生殖器皰疹和尖銳濕疣的檢測技術(shù)

一、生殖器皰疹朱參勝主任技師陜西省皮膚性病防治所陜西省性病中心實驗室2024/5/16單純皰疹病毒（HSV）引起單純皰疹病毒（HSV)，大小：150-200nm；DNA病毒；20面核衣殼；胞膜；衣殼蛋白感染生殖器、肛門復(fù)發(fā)，無徹底治愈的方法具有嗜感覺神經(jīng)節(jié)，形成潛伏感染狀態(tài)檢測方法：細(xì)胞培養(yǎng)、核酸檢測、直接免疫熒光、型特異性血清型抗體檢測法2024/5/162024/5/16胞膜糖蛋白：HSV有10-11種特異性糖蛋白抗原是細(xì)胞和體液免疫的主要靶標(biāo)也是預(yù)防和治療HSV感染的亞單位疫苗或DNA疫苗的候選基因gB,gC,gD,gE,gF,gG,gH,gI,gJ,gL,gM其中g(shù)G是型特異性糖蛋白，具有型特異性抗原決定簇，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體HSV抗原型：HSV1和HSV22024/5/162024/5/162024/5/16HSV-2引起的生殖器和口腔皰疹2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝2024/5/162024/5/16HSV-1和HSV-2同源性高達(dá)50％感染方式與臨床表現(xiàn)不同?HSV-1：主要上半身皮膚和粘膜（口唇、咽、眼等）皰疹，嚴(yán)重者皰疹性腦炎，STI達(dá)10-40%；?HSV-2：主要生殖器感染（80％），偶可發(fā)生口腔及其周圍感染。?HSV-1復(fù)發(fā)少，HSV-2復(fù)發(fā)高HSV感染的臨床表現(xiàn)一、皰疹：10-20%1.初發(fā)皰疹：原發(fā)：無病史且HSV1/2抗體陰性非原發(fā)：一種抗體陽性，而引起皰疹病毒型抗體陰性。原發(fā)與非原發(fā)臨床不能區(qū)別，必須實驗室鑒別。第一次癥狀（復(fù)發(fā)）：血清學(xué)陽性但以前未出現(xiàn)皰疹2.復(fù)發(fā)皰疹：有典型病史，HSV2較1復(fù)發(fā)率高，男比女高二、潛伏感染：80-90％HSV感染2013.8HSV傳播途經(jīng)來自無癥狀的排毒者（最常見）70％HSV2感染來自性伴無癥狀排毒期。通常有癥狀期性活動較少。多數(shù)病例否認(rèn)與感染者接觸的病史。與傳染性潰瘍接觸（排毒達(dá)高峰，傳染性最強(qiáng)）母嬰傳播：分3個階段子宮內(nèi)：經(jīng)胎盤或?qū)m頸上行感染，導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)、流產(chǎn)、畸形、死亡。圍產(chǎn)期：占85％，經(jīng)產(chǎn)道40-60％機(jī)會被感染出生后：接觸外部HSV傳染源，如母親口腔感染等。2013.8HSV感染后潛伏活動導(dǎo)致長期持續(xù)感染新生兒皰疹發(fā)病率和死亡率嚴(yán)重HIV感染協(xié)同因素80-90％HSV感染為潛伏感染2013.8基本原理：HSV在細(xì)胞內(nèi)寄生—體外細(xì)胞培養(yǎng)—特征細(xì)胞改變觀察。標(biāo)本采集：皰液：抽取或棉簽吸取后洗脫。潰瘍組織液：干拭子去除污物，棉簽吸取后洗脫。子宮頸分泌物：拭去黏液后，用另一棉拭子插入子宮頸，捻轉(zhuǎn)取樣。儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞（Hela細(xì)胞），RPMI1640，小牛血清等。（一）細(xì)胞培養(yǎng)法2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝操作步驟：單層細(xì)胞制備：24孔板培養(yǎng)，長成單層細(xì)胞備用（常用細(xì)胞株為Vero,Hela,BHK)標(biāo)本接種：接種0.2ml，培養(yǎng)3~7日CPE(cytopathiceffect)觀察：接種后，每日觀察病毒傳代：至少50%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，收集培養(yǎng)物，再次接種至新鮮細(xì)胞中。鑒定和分型：50%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，收集感染細(xì)胞和培養(yǎng)物，離心后，沉淀用免疫熒光或酶免試驗鑒定。2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝結(jié)果判讀：觀察CPE:連續(xù)7日觀察，細(xì)胞一般在2~4日出現(xiàn)病變，變圓，腫脹和氣球樣變，可見融合細(xì)胞和多核巨細(xì)胞，初步判定HSV陽性。