標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程第頁(yè)一目的建立標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，以減少菌種污染和生長(zhǎng)特性的改變，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。二范圍本規(guī)程適用于質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室所用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。三內(nèi)容1.1試驗(yàn)菌株大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.11.1.11.1.11.1.11.1.21.1.2.11.1.2.2工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過(guò)5代（從菌種收藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代），以防止過(guò)度的傳代增加表型變化的風(fēng)險(xiǎn)。因此必要時(shí)，應(yīng)對(duì)工作菌株的純度和特性進(jìn)行確認(rèn)1.2菌種確認(rèn)試驗(yàn)的主要內(nèi)容1.2.11.2.11.2.1①菌落形態(tài)：在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測(cè)培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線(xiàn)，適宜培養(yǎng)后，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等是否相似；對(duì)于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株，應(yīng)再分別挑取單菌落劃線(xiàn)或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測(cè)是否重復(fù)出現(xiàn)相同特征。②鏡檢特征：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)呈現(xiàn)一致性；細(xì)胞形狀、大小、莢膜、芽孢等特征應(yīng)相似。1.2.2菌種的特1.2.21.3菌種的確定方法用無(wú)菌接種環(huán)粘取培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)分離單個(gè)菌落，并在適宜條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取單一純菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及菌形。再做生化試驗(yàn)或使用菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定菌種。1.3.11.3.11.3.1.1.1取大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～1.3.1.1.2取上述培養(yǎng)物接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18～①曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)平板上菌落形態(tài)呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色,菌落中心呈深紫色或無(wú)明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤(rùn)，常有金屬光澤。②麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)呈鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。1.3.11.3.1①以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫，再通過(guò)火焰2～3次干燥使固定。②滴加結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。③滴加碘液，媒染1min，水洗，以濾紙吸干余水。④滴加95﹪乙醇，脫色20～30s，至流出液無(wú)色，水洗。⑤滴加沙黃染液，復(fù)染1min，待干后，鏡檢。1.3.1.2.2染色結(jié)果應(yīng)是：革1.3.1.2.3鏡檢結(jié)果應(yīng)是：1.3.11.3.1.3.1靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-48h，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液1.3.1.3.2甲基紅試驗(yàn)（M）：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液2～1.3.1.3.3乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P）：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，，于2ml培養(yǎng)液中加入α1.3.1.3.4枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于枸櫞酸鹽1.3.1.3.5乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24-48h，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色：指示劑1.3.2干燥、皺縮、無(wú)典型卷發(fā)狀。1.3.31.3.31.3.31.3.41.3.41.3.4.1.1取白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35℃培養(yǎng)24～48h后，1.3.4.1.2取上述培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，經(jīng)30～35℃培養(yǎng)24～48h（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）觀察結(jié)果：1.3.4.1.3取上述（5.3.4.1.2）培養(yǎng)物接種至白色念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，經(jīng)30～35℃培養(yǎng)24～48h（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）觀察結(jié)果1.3.4取上述（5.3.4.1.3）培養(yǎng)物接種至1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗(yàn)。1.3.41.3.4.2.2芽管試驗(yàn)：挑取1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤(rùn)的平皿內(nèi)，置35～37℃1.3.4.2.3鏡檢結(jié)果：革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌芽孢為1.3.51.3.51.3.61.3.6.1取銅綠假單胞菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35℃1.3.6.1.1取上述培養(yǎng)物接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～1.3.6.21.3.61.3.61.3.6.3氧化酶取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻璃棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均判供試品未檢出銅綠假單孢菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠儂菌素試驗(yàn)。1.3.6.4綠儂菌素(Pyocyanin)試驗(yàn)取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，加三氯甲烷3~5ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸試液約1ml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠儂菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。同時(shí)用未接種的PDF瓊脂培養(yǎng)基斜面同法做陰性對(duì)照，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠儂菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，判斷供試品檢出銅綠假單胞菌。上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠儂菌素試驗(yàn)陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。1.3.71.3.7.1取生孢梭菌新鮮培養(yǎng)物2份，其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接后處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中。置厭氧條件下培養(yǎng)48小時(shí)。取上述每一培養(yǎng)物0.2ml，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)48~