電泳基本理論68

電泳基本理論

內(nèi)容摘要1概述2電泳的基本原理3電泳系統(tǒng)4支持介質(zhì)5染料6影響因素11電泳概述1.1電泳的定義帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱之為電泳(electrophoresis，簡(jiǎn)稱EP)。電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的一類實(shí)驗(yàn)技術(shù)。帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)是物質(zhì)的一種運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象。移動(dòng)的速度與顆粒帶電的強(qiáng)弱、分離介質(zhì)的阻力、電極液的粘度和電場(chǎng)強(qiáng)度等因素有關(guān)。生物大分子在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度除上述因素外還與分子形狀、相對(duì)分子質(zhì)量大小、分子的帶電性質(zhì)及數(shù)目等因素有關(guān)。21.2電泳技術(shù)的發(fā)展過程電泳現(xiàn)象早在1808年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但電泳作為一種分離技術(shù)卻是在1937年由瑞典科學(xué)家TiseliusA首先提出來的，并設(shè)計(jì)出世界上第一臺(tái)自由電泳儀，建立了“移界電泳”分離模式。他用光學(xué)方法觀察到在電泳遷移過程中血清蛋白質(zhì)界面的移動(dòng)，首先證明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白組成的，為表彰他對(duì)電泳技術(shù)所做出的突出貢獻(xiàn)，1948年他被授予諾貝爾獎(jiǎng)。320世紀(jì)50年代，以支持介質(zhì)為主的電泳模式不斷涌現(xiàn)，如濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后發(fā)展了以凝膠為主的支持物的電泳方法，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠電泳等。1967年ShapiroAL等在凝膠電泳的基礎(chǔ)上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)。70年代以后根據(jù)不同需要推出了多種電泳模式，如圓盤電泳、垂直板電泳、雙向電泳、脈沖電泳、等電聚焦電泳、印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術(shù)。4

90年代又推出了分辨率極高的高效毛細(xì)管電泳。多年來科學(xué)家們對(duì)電泳結(jié)果的分析做了大量的工作，建立了各種實(shí)驗(yàn)方法，電泳后對(duì)分離物質(zhì)可以用染色、掃描、紫外吸收、放射自顯影、生物活性測(cè)定等方法進(jìn)行分析，得到所需數(shù)據(jù)。51.3電泳的常用術(shù)語(1)電泳遷移(electrophoreticmigration)：在電泳過程中，帶電粒子在電場(chǎng)的作用下做定向移動(dòng)，單位是cm。(2)遷移時(shí)間(migrationtime)：用tm表示在電泳過程中，帶電粒子在電場(chǎng)的作用下做定向移動(dòng)所用的時(shí)間，單位是min。(3)電泳速度(electrophoreticvelocity)：用Vep表示在單位時(shí)間內(nèi)，帶電粒子在電場(chǎng)的作用下做定向運(yùn)動(dòng)的距離，單位是cm/sec。6(4)電場(chǎng)強(qiáng)度(electricfieldstrength)：用E表示在給定的電泳支持物兩端電極施加電壓后所形成的電效應(yīng)，單位是V/cm。E=V/Lt式中V為電壓，Lt為兩端電極的距離。7AB(5)電滲流(electroosmoticflow)：用EOF表示在電場(chǎng)中電泳溶液的正電荷與固體支持物表面上的負(fù)電荷之間相互作用，形成一個(gè)正離子層，導(dǎo)致流體朝負(fù)極方向移動(dòng)，稱為電滲流，這種現(xiàn)象也稱之為電滲(electroosmosis)現(xiàn)象,如圖。8電滲流遷移速度(Vep)的表達(dá)式為：ε

ξ電滲流遷移速度Vep=—————E4πη式中為電解常數(shù)，

為支持物與表面平切面的Zeta電勢(shì)，為緩沖液粘度，E為電場(chǎng)強(qiáng)度。通常情況下，電滲流總是由正極向負(fù)極移動(dòng)，只有在特殊情況下如分離堿性蛋白質(zhì)的陰極電泳時(shí)溶液pH較低，固體支持物表面帶正電荷，形成向正極移動(dòng)的電滲流。電滲流的大小受到Zeta電勢(shì)，偶電層厚度和緩沖液粘度等因素的影響，直觀地看電滲流隨著電解質(zhì)濃度的增加而增加，隨著pH值的增加而加大。9(6)相對(duì)遷移率(relativemobility)：用mR表示蛋白質(zhì)樣品的遷移距離與示蹤染料的遷移距離之比即為相對(duì)遷移率，即蛋白質(zhì)的遷移距離(cm)mR=—————————————示蹤染料的遷移距離(cm)102電泳的基本原理2.1帶電顆粒溶液中任何物質(zhì)由于其本身的解離或表面吸附其它帶電質(zhì)點(diǎn)而帶電，在電場(chǎng)中就會(huì)發(fā)生遷移，移動(dòng)方向取決于它們的帶電符號(hào)。NaCl→Na++Cl–生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于溶液終的H+濃度112.2電泳遷移率(mobility)如果把生物大分子的膠體溶液放在沒有干擾的電場(chǎng)中，使帶電顆粒具有恒定遷移率的驅(qū)動(dòng)力來自于顆粒上的有效電荷Q和電位梯度E，即：F=QE(1)帶電顆粒在遷移中同時(shí)受到來自于介質(zhì)的摩擦力F’，對(duì)于球形顆粒來說，在自由溶液中此阻力服從Stock定律：F’=6πrηv(2)這里v是在介質(zhì)粘度為η的溶液中，半徑為r的帶電顆粒的移動(dòng)速度。但在凝膠中，這種阻力并不完全符合Stocks定律。F’還取決于介質(zhì)中的其它因素如凝膠厚度、顆粒大小和介質(zhì)的內(nèi)滲等。12當(dāng)帶電顆粒達(dá)到穩(wěn)態(tài)運(yùn)動(dòng)時(shí)，F(xiàn)=F’，由(1)、(2)式推導(dǎo)出：vQ———=————（3）E6πrη不同的帶電顆粒在同一電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)速度不同，其泳動(dòng)速度用遷移率（或稱泳動(dòng)度）m來表示，定義為在電位梯度E(V/cm)的影響下，顆粒在時(shí)間t(s)中遷移距離d(cm)，即在單位電場(chǎng)強(qiáng)度(1V/cm)時(shí)的泳動(dòng)速度：

