(高清版)GBT 5750.12-2023 生活飲用水標準檢驗方法 第12部分：微生物指標

生活飲用水標準檢驗方法第12部分：微生物指標2023-03-17發(fā)布 I Ⅱ 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 14菌落總數(shù) 25總大腸菌群 96耐熱大腸菌群 7大腸埃希氏菌 8賈第鞭毛蟲 9隱孢子蟲 10腸球菌 11產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌 I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是GB/T5750《生活飲用水標準檢驗方法》的第12部分。GB/T5750已經(jīng)發(fā)布了以下——第1部分：總則；——第2部分：水樣的采集與保存；——第3部分：水質(zhì)分析質(zhì)量控制；——第4部分：感官性狀和物理指標；——第5部分：無機非金屬指標；——第6部分：金屬和類金屬指標；——第7部分：有機物綜合指標；——第8部分：有機物指標；——第9部分：農(nóng)藥指標；——第10部分：消毒副產(chǎn)物指標；——第11部分：消毒劑指標；——第12部分：微生物指標；——第13部分：放射性指標。本文件代替GB/T5750.12—2006《生活飲用水標準檢驗方法微生物指標》,與GB/T5750.12—2006相比，除結構調(diào)整和編輯性改動外，主要技術變化如下：請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會提出并歸口。本文件起草單位：中國疾病預防控制中心環(huán)境與健康相關產(chǎn)品安全所、中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心、吉林省疾病預防控制中心、北京市科學技術研究院分析測試研究所。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——1985年首次發(fā)布為GB/T5750—1985,2006年第一次修訂為GB/T5750.12—2006;——本次為第二次修訂。ⅡGB/T5750《生活飲用水標準檢驗方法》作為生活飲用水檢驗技術的推薦性國家標準，與GB5749《生活飲用水衛(wèi)生標準》配套，是GB5749的重要技術支撐，為貫徹實施GB5749、開展生活飲用水衛(wèi)生安全性評價提供檢驗方法。GB/T5750由13個部分構成?！?部分：總則。目的在于提供水質(zhì)檢驗的基本原則和要求?！?部分：水樣的采集與保存。目的在于提供水樣采集、保存、管理、運輸和采樣質(zhì)量控制的基——第3部分：水質(zhì)分析質(zhì)量控制。目的在于提供水質(zhì)檢驗檢測實驗室質(zhì)量控制要求與方法?！?部分：感官性狀和物理指標。目的在于提供感官性狀和物理指標的相應檢驗方法?！?部分：無機非金屬指標。目的在于提供無機非金屬指標的相應檢驗方法?！?部分：金屬和類金屬指標。目的在于提供金屬和類金屬指標的相應檢驗方法?！?部分：有機物綜合指標。目的在于提供有機物綜合指標的相應檢驗方法。——第8部分：有機物指標。目的在于提供有機物指標的相應檢驗方法?！?部分：農(nóng)藥指標。目的在于提供農(nóng)藥指標的相應檢驗方法?！?0部分：消毒副產(chǎn)物指標。目的在于提供消毒副產(chǎn)物指標的相應檢驗方法?！?1部分：消毒劑指標。目的在于提供消毒劑指標的相應檢驗方法?！?2部分：微生物指標。目的在于提供微生物指標的相應檢驗方法?！?3部分：放射性指標。目的在于提供放射性指標的相應檢驗方法。1生活飲用水標準檢驗方法第12部分：微生物指標1范圍本文件描述了生活飲用水和水源水中菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌、賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的測定方法。本文件適用于生活飲用水和水源水中微生物指標的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。菌落總數(shù)standardplate-countbacteria在一定條件下，經(jīng)一定時間培養(yǎng)后所得1mL水樣中的微生物菌落個數(shù)?？偞竽c菌群totalcoliforms一群在37℃培養(yǎng)，24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。耐熱大腸菌群thermotolerantcoliformbacteria一群在44.5℃培養(yǎng)，24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸埃希氏菌Escherichiacoli一群能發(fā)酵多種糖類、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、周身鞭毛、能運動、無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌，通常存在于人和溫血動物的腸道以及糞便中。賈第鞭毛蟲Giardia一種可在水中或其他介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的原蟲類寄生蟲，可感染人類致病。注：賈第鞭毛蟲孢囊呈橢圓形，長度為8μm～14μm,寬度為7μm～10μm,孢囊形成初期內(nèi)部有2個細胞核，成熟后增加至4個細胞核。2一種可在水中或其他介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的原蟲類寄生蟲，可感染人類致病。注：隱孢子蟲卵囊為稍微橢圓的圓形，直徑4μm～8μm,成熟卵囊內(nèi)部有4個細胞核。一類成雙或呈鏈狀排列、兼性厭氧、無芽孢和莢膜的革蘭氏陽性球菌，屬D族鏈球菌，通常存在于人和溫血動物的腸道以及糞便中。產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌Clostridiumperfringens最可能數(shù)mostprobablenumber;MPN基于泊松分布，利用統(tǒng)計學原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標微生物陽性數(shù)，估算一定體積樣品中目標微生物存在的數(shù)量，即單位體積存在目標微生物的最大可能數(shù)。