病毒病實(shí)驗(yàn)室診斷-病毒的增殖與人工培養(yǎng)（動(dòng)物微生物課件）

動(dòng)物接種培養(yǎng)的應(yīng)用：尚無敏感細(xì)胞的病毒培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果易觀察，可建立動(dòng)物模型。缺點(diǎn)：有飼養(yǎng)條件要求，費(fèi)用高，動(dòng)物體內(nèi)常帶有潛伏病毒。動(dòng)物接種培養(yǎng)動(dòng)物的物種進(jìn)化程度在選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)應(yīng)該是優(yōu)先考慮的問題。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R”原則“敬畏自然，尊重生命”選擇何種微生物等級(jí)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，也應(yīng)根據(jù)各級(jí)動(dòng)物的特點(diǎn)，結(jié)合課題研究的水平、內(nèi)容及目的而定。接種病毒后觀察應(yīng)每日至少2次，根據(jù)試驗(yàn)的目的不同，觀察不同的反應(yīng)情況。例如在進(jìn)行新城疫診斷時(shí)需進(jìn)行ICPI、IVPI。普通動(dòng)物無特定病原體動(dòng)物悉生動(dòng)物無菌動(dòng)物雞胚培養(yǎng)采用孵化9～12日齡的雞胚優(yōu)點(diǎn)：易管理，操作簡單，成本較低。缺點(diǎn)：可能垂直傳播，存在卵黃抗體干擾。

絨毛尿囊膜：痘苗病毒、人類皰疹病毒尿囊腔：流感病毒、腮腺炎病毒接種部位羊膜腔：流感病毒的初次分離

卵黃囊：嗜神經(jīng)病毒

不同病毒對(duì)雞胚敏感性不同。直接法：生長發(fā)育情況，痘疹、痘斑，MDT。間接法：尿囊液、羊水進(jìn)行HA/HI。1．氣室2．卵殼3．卵黃囊4．卵白5．尿囊腔6．絨毛尿囊7．胚胎8．羊水腔9．胚外體液膜用的雞胚細(xì)胞培養(yǎng)

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

原代細(xì)胞

細(xì)胞種類二倍體細(xì)胞

傳代細(xì)胞系

培養(yǎng)方式優(yōu)點(diǎn)1是離體組織細(xì)胞不受機(jī)體免疫力影響，易于生長。

2便于人工選擇多種敏感細(xì)胞供病毒生長。3易于觀察病毒的生長特征。4便于收集病毒作進(jìn)一步檢查。缺點(diǎn)成本和技術(shù)水平要求較高、操作復(fù)雜。離體的新鮮組織或器官，機(jī)械處理胰蛋白酶消化加入營養(yǎng)液

單個(gè)細(xì)胞懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度分裝培養(yǎng)瓶內(nèi)長成單層細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞。將長成單層原代細(xì)胞胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶

形成單層細(xì)胞稱次代培養(yǎng)。二倍體細(xì)胞：原代細(xì)胞多次連續(xù)傳代后仍保持二倍體染色體特性（含23對(duì)染色體），稱之為二倍體細(xì)胞。傳代細(xì)胞壽命一般為40~50代，其廣泛用于病毒的分離和疫苗的制備。傳代細(xì)胞系：來源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過程的變異細(xì)胞。細(xì)胞增殖特征和染色體均類似于腫瘤細(xì)胞。不宜用于疫苗的制備，常用于病毒的分離和鑒定。細(xì)胞培養(yǎng)瓶單層細(xì)胞

病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖所引起的特有的細(xì)胞病變，稱為細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等（多數(shù)病毒）LOREM在培養(yǎng)細(xì)胞中形成包涵體（狂犬病毒等）ABC形成多核巨細(xì)胞/融合細(xì)胞（麻疹病毒等）一般程序：標(biāo)本無菌處理動(dòng)物接種雞胚培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)指標(biāo)陽性指標(biāo)陰性

病毒鑒定

盲傳2～3代指標(biāo)陰性病毒陰性活細(xì)胞---嚴(yán)格寄生性（缺乏增殖所需的酶系統(tǒng)）敏感細(xì)胞---選擇性（親嗜性）復(fù)制：即自我復(fù)制本身的成分，然后裝配成病毒粒子。有囊膜病毒的復(fù)制穿入吸附脫殼釋放裝配、成熟生物合成病毒復(fù)制的基本過程吸附穿入脫殼生物合成裝配與釋放吸附穿入有囊膜病毒的穿入

囊膜與細(xì)胞膜融合

吞飲作用

無囊膜病毒的穿入

直接穿入

吞飲作用

囊膜與細(xì)胞膜融合囊膜與細(xì)胞膜融合吞飲作用脫殼

多數(shù)病毒的脫殼與穿入同時(shí)進(jìn)行的。不同病毒的脫殼又各有特色，例如：新城疫病毒經(jīng)溶酶體酶的作用脫殼。痘病毒的脫殼分為兩個(gè)階段進(jìn)行。呼腸孤病毒只脫去外層衣殼，內(nèi)層衣殼不脫去，形成亞病毒顆粒。小RNA病毒在吸附的同時(shí)，就發(fā)生衣殼蛋白消失，即吸附的同時(shí)就發(fā)生了脫殼。生物合成

生物合成即病毒遺傳信息的控制下合成病毒的各種組成成分。早期:病毒特異性酶的合成病毒核酸復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成生物合成

有囊膜病毒的生物