vdm=——=———(4)Et·E13將(3)代入(4)，得到Qm=————(5)6πr

由上式可看出電泳遷移率與球形分子、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷有關(guān)。在確定的條件下，某物質(zhì)的遷移率為常數(shù)，是該物質(zhì)的物化特性常數(shù)。從(4)式可以導(dǎo)出遷移率的單位是cm2·s-1·V-1。14

2.3帶電顆粒的移動(dòng)速度v與電位梯度E、電流密度J和導(dǎo)電性K的關(guān)系如果在同樣實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)某蛋白溶液做兩個(gè)電泳試驗(yàn)，一個(gè)試驗(yàn)用兩倍的時(shí)間一倍的電壓，另一個(gè)試驗(yàn)用一倍的時(shí)間兩倍的電壓，從理論上講，這兩個(gè)試驗(yàn)中蛋白質(zhì)的遷移距離應(yīng)該是相等的。但是實(shí)際上只能是大致相等，原因是在電泳過程中還有其他因素的干擾，如在增加電壓的同時(shí)也增加了熱效應(yīng)。移動(dòng)的速度決定于其分子的形狀、相對(duì)分子質(zhì)量的大小、分子帶電性質(zhì)及數(shù)目，還與分離介質(zhì)的阻力、溶液粘度及電場(chǎng)強(qiáng)度等因素有關(guān)。15我們把帶電顆粒的移動(dòng)速度用以下公式表示v=m·E=m·J/K(6)由此可以看出，帶電顆粒的移動(dòng)速度v等于電位梯度E和遷移率m的乘積，與電流密度J和遷移率m的乘積成正比，與溶液的導(dǎo)電性K成反比。也就是說，電場(chǎng)強(qiáng)度越高電泳速度越快；溶液的導(dǎo)電性越強(qiáng)，電泳速度越慢。因此電泳速度隨著電位梯度或溶液的導(dǎo)電性的變化而改變。163電泳的分類3.1按分離原理分類(1)區(qū)帶電泳(zoneelectrophoresis，ZEP)：是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后在介質(zhì)上加電場(chǎng)，帶電顆粒在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)內(nèi)遷移，在電泳過程中，不同的離子成分在均一的緩沖液系統(tǒng)中分離成獨(dú)立的區(qū)帶(圖3-2a)，這是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。17(2)移界電泳(movingboundaryelectrophoresis，MBEP)：是把電場(chǎng)加在生物大分子溶液和緩沖溶液之間的界面上，帶電顆粒的移動(dòng)速度通過光學(xué)方法觀察界面的移動(dòng)來測(cè)定(圖3-2b)。(3)穩(wěn)態(tài)電泳(steadystateelectrophoresis)：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下電遷移一定時(shí)間后達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，此后，電泳條帶的寬度不隨時(shí)間的變化而變化，如等速電泳(isotachophoresis，ITP)、等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)(圖2c、2d)。18abcd圖3-2各種電泳分離原理示意圖a區(qū)帶電泳b移界電泳c等速電泳d等電聚焦194電泳系統(tǒng)4.1電泳儀及附屬設(shè)備從第一臺(tái)商品自由移界電泳系統(tǒng)的問世以后，近50年來電泳儀器的發(fā)展迅猛，尤其是隨著凝膠電泳技術(shù)的成熟及廣泛應(yīng)用，各種類型的凝膠電泳裝置層出不窮，使電泳技術(shù)得以迅速發(fā)展。凝膠電泳儀作為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)小型儀器，種類很多。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，電泳儀器的分析對(duì)象也越來越專門化，分辨率越來越高，操作越來越簡(jiǎn)單，性能越來越穩(wěn)定。凝膠電泳系統(tǒng)主要包括電泳儀、電泳槽及附屬設(shè)備三大類。204.2電泳儀：根據(jù)電泳儀的電壓設(shè)計(jì)范圍可將其分為三類：(1)常壓電泳儀(600V)：用于凈電荷和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；(2)高壓電泳儀(3000V)：用于載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳和DNA測(cè)序；(3)超高壓電泳儀(30000-50000V)：用于毛細(xì)管電泳。21224.2電泳槽：