用免疫熒光法對HSV進(jìn)一步鑒定和分型。結(jié)果報告：出現(xiàn)CPE:“單純皰疹病毒分離可疑”鑒定后：“單純皰疹病毒I型（II型）生長”臨床意義：細(xì)胞培養(yǎng)法是“金標(biāo)準(zhǔn)”用免疫熒光法對HSV進(jìn)一步鑒定和分型2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝注意事項:選擇敏感細(xì)胞系，且細(xì)胞應(yīng)為活力強(qiáng)的幼齡細(xì)胞取材時不用消毒劑和潤滑劑盡量取水泡液或膿皰液進(jìn)行接種培養(yǎng)取材后盡快接種，24h不能接種，存放于-70℃其他皰疹病毒如水痘，帶狀皰疹病毒感染也可以引起類似的CPE，因此需要進(jìn)一步鑒定2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝HeLa細(xì)胞株是由正常子宮頸細(xì)胞被一種人類乳突狀瘤病毒（HumanPapillomavirus18或HPV18）轉(zhuǎn)型成癌細(xì)胞的，而且和正常子宮頸細(xì)胞有許多不同。2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝Hela細(xì)胞感染HSV-2:A正常細(xì)胞；B:HSV-2感染細(xì)胞。2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝（二）直接免疫熒光抗原檢測基本原理：HSV抗體(標(biāo)記FITC)→標(biāo)本HSV→熒光顯微鏡觀察標(biāo)本采集：細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本：收集細(xì)胞培養(yǎng)陽性標(biāo)本，可作細(xì)胞爬片。病損標(biāo)本：收集病損部位基底部細(xì)胞儀器設(shè)備：熒光顯微鏡；HSV(I/II)mAb;PBS溶液操作步驟：固定：冷丙酮（-20℃）或甲醇固定標(biāo)本10min洗滌：PBS洗3次，或自然干燥染色：雙份標(biāo)本中滴加HSV-1和HSV-2熒光抗體工作液，37℃濕盒30min洗滌：PBS,雙蒸水封片鏡檢：90%甘油+10%PBS2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝結(jié)果判讀：陽性、陰性對照結(jié)果正常陽性標(biāo)本為亮綠色熒光結(jié)果報告：陽性：見到上述熒光陰性：未見到上述熒光臨床意義：一般用于HSV分離培養(yǎng)陽性標(biāo)本的鑒定和分型注意事項:每批試驗均設(shè)置對照高質(zhì)量熒光顯微鏡和技術(shù)熟練操作人員取材是應(yīng)避免出血，以免影響結(jié)果判斷直接皮損標(biāo)本：容易脫片2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝HCEinoculatedwithahighviralloadclinicalspecimenpositiveforHSV-1.Notethepresenceofmanyinfectedcellsshowingapplegreenfluorescence.Indirectimmunofluorescenceassay,×125.Athmanathanetal.

BMCOphthalmology20022:3

2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝（三）抗原ELISA法基本原理：抗HSV單克隆抗體包被→標(biāo)本HSV抗原→酶標(biāo)記抗體，底物顯色。標(biāo)本采集：同細(xì)胞培養(yǎng)法操作步驟：加樣：對照和樣品，孵育加酶結(jié)合物：洗板后，加入酶結(jié)合物，孵育顯色：終止：2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝結(jié)果判讀：陽性、陰性對照在規(guī)定范圍根據(jù)要求計算設(shè)定閾值結(jié)果報告：陽性陰性臨床意義：臨床上常用的檢測抗原的方法注意事項:采用部位正確，盡可能多采樣不同批號試劑禁止混用2013.8陜西省皮膚性病防治所朱參勝（四）抗體檢測ELISA:檢測原理：將型特異性HSV抗原gG包被在酶標(biāo)板微孔中俘獲血清中的HSV抗體，形成抗原抗體復(fù)合物再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人抗體結(jié)合，加入酶底物顯色酶標(biāo)儀比色定量血清中HSV抗體含量。器材：酶標(biāo)儀，洗板機(jī)、恒溫水浴箱、型特異HSV-ELISA試劑盒。