種子低溫貯藏技術(shù)

第五節(jié)種子低溫貯藏技術(shù)

低溫倉庫是利用人為或自動控制的制冷設(shè)備及裝置保持和控制種子倉庫內(nèi)的溫度、濕度穩(wěn)定，使種子長期貯藏在低溫干燥的條件下，延長種子的壽命，保持種子活力的一種貯種庫型。二、低溫庫的基本要求

1.高度隔熱保冷

2.隔氣防潮

3.結(jié)構(gòu)嚴(yán)密一、低溫庫種類三、低溫庫的原理與設(shè)施

1.制冷低溫貯藏庫的低溫來自機械制冷。制冷機主要有壓縮機、冷凝器、膨脹閥和蒸發(fā)器四部分組成。

2.除濕除濕機械有冷凍除濕機和氯化鋰除濕機兩類。

四、種子低溫倉庫設(shè)備管理

(1)制訂正確使用的規(guī)章制度，加強對機房值班工人的技術(shù)培訓(xùn)，使工人熟練掌握機器性能、設(shè)備安全技術(shù)操作規(guī)程、維修保養(yǎng)和實際操作技術(shù)。做到“三好”(管好、用好、修好)、“四會”(會使用、會保養(yǎng)、會檢查、會排除故障)。

(2)健全機器設(shè)備的檢查、維修和保養(yǎng)制度。

(3)做好設(shè)備的備品、配件管理。

(4)精心管好智能溫濕度儀器。

(5)建立機房崗位責(zé)任制，及時、如實記好機房工作日志。

五、種子低溫倉庫技術(shù)管理特點

(一)嚴(yán)格建立倉貯管理制度

(1)種子入庫前，徹底清倉，按照操作規(guī)程嚴(yán)格消毒或熏蒸。

(2)把好人庫前種子質(zhì)量關(guān)。

(3)合理安排種垛位置，科學(xué)利用倉庫空間，提高利用率。

(4)庫室密封門盡量少開，即使要查庫，亦要多項事宜統(tǒng)籌進行，減少開門次數(shù)。

(5)嚴(yán)格控制庫房溫濕度。

(6)建立庫房安全保衛(wèi)制度。

(7)種子進低溫庫不能馬上開機降溫，應(yīng)先通風(fēng)降低濕度，否則降溫過快，達到露點，造成結(jié)露。

(二)收集與貯存下列主要種子信息

(1)按照國家頒發(fā)的種子檢驗操作規(guī)程，獲取每批種子入庫時初始的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、含水量及主要性狀的檢驗資料。

(2)種子存貯日期、重量和位置(庫室編號及位點編號)。

(3)為寄貯單位存貯種子，雙方共同封存樣品資料。

(三)收集與貯存下列主要監(jiān)測信息

(1)種子貯藏期間；本地自然氣溫、相對濕度、雨量等重要氣象資料。

(2)庫內(nèi)每天定時、定層次、定位點的溫度，相對濕度資料。

(3)種子貯藏過程中，種子質(zhì)量檢驗的有關(guān)監(jiān)測數(shù)據(jù)。六、技術(shù)檔案管理低溫低濕庫的技術(shù)檔案，包括工藝規(guī)程、裝備圖紙、機房工作日志、種子入庫出庫清單、庫內(nèi)溫濕度測定記錄、種子質(zhì)量檢驗資料以及有關(guān)試驗研究資料等等。第六節(jié)超低溫和超干燥貯藏一、種子超低溫貯藏(Ultralowtemperaturestorage)利用液態(tài)氮(-196℃)為冷源，將種子等生物材料置于超低溫下(一般為-196℃)，使其新陳代謝活動處于基本停止?fàn)顟B(tài)，達到長期保持種子壽命的貯藏方法。(一)不同種類種子對液氮低溫反應(yīng)的差異根據(jù)種子對液氮低溫的反應(yīng)，將種子分為三種類型(Stanwood，1985)：①忍耐干燥又忍耐液氮的種子(desiccation-tolerantLN2-tolerantseed)；多數(shù)農(nóng)作物，園藝作物種子都能忍耐干燥和液氮低溫。適合于冷凍保存的最高含水量(highmoisturefreezinglimits，HMFL)就是種子含水量的臨界值。植物種間有明顯的差異(表9.2)。②忍耐干燥對液氮敏感的種子(desiccation-tolerantLN2-sensitiveseed)；許多果樹和堅果類作物如李屬、胡桃屬、榛屬和咖啡屬的植物種子.③對干燥和液氮均敏感的種子(desicction-sensitiveLN2-sensitiveseed)：頑拗型種子。(二)種子超低溫貯藏的技術(shù)關(guān)鍵

1.尋找適合液氮保存的種子含水量

2.冷凍和解凍技術(shù)