根據(jù)電泳種類不同，對(duì)電泳槽的設(shè)計(jì)也不一樣。電泳槽主要有自由界面電泳槽、管狀電泳槽、板式電泳槽。(1)自由界面電泳槽Tiselius設(shè)計(jì)的自由界面電泳槽（圖3-3）是一個(gè)U形玻璃管，在U形管下部放待分離的蛋白溶液，管臂聯(lián)接到電極上，在電場(chǎng)的作用下，緩沖系統(tǒng)中蛋白質(zhì)界面的移動(dòng)可用光學(xué)系統(tǒng)“紋影法(schlieren)”照相，得到電泳圖譜。這種電泳槽目前已不使用。90年代初發(fā)展起來的高效毛細(xì)管電泳就是根據(jù)自由界面電泳槽的原理而設(shè)計(jì)的。23電極電極U形管

3Tiselius自由界面電泳裝置示意圖24(2)管狀電泳槽50年代末商品圓盤電泳槽問世。圓盤電泳槽有上下兩個(gè)電泳槽和帶有鉑金電極的蓋，上電泳槽具有若干個(gè)孔，可插電泳管。將丙烯酰胺凝膠貯液裝在玻璃管內(nèi)，凝膠在電泳管中聚合成柱狀膠條，樣品經(jīng)電泳分離，蛋白區(qū)帶染色后呈圓盤狀，因而稱圓盤電泳(discelectrophoresis)。25圓盤電泳槽

26(3)板狀電泳槽板狀電泳槽是目前使用最多的電泳槽，是將凝膠灌裝在兩塊平行的玻璃板中間，因而稱板狀電泳(slabelectrophoresis)。板狀電泳的最大優(yōu)點(diǎn)是包括標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白在內(nèi)的多個(gè)樣品可在同一塊凝膠上在相同的條件下進(jìn)行電泳，便于利用各種鑒定方法，直接比較各樣品的區(qū)帶，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠；還可進(jìn)行雙向電泳。另外，板膠電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量容易消散，凝膠電泳結(jié)果便于照相和制成干膠。板狀電泳槽有垂直板電泳槽和水平板電泳槽。27垂板電泳槽轉(zhuǎn)移電泳槽平板電泳槽雙向電泳槽28

制備電泳槽294.3附屬設(shè)備隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，電泳技術(shù)的種類逐漸增加，凝膠電泳在制膠、電泳系統(tǒng)的冷卻、凝膠染色及結(jié)果分析等方面手段日趨完善，科學(xué)家們研制出各種電泳附屬設(shè)備，如梯度混合儀、外循環(huán)恒溫系統(tǒng)、脫色儀、凝膠干燥系統(tǒng)、凝膠掃描儀、凝膠成像儀等。3031325電泳的操作模式目前最常用的電泳操作模式是區(qū)帶電泳中的聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳，前者主要用于蛋白質(zhì)的分離鑒定，后者主要于核酸的分析鑒定。電泳的操作模式有按操作方式和分離原理分類。335.1按電泳方式分類(1)端電極電泳：有垂直式和水平式兩種方式，多用于蛋白質(zhì)電泳。(2)搭橋電泳：為水平式，水平板狀電泳槽形式多樣，凝膠和緩沖液通過間接接觸的方式，如用濾紙橋搭接，用緩沖液制作的凝膠條或?yàn)V紙條搭接（圖3-4），后兩者即半干技術(shù)，多用于免疫電泳、等電聚焦。34ABC圖4水平板狀電泳中凝膠與緩沖液的接觸方式A濾紙橋B凝膠條C濾紙條(3)潛水電泳：為水平式，電泳時(shí)凝膠浸于緩沖液中，多用于核酸電泳。355.2按分離原理分類(1)凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳；(2)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；(3)聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳；(4)聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳；(5)聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦；(6)聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移印跡電泳；(7)瓊脂糖凝膠水平電泳；(8)瓊脂糖凝膠脈沖電泳；(9)瓊脂糖凝膠免疫電泳。366凝膠電泳的支持介質(zhì)6.1支持介質(zhì)的性質(zhì)采用支持介質(zhì)進(jìn)行電泳的目的是防止在電泳過程中分子的對(duì)流和擴(kuò)散，使被分離物質(zhì)得到更有效的分離。支持介質(zhì)應(yīng)當(dāng)具備以下特性：(1)物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定：在電泳過程中不受環(huán)境因素的影響，保持原有的狀態(tài)和性能。(2)化學(xué)惰性：在電泳過程中不與緩沖系統(tǒng)中的各種離子和待分離的生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不干擾生物大分子的電泳過程。(3)分布均勻：內(nèi)電滲小，結(jié)果重復(fù)性好376.2支持介質(zhì)的分類電泳的固體支持介質(zhì)可以分為兩類:(1)薄膜類：薄膜類包括紙類，醋酸纖維素薄膜，聚酰胺薄膜等.這類支持介質(zhì)化學(xué)惰性好，在電泳過程中產(chǎn)生的對(duì)流和擴(kuò)散較小，分離的基本原理主要是基于生物大分子的電荷密度。38(2)凝膠類：凝膠類包括淀粉凝膠，瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠等。這類介質(zhì)相對(duì)薄膜類又了進(jìn)一步，它具有高粘度和高摩擦阻力，它在電泳過程中不僅能防止對(duì)流，減小擴(kuò)散，還具有凝膠的多孔性，孔徑與蛋白質(zhì)分子大小大致相同，因而能產(chǎn)生分子篩效應(yīng)(molecularsievingeffect)，其分離作用既與電荷密度有關(guān)，又與分子大小有關(guān)，因而凝膠的分離原理是基于大分子的電荷密度和分子大小，對(duì)分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的生物大分子極為有利。所以，生物大分子如蛋白質(zhì)和核酸電泳多采用凝膠類介質(zhì)。淀粉凝膠由于質(zhì)量難以控制，操作繁瑣，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用，現(xiàn)在用得最多的是聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠。397凝膠支持介質(zhì)7.1聚丙烯酰胺凝膠7.1.1聚丙烯酰胺凝膠的特性聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。用此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophorsis，簡(jiǎn)稱PAGE)。聚丙烯酰胺凝膠用于電泳的支持介質(zhì)，與其它凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠具有以下優(yōu)點(diǎn)：40(1)孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級(jí)，具有良好的分子篩效應(yīng)。根據(jù)待分離大分子的相對(duì)分子質(zhì)量，通過改變凝膠濃度及交聯(lián)劑度來調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，使大分子得到較好的分離。(2)在一定濃度范圍內(nèi)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好(3)凝膠是由—C—C—C—C—結(jié)合的酰胺類多聚物，側(cè)鏈上具有不活潑的酰胺基，沒有其它帶電基團(tuán)，所以凝膠性能穩(wěn)定，電滲作用小，無吸附，化學(xué)惰性強(qiáng)。與生物大分子不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，電泳過程中不受溫度、pH的變化的影響。41(4)具有高分辨率和靈敏度，尤其是在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，樣品不易擴(kuò)散。并有多種染色方法提高電泳條帶顯色的靈敏度，分離蛋白質(zhì)的靈敏度可達(dá)10-6g。(5)單體純度高，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，電泳結(jié)果具有很好的重復(fù)性。