檢測流程：試劑準(zhǔn)備（平衡，混勻，稀釋，陰性，陽性對照設(shè)置；加入標(biāo)本；溫育；洗版；加酶標(biāo)記物；洗板；顯色；終止；讀板。結(jié)果判讀及報告：陽性、陰性對照應(yīng)在要求范圍；臨界值確定。陽性、陰性判定。CIA:(省略）2024/5/16HSV型特異性抗體檢測的臨床意義HSV感染診斷：首次感染93％IgM陽性，復(fù)發(fā)感染13％以下，IgG↑HSV分型診斷：HSV1和HSV2感染的嚴(yán)重程度和預(yù)后存在差異，為預(yù)后提供參考依據(jù)。原發(fā)與復(fù)發(fā)皰疹類型的鑒別檢出隱性感染：80-90%無癥狀感染，減少性與母嬰傳播2024/5/16感染者性伴的HSV感染狀況的判斷：80%以上的患者渴望了解自身和伴侶的HSV感染的血清型，并且獲知結(jié)果后對治療方案的依從性增加79%。HSV感染的血清流行病學(xué)調(diào)查：為衛(wèi)生監(jiān)管部門提供更加有效、可靠的HSV的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。用于性病門診（診斷與高危人群篩查）生殖醫(yī)學(xué)門診(提高IVF的成功率)婦產(chǎn)科門診(孕前和產(chǎn)前篩查，減少新生兒皰疹感染)器官移植科（檢測HSV感染）2024/5/16（五）核酸檢測目的基因：目前均選擇高保守序列區(qū)，主要集中在DNA聚合酶基因區(qū)、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因區(qū)、糖蛋白基因區(qū)。原理：一對單純皰疹病毒型特異性引物一條單純皰疹病毒型特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、Taq酶、dNTPs,用PCR體外擴(kuò)增法檢測單純皰疹病毒DNA臨床意義：鑒別診斷潰瘍或生殖器皰疹的患者，區(qū)分I和II型HSV病毒；對腦組織、腦脊液測定有優(yōu)勢。2024/5/16（六）檢測方法評價急性期感染確診：培養(yǎng)法：金標(biāo)準(zhǔn)，試驗條件，人員素質(zhì)要求高。免疫學(xué)方法：區(qū)分型別。核酸檢測：敏感性最高，SFDA認(rèn)可的試劑；HSV感染篩查，無癥狀感染者檢查：血清抗體檢測（ELISA/CIA)：婦產(chǎn)科、性病門診廣泛使用，說明以前感染過HSV，IgM近期感染。2024/5/16二、尖銳濕疣尖銳濕疣：(CondylomaAcuminatum,CA)，又稱生殖器疣，是由人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)引起，主要通過性傳播、在肛門及外生殖器所致的表皮瘤樣增生的一種STD。HPV：人類乳突病毒（HumanPapillomavirus，）是一種分子較?。ㄖ睆?5nm）的DNA病毒。已知的人類乳突病毒有一百多種基因型，其中有三十余種會感染人類生殖器官的皮膚及黏膜，造成各種疾病。主要類型為HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，其中HPV16和18型長期感染可能與女性宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。2024/5/16病毒DNA：8000個堿基對非編碼上游調(diào)節(jié)（LCR）,早期ORF(E1--E7)；晚期ORF(L1和L2)分型：按E6,E7,L1的ORF，DNA序列同源性小于90%HPV的致病性:引起細(xì)胞良性增生：扁平疣、尋常疣、尖銳濕疣誘導(dǎo)細(xì)胞永生化和轉(zhuǎn)化:宮頸癌、肛門癌檢測方法：HPV核酸檢測和組織病理檢測。2024/5/16根據(jù)HPV引起細(xì)胞病理變化的不同，分為高危型和低危型高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68低危型：6、11、42、43、442024/5/16HPV傳播途徑

性接觸傳播：HPV的主要感染方式，相同的HPV亞型可以在性伴侶中檢出。直接接觸：皮膚直接接觸也是傳播方式母嬰傳播：母親生殖道HPV感染也可以傳給嬰兒2024/5/16癥狀和體征HPV感染后，潛伏期3周～8個月，平均3個月。男性：多見于冠狀溝、包皮、系帶、龜頭和肛周，其次是尿道口、陰莖體和陰囊；女性：多見于大小陰唇、后聯(lián)合、陰蒂、宮頸、陰道壁和肛周。其它：腋下、腹股溝、乳房下和口腔內(nèi)2024/5/16特征初發(fā)為淡紅、褐色細(xì)小丘疹，針頭至綠豆大小。以后突起，逐漸增大增多并擴(kuò)散蔓延，表面粗糙。疣體：丘疹型、乳頭型、菜花型、雞冠型和巨大型CA。一般無感覺，部分有異物、癢或壓迫感，或因磨擦而破潰、糜爛，性交易出血。