3.包裝材料的選擇

4.添加冷凍保護劑常用的冷凍保護劑有二甲基亞砜(DMSO)、甘油、PEG等。

5.解凍后的發(fā)芽方法二、超干燥種子貯藏

(ultra-dryseedstorage)亦稱超低含水量貯存(ultra-lowmoistureseedstorage)。是指種子水分降至5%以下，密封后在室溫條件下或稍微降溫的條件下貯存種子的一種方法。(一)種子超干貯藏的研究概況

1985年，IBPGR首先提出采用超干貯存的設(shè)想，并重點資助研究項目。

1986年，英國里丁大學(xué)首先開始種子超干研究。

20世紀(jì)80年代后期開始，浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)、北京植物園、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家種質(zhì)庫也相繼開展了種子超干研究。

1.適合超干貯藏種子種類脂肪類作物種子具有較強的耐干性，可以進行超干燥貯存。淀粉類和蛋白類作物種子耐干程度差異較大，有待進行深入研究。

2.種子忍耐超干燥的限度已經(jīng)研究出的不同作物種子超干含水量臨界值列于表9.4。

3.種子干燥的適合速率種子的干燥速率因干燥劑的種類和劑量不同而不同。種子在P205/CaO、CaCl2和硅膠中的干燥速率依次遞減，在P2O5中最快，在硅膠中最慢。

4.種子含油量與脫水速率的關(guān)系種子含油量的高低與其脫水速率及耐干性能均成正相關(guān)。

(二)種子超干燥貯藏理論基礎(chǔ)和原理的研究現(xiàn)在看來，至少5%安全水分下限的說法在某些正常型種子上是不適用的。已知抗氧劑維生素E、維生素C等能夠阻止脂氧化酶對多聚不飽和脂肪酸的氧化作用，類胡蘿卜素和谷胱甘肽以及其他酚類物質(zhì)也有這種保護作用(Priestley，1986)。從試驗結(jié)果看SOD等酶類自由基清除劑并沒有被破壞，一旦種子吸水萌動，就可協(xié)同抗氧劑共同清除自由基等毒害物質(zhì)，使耐干的種子有較好的萌發(fā)效果。(三)種子超干燥貯藏的技術(shù)關(guān)鍵

1.超低含水量種子的獲得目前采用的方法有冰凍真空干燥、鼓風(fēng)硅膠干燥、干燥劑室溫下干燥，一般對生活力沒影響。

2.超干種子萌發(fā)前的預(yù)處理發(fā)芽前對超干種子進行回濕處理(飽和水汽平衡、不同相對濕度梯度平衡、PEG滲調(diào)等),使超干種子有一個緩慢的吸水過程,對膜進行修復(fù),改善膜的選擇透性,從而避免種子在吸脹過程中由于大量物質(zhì)滲漏而造成的活力下降。但不同作物種子有不同的特性以及化學(xué)組成,要求的回濕方法也不相同,適當(dāng)?shù)幕貪穹椒▽⒋蟠筇岣叱煞N子的活力水平。第七節(jié)頑拗型種子貯藏面包果紅毛丹榴蓮可可芒果椰子頑拗型種子(recalcitrantseeds)指那些不耐干燥和零上低溫的種子，也即對干燥和低溫敏感的種子。一、頑拗型種子的生理特征

1.干燥脫水易損傷：如紅毛丹種子在水分13%，榴蓮在20%就會喪失生活力。

2.易遭受冷害和凍害：如可可、紅毛丹種子在10℃，芒果在3～6℃就會死亡。

3.屬大型和大粒種子：如椰子、芒果千粒重50～100萬g，栗子、面包果600～8000g。

4.不耐貯藏、壽命短

5.多數(shù)屬于熱帶和水生植物二、種子的貯藏特性確定

三、頑拗型種子的貯藏特性(一)影響頑拗型種子長期貯藏的因素

1.干燥損傷(desitcationinjury)2.不耐低溫、發(fā)生冷害(chillinginjury)3.微生物生長旺盛

4.呼吸作用強

5.貯藏期間發(fā)芽現(xiàn)象(二)頑拗型種子保存的關(guān)鍵措施

1.控制水分使種子水分略高于致死臨界水分。通常用木炭粉、木屑及干苔蘚等加水與種子混存，然后把它們貯藏在聚乙烯袋里。絕對不能密封(袋口敞開或袋上打孔)。為了防止微生物、菌類的旺盛生長，貯藏前用殺菌劑處理是必要的。如采用克菌丹、0.5%氯化汞等處理。

