二章-DNA重組克隆的單元操作二、受體細(xì)胞的選擇3、轉(zhuǎn)化親和型：使細(xì)胞壁的通透性增高，提高轉(zhuǎn)化效率；噬菌體受體菌細(xì)胞膜上需有特異性吸附的相關(guān)受體。4、遺傳互補(bǔ)型：受體細(xì)胞與載體上的選擇標(biāo)記具有互補(bǔ)的遺傳性狀。如載體上具有抗生素基因，細(xì)菌細(xì)胞中就應(yīng)該沒(méi)有該基因或該基因突變，這樣受體細(xì)胞接受外源DNA后，就會(huì)獲得載體上的選擇標(biāo)記的性狀，這樣可篩選外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。第二章-DNA重組克隆的單元操作二、受體細(xì)胞的選擇5、感染寄生缺陷型對(duì)于人體和牲畜有害的細(xì)菌，在作為受體時(shí)，需將其感染寄生能力突變，從而具有生物安全性。第二章-DNA重組克隆的單元操作三、轉(zhuǎn)化方法動(dòng)植物細(xì)胞通常應(yīng)病毒感染的方法，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞方法如下：1、Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化外膜與內(nèi)膜間的部分核酸酶離開(kāi)細(xì)胞膨脹細(xì)胞膜磷酯層形成液晶感受態(tài)加入DNA羥基磷酸鈣-DNA復(fù)合物核酸酶不能降解42℃處理膜液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通透性增加，DNA進(jìn)入細(xì)胞低滲CaCl2溶液第二章-DNA重組克隆的單元操作三、轉(zhuǎn)化方法2、PEG介導(dǎo)的細(xì)菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞→適量溶菌酶等滲溶液→原生質(zhì)體（膜上DNase）→環(huán)狀DNA分子的吸收→DNA樣品+PEG→涂布在固體培養(yǎng)基上→細(xì)胞壁再生→通過(guò)選擇標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。3、電轉(zhuǎn)化電場(chǎng)脈沖作用下→細(xì)胞壁形成微孔通道→DNA與細(xì)胞膜結(jié)合，引發(fā)吸收。轉(zhuǎn)化分子量大的DNA比較有效。第二章-DNA重組克隆的單元操作三、轉(zhuǎn)化方法4、接合轉(zhuǎn)化接合：細(xì)菌細(xì)胞間的直接接觸導(dǎo)致DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。接合質(zhì)粒介導(dǎo)：促進(jìn)細(xì)胞有效接觸、誘導(dǎo)DNA分子傳遞轉(zhuǎn)移第二章-DNA重組克隆的單元操作接合轉(zhuǎn)化過(guò)程供體菌(待轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒的菌株），不能在最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但抗生素XR輔助菌(含輔助質(zhì)粒的菌株），不能在最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但抗生素YR受體菌,能在最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)一段時(shí)間后含有X+Y的最小培養(yǎng)基第二章-DNA重組克隆的單元操作四、轉(zhuǎn)化率及其影響因素1、轉(zhuǎn)化率的定義定義1：待轉(zhuǎn)化的DNA分子遠(yuǎn)大于受體細(xì)胞的條件下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)之比。定義2：受體細(xì)胞相對(duì)于DNA分子大大過(guò)量時(shí)，每微克DNA轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生克隆數(shù)。（每微克DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)）第二章-DNA重組克隆的單元操作四、轉(zhuǎn)化率及其影響因素2、轉(zhuǎn)化率的用途參照已知轉(zhuǎn)化率和重組率可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)的規(guī)模，如平板的制備數(shù)量第二章-DNA重組克隆的單元操作四、轉(zhuǎn)化率及其影響因素3、轉(zhuǎn)化率的影響因素載體DNA及重組DNA：構(gòu)象和大小受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化操作：選擇適合轉(zhuǎn)化方法和優(yōu)化操作流程第二章-DNA重組克隆的單元操作2.3.5轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖載體攜帶標(biāo)記基因拷貝數(shù)擴(kuò)增及表達(dá)克隆外源基因的表達(dá)第二章-DNA重組克隆的單元操作2.4轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定非轉(zhuǎn)化子：未接納載體或重組子的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的的轉(zhuǎn)化細(xì)胞重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子非重組子：含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子期望重組子：含有目的基因的重組子非期望重組子：不含目的基因的重組子第二章-DNA重組克隆的單元操作2.4.1基于載體遺傳標(biāo)記的篩選與鑒定載體DNA分子上多攜帶的選擇性遺傳標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子或重組子。在合適的培養(yǎng)基上：轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)（菌落或噬菌斑）非轉(zhuǎn)化子不生長(zhǎng)第二章-DNA重組克隆的單元操作2.4.1.1抗藥性篩選方法載體上含有