女性患者常伴陰道炎。鑒別診斷：假性濕疣（陰莖珍珠狀丘疹，絨毛狀小陰唇），扁平濕疣、鮑溫樣丘疹病和鱗狀細(xì)胞癌。2024/5/162024/5/16部位：外生殖器或肛門皮損特點：疣狀、菜花狀贅生物2024/5/162024/5/16醋酸白試驗：用5%醋酸溶液涂抹皮損處，3～5min后皮損表面變白，輔助性診斷。實時熒光PCR技術(shù)基本原理：兩類引物：通用引物針對L1的保守區(qū)，可以擴(kuò)增所有性病相關(guān)HPV-DNA；另一類特異的引物和探針。探針：標(biāo)記不同熒光的型特異性探針；5’端R基團(tuán)和3’端Q基團(tuán)；反應(yīng)前探針完整，無熒光；反應(yīng)后，R基團(tuán)和Q基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光；每完成一次擴(kuò)增，就形成一個熒光分子自動熒光檢測儀測定儀器設(shè)備：熒光PCR儀；恒溫水?。桓咚匐x心機(jī)；試劑盒；標(biāo)本采集：宮頸分泌物陰道分泌物男性尿道分泌物組織表面標(biāo)本2024/5/16標(biāo)本的采集

標(biāo)本取材部位：宮頸，外陰，包皮龜頭等標(biāo)本類型：贅生物、丘疹、無癥狀等采集方法：贅生物用鈍刀或拭子刮取組織細(xì)胞宮頸拭子直腸拭子的取材2024/5/16操作步驟：分泌物和刮取物標(biāo)本的處理：充分振蕩，洗脫至1ml生理鹽水中，12000rpm離心5分鐘，棄上清；新鮮組織需勻漿；石蠟包埋組織：切片，脫蠟、乙醇洗滌干燥，提取。DNA提?。杭尤隓NA提取液，煮沸10min，離心上清液為模版；加樣：PCR反應(yīng)管加入陽性、陰性對照，樣品PCR擴(kuò)增：將反應(yīng)管放入PCR儀，設(shè)置名稱，反應(yīng)條件，熒光種類，并開始運(yùn)行儀器。2024/5/16結(jié)果判讀及報告：實驗有效性判斷，陰性不是S型曲線，陽性為S型曲線，CT=給定值或參考范圍。根據(jù)CT值，確定陰性，陽性，可疑。臨床意義：很高的敏感性和特異性，HPV檢測較為可靠的方法大量人群感染HPV不發(fā)病，用于尖銳濕疣時，結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)史綜合分析不典型癥狀確診尖銳濕疣療效判定注意事項：分區(qū)進(jìn)行檢測β-球蛋白基因評價標(biāo)本是否合格陰性不排除其他型別HPV感染（100種）2024/5/16核酸雜交技術(shù)HPV基因直接雜交：原位雜交、斑點雜交、southern轉(zhuǎn)移雜交；擴(kuò)增后雜交：反向膜雜交、雜交捕獲法原位雜交：細(xì)胞內(nèi)HPV病毒的檢測和定位。southern轉(zhuǎn)移雜交：電泳分離后雜交。雜交捕獲法：唯一通過FDA批準(zhǔn)，RNA探針，雜交，化學(xué)發(fā)光放大信號，檢測低危和高危HPV，不能分型。反向斑點雜交：國內(nèi)SFDA注冊批準(zhǔn)，生物素/地高辛標(biāo)記的通用引物擴(kuò)增目的基因，雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變形后與固定于硝酸纖維素上特異性探針進(jìn)行雜交，加入酶標(biāo)地高辛抗體，加入底物，顯色反應(yīng)，形成斑點，區(qū)分HPV型別。2024/5/16病理學(xué)檢查法基本原理：HPV感染—疣狀皮損—細(xì)胞結(jié)構(gòu)和排列發(fā)生改變：乳頭瘤樣增生、表皮角化不全、棘層肥厚、真皮淺層炎性細(xì)胞浸潤、表皮內(nèi)空泡化細(xì)胞等。標(biāo)本采集:手術(shù)或剪除法切去病變組織，立即放入盛有10%中性福爾馬林小瓶中固定。2024/5/16操作步驟：脫水：將固定的組織塊置入70%、80%、95%和無水乙醇中透明：置入二甲苯中浸蠟：熱石蠟注入蠟?zāi)Ｖ?，稍凝固后，放入組織塊切片裱片：將切片貼在潔凈載玻片上烤片：切片置入72℃烤箱中1~2h脫蠟：置入二甲苯中脫蠟10~15min脫水：100%、95%、80%脫水1~2min染色：蘇木素染色洗片：自來水沖洗15min分化：置入鹽酸中分化1-2min染胞質(zhì)：伊紅染色脫水：95%和無水乙醇中，各3~5min透明：二甲苯中二次封片：中性樹膠2024/5/16結(jié)果判讀細(xì)胞核深藍(lán)色，胞質(zhì)紅色，可見乳頭瘤增生，角化不全、角化過度、表皮荊棘層肥厚、基底細(xì)胞增生、真皮淺層血管擴(kuò)張，并有淋巴細(xì)胞浸潤。表皮淺層可見呈灶狀、片狀及散在分布空泡化細(xì)胞：該細(xì)胞體積大，核深染，核周圍可見不同程度的空泡化改變，輕者核周圍僅有空泡化的暈環(huán)，重者整個胞質(zhì)均發(fā)生空泡化改變，胞質(zhì)內(nèi)可有絲