2.防止發(fā)芽

(1)使種子水分剛剛低子種子發(fā)芽所需的水分

(2)抑制發(fā)芽或使種子保持休眠

3.適宜低溫根據(jù)頑拗型種子對貯藏溫度反應(yīng)的不同，可把頑拗型種子分為兩類：一類是易遭冷害的種子，包括熱帶、亞熱帶和水生植物種子，如榴蓮、芒果、紅毛丹、菠蘿蜜、坡壘等種子最好采用高于15℃而低于20℃的貯藏溫度。另一類是不會產(chǎn)生冷害的種子，溫度可低至5℃(或更低)。不管那一類類型，貯藏溫度都不能低于0℃。

四、頑拗型種子的貯藏方法

1.普通短期貯藏貯藏要點是：①防止干燥；②防止微生物侵染；③防止貯藏中萌發(fā)；④保持適宜的氧量供應(yīng)。目前仍是通過田園連續(xù)栽培和繁殖進行保種，這不僅費工費時費錢，而且很不保險。

2.超低溫保存

Grout(1980)報道了用不同水分的番茄種子為材料，采用15%(體積比)二甲基亞砜(dimethyl

sulphoxide，DMSO)作為保護劑。他發(fā)現(xiàn)快速冷凍至-196℃時，水分為33.4%的種子仍有86%的發(fā)芽率；而水分高達72．3%的種子喪失發(fā)芽力，但胚芽外植體(外植體是指用于發(fā)生一個培養(yǎng)無性系的植物或組織的切段)仍有29%存活。

3.離體保存離體保存也稱組織培養(yǎng)，是指把將來能產(chǎn)生小植株的培養(yǎng)物(用于種質(zhì)保存最適是莖尖和胚)，在容器中進行人工控制條件下培養(yǎng)或保存?，F(xiàn)在應(yīng)用離體保存主要采用最低限度生長方法。限制離體生長的方法很多，一般可分為三種：

(1)改變培養(yǎng)的物理條件最常見的是降低容器的貯藏溫度(在6～9℃)，也有采用改善容器的氣體條件；

(2)在培養(yǎng)基中加生長遲緩劑如加入脫落酸(ABA)，甘露糖醇和B9等；

(3)改變培養(yǎng)基的成分即通過減少正常生長的必需因子或減少營養(yǎng)的可給性，如降低蔗糖濃度。對不同作物而言，離體貯藏可以補充種子貯藏的缺陷。

4.組織培養(yǎng)結(jié)合超低溫保存保存過程一般為：材料(如胚)分離——消毒——(防凍劑使用)——冷凍——貯藏——解凍——恢復(fù)生長(培養(yǎng)基上)。用來保存的材料常常是離體胚(excisedembryos)和離體的胚軸(excisedaxis)。現(xiàn)在常用的冷凍劑有二甲基亞砜、甘油、脯氨酸、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、聚乙二醇(PEG)等。首例頑拗型種離體胚在液氮保存后存活是Normah等(1986)用木菠蘿(Hevea

brasiliensis)(也叫榴蓮)胚完成的。胚干燥2～5h，水分在14～20%，液氮內(nèi)保存24h后，20～69%胚存活，并形成了具有正常根、芽的幼苗。第八節(jié)作物種質(zhì)資源的貯藏

一、種質(zhì)資源保存的意義

種質(zhì)資源(germplasmresources)或遺傳資源(geneticresources)在中國習(xí)慣稱作物品種資源。包括古老的地方品種、栽培品種、新育成的品種和品系以及各種作物的突變體、稀有種和近緣野生種等。在形態(tài)上，作物種質(zhì)資源包括有性繁殖的種子和無性繁殖的塊根、塊莖等器官，以至植物的組織和單個細胞。作物種質(zhì)資源來自多樣性中心、栽培中心和育種項目。種質(zhì)資源是發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和實現(xiàn)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的物質(zhì)基礎(chǔ)，是保護綠色資源和造福子孫后代的千秋大業(yè)。種質(zhì)資源作為育種的原始材料選育出的新品種已對世界農(nóng)業(yè)作出巨大的貢獻。

20世紀(jì)50年代以來后，遺傳侵蝕、植物種質(zhì)資源多樣性的消失，正威脅人類的生存。

1974年成立了國際性機構(gòu)——國際植物遺傳資源委員會(IBPGR)。

1994年IBPGR改組為國際植物遺傳資源研究所(IPGRI)。目前全世界已有38個基礎(chǔ)種質(zhì)庫。有76個國家具有中、短期種子貯藏設(shè)施，而其中有56個國家具備長期保存的條件。我國于1985年和1986年先后在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)(北京)建成兩座國家作物種質(zhì)庫(NationalCropGeneBankCAAS)，總建筑面積為4527m2，總?cè)莘e可達60多萬份材料，到1997年底已有入庫農(nóng)作物種質(zhì)資源已達31萬份作為長期保存。國家種質(zhì)庫是全國作物種質(zhì)資源長期保存中心。該庫在美國洛克菲勒基金會和國際植物遺傳資源委員會的部分資助下，于1986年10月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院落成，隸屬于作物品種資源研究所。國家種質(zhì)庫的總建筑面積為3200m2，由試驗區(qū)，加工區(qū)和貯藏區(qū)三部分組成。貯藏區(qū)設(shè)有兩個長期貯藏間，四個可調(diào)貯藏間和兩個緩沖間,總面積為650m2。