42(6)凝膠雜質(zhì)少，在很多溶劑中不溶，可適用于少量樣品的制備，不致污染樣品。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物發(fā)展起來的電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳、等電聚焦及雙向電泳等電泳技術(shù)，不僅能分離、小量制備生物大分子，而且可以用來研究生物大分子的性質(zhì)如電荷、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)以及構(gòu)象等。437.1.2聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。(1)AP-TMTED催化體系：屬于化學(xué)聚合作用，TMTED是一種脂肪族叔胺，分子式為

H3C\/CH3N(CH2)2NH3C/\CH3

44它的堿基可催化溶液中的AP使其形成游離氧自由基，激活A(yù)cr單體形成單體長(zhǎng)鏈，同時(shí)在交聯(lián)劑Bis的作用下長(zhǎng)鏈彼此交聯(lián)聚合成凝膠，反應(yīng)式如下：·TEMED催化AP生成硫酸自由基：S2O82－→2SO4·ˉ·硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體長(zhǎng)鏈：4546Bis將單體長(zhǎng)鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：47聚合反應(yīng)受各種因素的影響，如系統(tǒng)中催化劑和加速劑的濃度、pH、溫度、分子氧和雜質(zhì)都會(huì)影響凝膠的聚合過程。(2)核黃素-TEMED催化系統(tǒng)：屬于光聚合作用，聚合原理是核黃素在光照條件下分解，被還原成無色核黃素，后者在有少量氧的條件下，被氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)。487.1.3凝膠總濃度及交聯(lián)度與凝膠的性質(zhì)：(1)

凝膠總濃度與凝膠特性：凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總濃度和兩者的比例是決定聚丙烯酰胺凝膠特性，包括其機(jī)械性能、彈性、透明度、粘著度及孔徑大小的主要參數(shù)。1962年HjerténS引入兩個(gè)計(jì)算公式，即凝膠總濃度（T）是表示凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總百分含量a+bT=———×100%m交聯(lián)度（C）是表示凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的百分含量。49

bC=———×100%a+b式中，a為丙烯酰胺單體的質(zhì)量(g)，b為交聯(lián)劑N,N’-甲叉雙丙烯酰胺的質(zhì)量(g)，m為溶液的終體積(ml)。凝膠a、b的比例是很重要的，決定了凝膠的物理性狀。當(dāng)a:b小于10時(shí)，凝膠脆且硬，不透明，呈乳白色；當(dāng)a:b大于100時(shí)，即使用5%的丙烯酰胺凝膠也呈糊狀；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺濃度高于3%，凝膠富有彈性并且透明。50(1)

