污染防治課件

12五月2024污染防治

PCR污染的監(jiān)測

PCR強(qiáng)大擴(kuò)增能力+檢測的敏感性經(jīng)30個(gè)周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性，尤其對定量造成很大的問題NTC(NoTemplateControl):

必須設(shè)置一個(gè)不含模板DNA但含有PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應(yīng)，這一對照管須在準(zhǔn)備好所有其他PCR以后才進(jìn)行吸加。

常見的PCRcontamination常規(guī)PCR熒光定量PCRNTC432176598NTC引起PCR污染的原因模板間交叉污染容器被污染模板放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外容器外粘有模板而造成相互間交叉污染模板吸取過程中,因氣溶膠（aerosol）或其他原因引起移液器污染，從而導(dǎo)致交叉污染引起PCR污染的原因PCR試劑污染PCR試劑配制過程中,移液器、容器、水等原因造成試劑被PCR核酸模板污染。引起PCR污染的原因PCR產(chǎn)物污染-最主要最常見PCR產(chǎn)物拷貝量大，極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可形成假陽性。移液器吸取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，同一支移液器去準(zhǔn)備PCRmixPCR產(chǎn)物的氣溶膠污染：一個(gè)氣溶膠顆粒可能含幾萬個(gè)拷貝氣溶膠（aerosol）：懸浮于氣體介質(zhì)中粒徑一般為0.001μm~1000μm的固體、液體微小粒子形成的膠溶狀態(tài)散體系。

空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠引起PCR污染的原因?qū)嶒?yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染克隆質(zhì)粒濃度高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,其污染可能性也很大防止PCR污染首要原則永遠(yuǎn)要設(shè)置NTC對照如果不能在污染出現(xiàn)的第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果：一大段時(shí)間的數(shù)據(jù)不可信準(zhǔn)備PCR的移液器要專用

千萬不能用吸取PCR產(chǎn)物/克隆質(zhì)粒的移液器去準(zhǔn)備PCR體系防止PCR污染空間：

合理分隔實(shí)驗(yàn)區(qū)域:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。

理想狀態(tài)：各個(gè)區(qū)域?qū)嶒?yàn)用品及移液器專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將該區(qū)域用紫外線消毒，破壞殘留的DNA或RNA。防止PCR污染操作一旦進(jìn)入吸加PCR試劑的專用場所并開始工作，就應(yīng)戴上一副新手套，并應(yīng)勤于更換。準(zhǔn)備專供自己使用的PCR試劑，分裝為小份。不要與樣品存放在一起。選擇質(zhì)量好的Eppendorf管--密封性好且開管不需要太大力氣打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)清理臺面防止PCR污染移液器操作由于操作時(shí)不慎將模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣時(shí)要十分小心。1）準(zhǔn)備PCR的移液器專用2）吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成噴霧，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。3）最好在加完所有其他反應(yīng)成分后才吸加模板。4）推薦在準(zhǔn)備PCR過程中使用濾芯槍頭選用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶Uracil-N-Glycosylase)的試劑，有助于防止PCR產(chǎn)物引起的污染。UNG：50攝氏度，2分鐘，作用于含有dU的DNA雙鏈或單鏈然后開始PCR反應(yīng)的預(yù)變性步驟，同時(shí)UNG失活防止PCR污染對于不含dU的PCR產(chǎn)物無效出現(xiàn)污染后解決辦法更換試劑更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用清潔所有可能的污染源：實(shí)驗(yàn)臺面、小離心機(jī)、冰箱門把手等等1）實(shí)驗(yàn)臺面、超凈工作臺用現(xiàn)配的3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液擦拭清潔。2）或者用10%漂白粉溶液擦拭3)紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過90cm，照射時(shí)間最好過夜。實(shí)驗(yàn)過程中更加小心，采用前面提到的各種防止污染的辦法參考文獻(xiàn)KwokS,HiguchiR.AvoidingfalsepositiveswithPCR[J].Nature,1989,339(6221):237-