國家種質(zhì)庫容量為40萬份以上，庫內(nèi)溫度-18℃，能自動控制，相對濕度小于57%，日處理種子能力200份，一般作物種子可保存50年以上，是目前世界上現(xiàn)代化種質(zhì)庫之一。

二、種質(zhì)資源保存的條件和要求理想的保存條件是干燥、低溫、低水(RH15%；-20℃以下的溫度和4～6%的種子含水量)、低氧、黑暗和無輻射損傷。種質(zhì)資源入庫種子質(zhì)量要求更為嚴(yán)格。種子必須經(jīng)過檢疫，持證人庫。具有原品種特性的當(dāng)年繁殖的種子，其發(fā)芽率應(yīng)95%以上，種子充分成熟、健康、無雜質(zhì)；含水量不得超過國家統(tǒng)一規(guī)定的安全標(biāo)準(zhǔn)，并按貯藏期長短而定；應(yīng)注意種子不能拌用農(nóng)藥，以免影響種子壽命；種子應(yīng)經(jīng)過熏蒸處理。三、種子入庫操作處理

(一)種子入庫處理的重要性

(二)種子入庫操作內(nèi)容在典型的中長期種質(zhì)庫，種子入庫操作處理主要有12方面內(nèi)容。①種子接納登記；②查重去重；③種子清選熏蒸；④種子初始生活力測定；⑤編庫號；⑥種子干燥；⑦含水量測定；⑧種子包裝；⑨入庫定位；⑩貯存材料監(jiān)測；⑩繁殖更新；⑩中期庫種質(zhì)材料分發(fā)。

1.接納登記

2.種子清選與熏蒸

3.種子生活力測定

4.種子干燥

IBPGR推薦采用建造一個干燥溫度保持在15℃、相對濕度在15%(簡稱雙15干燥法)的干燥間，由帶有致冷作用的空氣除濕機(吸收類型)降低溫度和帶走產(chǎn)生的水汽量。

5.種子包裝現(xiàn)在世界上許多國家種質(zhì)庫都使用鋁箔袋作為長期貯藏種質(zhì)的包裝容器。鋁箔袋由三種不同材料合制而成。外層是(17g／m2合成滌綸，4g／m2漆)聚脂，中層是鋁箔[33g／m2鋁箔(12um厚)，4g／m2漆)，內(nèi)層是聚乙烯(63g／m2)。大多數(shù)鋁箔袋的規(guī)格包括9～15um的鋁箔和50～75um厚的聚乙烯。種子包裝程序可分為包裝容器密封性能檢驗，貼標(biāo)簽，包裝，稱重及移交主庫等五個程序。規(guī)定小粒種子10000粒，中粒種6000粒，大粒種子2500粒，特大種子亦不少于500粒。

6.入庫定位如我國的國家?guī)欤瑤煳惶朙E010204可用來表示如下位置：L代表長期庫，E代表東邊的冷庫，01代表第1排，02代表第2架，04代表第四筐。

7.貯存材料的監(jiān)測長期庫至少40年進行一次監(jiān)測。不耐貯存的種子或入庫時起始發(fā)芽率偏低的種子及中期庫貯存種子，至少每5年監(jiān)測一次。每次重復(fù)試驗數(shù)量20～40粒。

8.繁殖更新

IBPGR建議，當(dāng)樣品發(fā)芽率將到低于85%，或樣品數(shù)量減少到低于完成繁殖該物種3次所需種子數(shù)量時，就要進行更新。

9.中期庫種質(zhì)材料的分發(fā)四、種質(zhì)資源保存方法

(一)干燥密封保存干燥劑可用生石灰、氯化鈣、硅膠等，一般種子與干燥劑的比例以1:2為宜，硅膠比例可適當(dāng)提高。

(二)低溫保存種子干燥后進行密封包裝，然后置于低溫條件下如冷庫、冰箱內(nèi)保存。

(三)異地保存如將潮濕地區(qū)的種子移置到干燥、低溫地區(qū)保存。以上這些保存方法，其共同特點是，種子含水量仍相對較高。種子在貯藏中代謝仍比較旺盛，種子衰老快，種子溫度常隨外界環(huán)境的變化而變化，如密封不好，種子含水量還會與環(huán)境濕度平衡。

(四)種質(zhì)庫保存按貯藏期分短期保存，中期保存和長期保存三種。

(五)自然保護區(qū)保存我國1991年底已建立自然保護區(qū)708處，面積達