凝膠總濃度及交聯(lián)度對(duì)孔徑的關(guān)系：聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑取決于凝膠的總濃度T和交聯(lián)度C。有效孔徑隨著T的增加而減小，電泳中帶電顆粒移動(dòng)時(shí)受到網(wǎng)孔的阻力大，反之帶電顆粒受到的阻力小。當(dāng)凝膠總濃度小于2.5%時(shí)，可以篩分相對(duì)分子質(zhì)量為106以上的大分子，但此時(shí)凝膠幾乎是液體，通常要加0.5%的瓊脂糖來增加凝膠的硬度而不影響凝膠的孔徑大??；當(dāng)凝膠濃度大于30%時(shí)，則可以篩分相對(duì)分子質(zhì)量小于2kD的多肽,在凝膠總濃度一定時(shí)，交聯(lián)劑含量不同影響凝膠的孔徑，交聯(lián)劑的含量與不同凝膠濃度平均孔徑之間的關(guān)系見表3-1：51表3-1Bis的含量與不同凝膠濃度平均孔徑之間的關(guān)系總凝膠濃度(%)平均孔徑(?)Bis占總凝膠的百分?jǐn)?shù)1515256.5241928—8.02316243610.01914203012.0179——15.0147——52從表中可以看出，當(dāng)Bis占總凝膠濃度5%時(shí)，凝膠的平均孔徑在各凝膠濃度時(shí)均最小，高于或低于5%時(shí)孔徑相應(yīng)變大。凝膠孔徑大小也受凝膠總濃度的影響，一般凝膠總濃度越高，凝膠孔徑越小。凝膠孔徑大小有一定范圍，每次制備凝膠時(shí)所得到的有效孔徑不完全相同。53(3)凝膠總濃度與凝膠的分子篩效應(yīng)：凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應(yīng)，在凝膠中生物大分子的分離取決于它的凈電荷和分子大小。分子篩效應(yīng)的大小取決于凝膠孔徑大小與生物大分子大小相接近的程度。凝膠濃度不同，平均孔徑也不同，不同大小和形狀的大分子通過孔徑時(shí)所受的阻滯力也不同，加上大分子的電荷效應(yīng)，使各種大分子遷移率不同得以分離。54在實(shí)際工作中，常依據(jù)待分離蛋白質(zhì)已知相對(duì)分子質(zhì)量的大小來選擇所合適的凝膠濃度，使蛋白質(zhì)混合物得到最大限度的分離，表3-2列出了蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系。大多數(shù)蛋白質(zhì)在7.5%凝膠中能得到滿意的結(jié)果，所以這個(gè)濃度的凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí)，常用標(biāo)準(zhǔn)膠或梯度凝膠來測(cè)試，而后確定適宜的凝膠濃度。55表3-2蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量范圍(kD)適用的凝膠濃度（T%）＜1020—3010—4015—2040—10010—15100—5005—10＞5002—5567.2瓊脂糖凝膠7.2.1瓊脂糖凝膠的特性瓊脂糖(agarose)是從瓊脂中精制出來的膠狀多糖(gel-formingpolysaccharide)，瓊脂又是從天然的紅色的墨角藻(red-seaweed)中提取出來的。瓊脂含有兩種多糖，即瓊脂糖和瓊脂膠，從瓊脂膠中脫去硫酸酯基和丙酮酸酯基就可獲得瓊脂糖。瓊脂糖的分子結(jié)構(gòu)大部分是由1,3連接的

-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水-D吡喃半乳糖交替而成。57(1)瓊脂糖凝膠屬于大孔膠，可以分析107的大分子，但電泳分辨率低于聚丙烯酰胺凝膠電泳。這種大孔特性有利于免疫固定、免疫電泳和微量制備。瓊脂糖形成凝膠后孔徑的大小取決于瓊脂糖百分濃度，如表3-3；表3-3瓊脂糖凝膠的濃度與孔徑的關(guān)系瓊脂糖(%)孔徑(nm)0.0758000.165001.01502.02058

(2)具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，對(duì)樣品吸附極小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好；(3)具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，允許在1%或更低的濃度下使用，且在這種濃度下仍然有篩分和抗對(duì)流作用；(4)瓊脂糖無毒，具有熱可逆性，膠凝過程不需催化劑，制備簡(jiǎn)單、快速。低膠凝溫度及低熔點(diǎn)的瓊脂糖有利于樣品回收，達(dá)到樣品制備的目的；(5)瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，染色、脫色程序簡(jiǎn)單快速；597.2.2瓊脂糖凝膠的主要性能指標(biāo)：

(1)電內(nèi)滲(electroendosmosis，簡(jiǎn)稱EEO)：是瓊脂糖電泳中由多糖骨架上的帶電基團(tuán)引起，主要是硫酸酯和丙酮酸鹽，這些陰離子基團(tuán)被固定在介質(zhì)中，相應(yīng)的陽離子與其結(jié)合水一起向陰極移動(dòng)（圖3-6），電內(nèi)滲對(duì)DNA的分離沒有顯著影響，但高電內(nèi)滲時(shí)對(duì)大分子的遷移有一定阻礙作用，電泳耗時(shí)較長(zhǎng)。60(1)

膠凝溫度：將瓊脂糖在溶液中加熱至90℃溶解，然后將溫度下降至某一溫度時(shí)由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，此溫度即為凝固點(diǎn)，稱為膠凝溫度。一般在35℃—43℃。(3)熔化溫度：將凝固的凝膠由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)的溫度即熔化點(diǎn)，稱為熔化溫度。一般在75—90℃。用于制備目的時(shí)，采用低熔點(diǎn)瓊脂糖，熔化溫度需低于30℃，

61(4)凝膠強(qiáng)度：定義為每平方厘米凝膠所能承受的重量(g/cm2)，凝膠強(qiáng)度與凝膠濃度成正比。凝膠強(qiáng)度越高，所能允許使用的凝膠濃度越小。在電泳中通常使用1%的瓊脂糖凝膠。尿素和碘化鉀等阻礙氫鍵形成的試劑也會(huì)降低凝膠強(qiáng)度，使凝膠變軟易碎，給操作帶來困難。(5)脫水收縮作用：是指瓊脂糖凝膠中擠壓出液體的現(xiàn)象，使用時(shí)要用濾紙吸干凝膠表面的水。627.2.3瓊脂糖凝膠電泳在核酸研究中的應(yīng)用：由于瓊脂糖凝膠孔徑相當(dāng)大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，其分子篩效應(yīng)微不足道。以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)的電泳已廣泛應(yīng)用于核酸研究中，為DNA分子及其片段的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定和DNA分子構(gòu)象的分析提供了重要手段。瓊脂糖對(duì)DNA的分離范圍較廣，用不同濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長(zhǎng)度為200bp至50kb的DNA。從表3-4中可以看到凝膠的濃度越低，適用于分離越大的DNA。63表3-4不同瓊脂糖凝膠濃度與分離DNA大小范圍的關(guān)系瓊脂糖凝膠濃度(%)線性DNA分子的有效分離范圍(kb)0.35—600.61—200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—42.00.1—3647.3新型凝膠介質(zhì)雖然聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠是目前最常用的兩種支持介質(zhì)，但是它們還存在一定的局限性，如聚丙烯酰胺凝膠聚焦的重復(fù)性較差，瓊脂糖凝膠容易斷裂等。近年來人們正在尋求新型的電泳材料。第一類：丙烯酰胺單體替代物如poly-N-acryloyl-tris(NAT)、N-acryloylsugars、N-acryloylaminoethoxyethanol(AAEE)等。這類N-取代聚丙烯酰胺材料具有以下優(yōu)點(diǎn)：65具有較強(qiáng)的水解穩(wěn)定性，在較廣的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，能在pH2—13環(huán)境中進(jìn)行電泳，適合作為酸堿性pH范圍等電聚焦的支持介質(zhì)；具有高度的親水性和大孔性，適合大相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的分離；凝膠的機(jī)械強(qiáng)度高。66第二類：聚丙烯酰胺—瓊脂糖混合物(Polyacrylamide-agarosemixture)、聚丙烯酰胺—瓊脂糖的衍生物混合物(polyacrylamide-allylglycidylmixture)，這類電泳支持介質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)：具有聚丙烯酰胺分辨率高和瓊脂糖大孔徑的優(yōu)點(diǎn)，機(jī)械強(qiáng)度高，又具有良好的彈性，適合分離特大分子(2500kD)，可用于病毒、SDS變性分子和高相對(duì)分子質(zhì)量的脂蛋白67第三類：“電泳海綿”，是一些海綿狀的支持介質(zhì)材料，還處于試驗(yàn)階段，但它與聚丙烯酰胺和瓊脂糖相比具有很多優(yōu)點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度大，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以是親水的也可是疏水的；可以直接測(cè)量孔徑，孔徑范圍在nm—100μm；688蛋白染染料用染料和生物大分子結(jié)合形成有色的復(fù)合物是電泳后檢測(cè)最常用的方法。選擇高吸光系數(shù)的染料，與生物大分子緊密結(jié)合，形成有色不溶的復(fù)合物，而支持介質(zhì)不吸附染料，便于背景的脫色，有利于蛋白質(zhì)條帶的辨別和定量掃描，從而檢測(cè)出蛋白質(zhì)的純度、含量及生物活性?？捎糜诘鞍踪|(zhì)電泳條帶的染色方法很多，常用的主要有以下幾種：698.1氨基黑類染色：蛋白質(zhì)染色最早是用氨基黑類染料，是一類含有磺酸基的酸性染料，它通過磺酸基與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)形成復(fù)合鹽。常用的有：氨基黑10B(aminoblack10B)萘黑12B200(naphthaleneblack12B200)萘酚籃黑6B(naphthol6B)水牛黑(buffaloblack)等。

70這類染料對(duì)不同的蛋白質(zhì)著色不同，有藍(lán)色棕色黑色，借此可以鑒別不同類型的蛋白質(zhì)。這類染料對(duì)不同的蛋白質(zhì)結(jié)合量不同，染色不均一和高背景影響蛋白質(zhì)的定量。染色靈敏度較低，現(xiàn)在這類染料已很少應(yīng)用，被靈敏度較高的考馬斯亮藍(lán)所代替。718.2考馬斯亮藍(lán)(coomassiebrilliantblue，簡(jiǎn)稱CBB)在蛋白質(zhì)染色中，目前考馬斯亮藍(lán)染色法最為常用，1965年考馬斯亮藍(lán)應(yīng)用于聚丙烯酰胺凝膠染色，它步驟簡(jiǎn)便、靈敏度較高，可進(jìn)行定量掃描。它可分為R和G型兩類：R型為三苯基甲烷(triphenylmethane)，每個(gè)分子含有兩個(gè)SO3H基團(tuán)，本身偏酸性，磺酸基與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)結(jié)合形成染料—蛋白質(zhì)復(fù)合物。G型為二甲花青亮藍(lán)(xylenecyaninebrilliantblue)，是一種甲基取代的三苯基甲烷?？捡R72R-250G-250SO3Na73考馬斯亮藍(lán)R-250是通過范德瓦爾鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色。它與不同蛋白質(zhì)結(jié)合呈現(xiàn)出基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內(nèi)（15—20

g），掃描峰的面積與蛋白量呈線性關(guān)系?？捡R斯亮藍(lán)G-250染色靈敏度不如R-250，其優(yōu)點(diǎn)是在三氯乙酸中以膠體形式存在，能選擇性地和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，染色迅速，著色深的蛋白質(zhì)區(qū)帶在數(shù)秒內(nèi)即可顯現(xiàn)出來，約45分鐘后著色最深，本底低，重復(fù)性好，適用于定量分析。748.3熒光染料：

是一種在電泳前用熒光分子將蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)標(biāo)記，于電泳后通過掃描來測(cè)定熒光區(qū)帶的方法，但由于熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)的定量需要特殊的掃描裝置，影響了此方法的廣泛應(yīng)用。研究工作中使用的熒光染料有以下幾種：(1)磺酰氯(2,5-二甲氨基萘磺酰，dansylchloride，簡(jiǎn)稱DNS-Cl)：是最早應(yīng)用的熒光染料，它在堿性條件下與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)末端氨基酸發(fā)生反應(yīng)，使它們獲得熒光性質(zhì)，在280nm和320nm波長(zhǎng)的紫外燈下可觀察到電泳條帶。75

(2)熒光胺(fluorescamine，又稱fluram)：作用與丹磺酰氯相似。在堿性條件下與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)末端氨基酸發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生熒光。其優(yōu)點(diǎn)是由于自身及分解產(chǎn)物均不顯示熒光，標(biāo)記的蛋白質(zhì)是唯一的熒光物質(zhì)，因此，凝膠沒有熒光背景。(3)2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮[2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone，簡(jiǎn)稱MDPF]：其作用與丹磺酰氯和熒光胺相似，其優(yōu)點(diǎn)是凝膠上MDPF標(biāo)記蛋白質(zhì)的熒光可保持?jǐn)?shù)月。用MDPF標(biāo)記時(shí)，熒光強(qiáng)度在蛋白質(zhì)濃度1—500ng范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，標(biāo)記蛋白做SDS分析時(shí)，其相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(log10)與相對(duì)遷移率之間呈線性關(guān)系。76(4)1-苯胺基-8-萘磺酸(1-amino-naphthal-sulfonicacid，簡(jiǎn)稱ANS)：染料本身無色，但與蛋白質(zhì)結(jié)合后，在紫外光下可顯出黃綠色熒光。電泳后將凝膠置于此染料溶液中，1—3分鐘后在長(zhǎng)波紫外光下即可觀察到熒光蛋白條帶。778.4硝酸銀染色：目前染色機(jī)理尚不清楚，可能是將結(jié)合在蛋白質(zhì)上的銀離子還原成金屬銀而顯色，研究表明蛋白質(zhì)上堿性和含硫氨基酸在銀染中的重要性，染色靈敏度是考馬斯亮藍(lán)R-250的100倍左右，可以檢測(cè)0.38ng/mm2的牛血清白蛋白。銀染顯色的方法大致可以分化學(xué)顯色和光顯色兩類。78(1)化學(xué)顯色法(chemicaldevelopment)：

又分為雙胺銀染法(diaminesilverstains)和非雙胺銀染法(non-diaminesilverstains)。雙胺法：是用堿性的NH4OH形成銀—雙胺復(fù)合物，固定后的凝膠浸泡在此溶液中，通過酸化（通常用檸檬酸）顯像，使用較廣泛。非雙胺法：是將固定的凝膠置于酸性的硝酸銀溶液中，銀離子與蛋白質(zhì)發(fā)生作用，在堿性條件下，用甲醛將銀離子還原為金屬銀而顯像，用酸性溶液（檸檬酸或醋酸）終止顯色反應(yīng)，用碳酸鈉處理凝膠可進(jìn)一步增強(qiáng)銀染色的強(qiáng)度。非雙胺法的靈敏度較雙胺法高10倍。79

(2)光顯色(photodevelopment)：

顯色反應(yīng)是固定后的凝膠在酸性環(huán)境中用光能將銀離子還原成金屬銀而使蛋白條帶顯色，它的優(yōu)點(diǎn)是操作程序簡(jiǎn)單，使用一種染色溶液即可達(dá)到顯色目的。808.5特殊蛋白質(zhì)染色:(1)糖蛋白染色：糖蛋白可以通過對(duì)蛋白或碳水化合物的染色來檢測(cè)。如與糖鏈的反應(yīng)，用過碘酸-Schiff試劑(periodic-Schiff’sreagent)染色，簡(jiǎn)稱PAS染色，顯色結(jié)果在543nm處可觀測(cè)到顏色。檢測(cè)靈敏度，最高可以達(dá)到40ng糖蛋白。(2)脂蛋白染色：脂蛋白可以用常規(guī)的染色方法，蘇丹黑B(sudanblack)是常用的染料，銀染法仍然是最靈敏的方法。近年有報(bào)道一種雙染色方法，先用一種發(fā)熒光的染料Filipin使脂蛋白染色，再用考馬斯亮藍(lán)使其它蛋白染色，這樣就可以在一塊凝膠上同時(shí)檢測(cè)出脂蛋白和其它蛋白，靈敏度高，可檢測(cè)低至20ng低密度脂蛋白。81(3)鐵蛋白染色：血紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其它含鐵蛋白能用多種方法檢測(cè)，如普魯士藍(lán)(prussianblue)顯色，它與蛋白質(zhì)分子中的鐵離子結(jié)合，方法十分簡(jiǎn)便。(4)銅蛋白染色：可用茜素藍(lán)S(alizalinS)顯色，它與蛋白質(zhì)分子中的銅離子結(jié)合，蛋白條帶為藍(lán)色。8.6酶活性染色蛋白質(zhì)經(jīng)過電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳后可以保持生物活性，包括酶活性，這就給同工酶的檢測(cè)創(chuàng)造了條件。828.7免疫學(xué)染色免疫學(xué)方法是一種簡(jiǎn)單而且專一性的檢測(cè)方法。將辣根過氧化物酶或放射性同位素標(biāo)記的抗體用于免疫檢測(cè)，經(jīng)過酶與底物的顯色反應(yīng)，使與抗體免疫結(jié)合的蛋白條帶清晰地顯現(xiàn)出來?，F(xiàn)在最常用的方法是凝膠電泳后通過電泳印跡將蛋白轉(zhuǎn)移到固定化膜上，然后利用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。839影響電泳的環(huán)境因素在電場(chǎng)中被分離物質(zhì)的泳動(dòng)速度除受本身性質(zhì)如所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量、分子本身的大小和形狀、分子的水化程度、解離趨勢(shì)、兩性行為等影響外，還與其它外界環(huán)境因素有關(guān)。9.1電場(chǎng)強(qiáng)度的影響：電場(chǎng)強(qiáng)度是指電場(chǎng)中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電勢(shì)梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電泳的速度起著重要作用，電場(chǎng)強(qiáng)度高，帶電顆粒泳動(dòng)速度快，電場(chǎng)強(qiáng)度低，帶電顆粒泳動(dòng)速度慢。849.2溶液pH值的影響：大部分生物大分子都具有陽離子和陰離子基團(tuán)，這些基團(tuán)的解離常數(shù)不同，溶液的pH值決定被分離物質(zhì)帶電基團(tuán)的解離程度，所以生物大分子的凈電荷取決于環(huán)境的pH值。pH影響著生物大分子的電泳遷移率，溶液的pH值距離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)帶電性越強(qiáng)，泳動(dòng)速度越快；pH值距離蛋白質(zhì)的pI越近，蛋白質(zhì)帶電性越弱，泳動(dòng)速度越慢。電泳時(shí)為保持pH恒定，必須采用緩沖液作為電極緩沖液。在分離蛋白質(zhì)時(shí)，要選擇合適pH的緩沖液，使待分離的各種蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量有較大差異，有利于彼此分開。859.3溶液離子強(qiáng)度的影響：溶液中的離子強(qiáng)度直接影響被分離物質(zhì)的電動(dòng)電勢(shì)(

)。帶電顆粒的遷移率與離子強(qiáng)度的平方根成反比。如果溶液的離子強(qiáng)度越大，電動(dòng)電勢(shì)越小，泳動(dòng)速度越慢；如果溶液的離子強(qiáng)度越小，電動(dòng)電勢(shì)越大，泳動(dòng)速度越快。高離子強(qiáng)度時(shí)電泳條帶較細(xì)窄。一般最適合的離子強(qiáng)度在0.02—0.2之間。溶液離子強(qiáng)度的計(jì)算公式如下：I=1/2∑scz2式中，I為離子強(qiáng)度，s表示溶液中有s種離子，c為離子的摩爾濃度(mol/L)，z為離子價(jià)數(shù)。溶液中離子種類多，濃度大，離子價(jià)數(shù)高，則離子強(qiáng)度大。86

(19.4電滲的影響：固體支持物表面的電荷使支持物附近溶液分子形成偶電層，溶液在電場(chǎng)中向一定方向移動(dòng)，即電滲現(xiàn)象，溶液移動(dòng)的同時(shí)攜帶顆粒一起移動(dòng)。

9.5溫度的影響：在凝膠電泳過程中要產(chǎn)生焦?fàn)枱?，而熱?duì)電泳的分離效果影響很大。溫度升高時(shí)，介質(zhì)粘度下降，分子運(yùn)動(dòng)加劇，使自由擴(kuò)散的速度變快，遷移率增加。

9.6介質(zhì)的影響：介質(zhì)的交聯(lián)度直接影響分離效果，介質(zhì)的純度影響聚膠效果，介質(zhì)的非特異性吸附會(huì)增大電滲。87D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IPhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZry0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWs%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t