4菌落總數(shù)4.1平皿計數(shù)法1mL水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上、在有氧條件下36℃±1℃培養(yǎng)48h后，所得1mL水樣中的菌落總數(shù)的方法。4.1.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按如下成分配制：a)蛋白胨10.0ge)純水1000mL將上述成分混合后，加熱溶解，調(diào)整pH為7.4～7.6,分裝于玻璃容器中，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min,0℃~4℃冷藏保存。4.1.3.2培養(yǎng)箱：36℃±1℃。34.1.3.6放大鏡或菌落計數(shù)器。4.1.3.8無菌試管、平皿(直徑為9cm)、4.1.4.1.1以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1mL充分混勻的水樣，注入無菌平皿中，傾注約15mL已融化并冷卻到45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。每次檢驗時應做一平行接種，同時另用一個平皿只傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對照。4.1.4.1.2待冷卻凝固后，翻轉平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h,進行菌落計數(shù)，即為1mL水樣中的菌落總數(shù)。4.1.4.2.1以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1mL充分混勻的水樣，注入盛有9mL無菌生理鹽水的試管中，混勻成1:10稀釋液。用無菌吸管或移液器吸取1:10的稀釋液1mL注入盛有9mL無菌生理鹽水的試管中，混勻成1:100稀釋液。按同法依次稀釋成1:1000、1:10000等稀釋度的液體備用。每稀釋一個稀釋度，應更換一次1mL無菌吸管或吸頭。4.1.4.2.3用無菌吸管或移液器吸取2個～3個適宜稀釋度的水樣1mL,分別注入無菌平皿內(nèi)。以下操作同生活飲用水的檢驗步驟。4.1.5試驗數(shù)據(jù)處理做平皿菌落計數(shù)時，可用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落數(shù)后，應求出同稀釋度的平均菌落數(shù)，供下一步計算時使用。在求同稀釋度的平均數(shù)時，若其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半皿計數(shù)后乘2以代表全皿菌落數(shù)。然后再求得該稀釋度的平均菌落數(shù)。4.1.5.2不同稀釋度的選擇及報告方法4.1.5.2.1選擇平均菌落數(shù)在30～300之間者進行計算，若只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍，則將該菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告結果(見表1中實例1)。4.1.5.2.2若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30～300之間，則視兩者之比值來決定，若其比值小于2,應報告兩者的平均數(shù)(如表1中實例2)。若大于或等于2,則報告其中稀釋度較小的菌落總數(shù)(如表1中實例3和實例4)。4.1.5.2.3若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300,則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告結果(見表1中實例5)。4.1.5.2.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30,則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告結果(見表1中實例6)。4.1.5.2.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，則應以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告結果(見表1中實例7)。4.1.5.2.6若所有稀釋度的平板上均無菌落生長，則以未檢出報告結果。44.1.5.2.7如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可計”報告，而應在稀釋度最大的平板上，任意計數(shù)其中2個平板1cm2中的菌落數(shù)，除2求出每平方厘米內(nèi)平均菌落數(shù)，乘以皿底面積63.6cm2,再乘其稀釋倍數(shù)報告結果。4.1.5.2.8菌落計數(shù)的報告：菌落數(shù)在100以內(nèi)時按實有數(shù)報告，大于100時，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算，為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù)也可用10的指數(shù)來表示(見表1)。表1稀釋度選擇及菌落總數(shù)報告方式實例不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)/報告方式/1——16000或1.6×10?238000或3.8×10?327000或2.7×10?4821500或1.5×1035多不可計510000或5.1×10?65270或2.7×1027多不可計——31000或3.1×10?4.2酶底物法利用復合酶技術，在培養(yǎng)基中加入多種獨特的酶底物，每一種酶底物都針對不同的細菌酶設計，且包含最常見的介水傳播的細菌，所有的酶底物在被分解時均產(chǎn)生相同的信號。水樣檢測過程中，水樣中存在的細菌分解一種或者多種酶底物，之后產(chǎn)生一個相同的信號，在檢測菌落總數(shù)時，這個信號即為在波長366nm紫外燈下所產(chǎn)生的熒光。使用基于復合酶底物技術(MultipleEnzymeTechnology)的培養(yǎng)基，其中酶底物被微生物的酶水解，在36℃±1℃下培養(yǎng)48h后能夠最大限度地釋放4-甲基傘形酮，4-甲基傘形酮在366nm紫外燈照射下發(fā)出藍色熒光，對呈現(xiàn)藍色熒光的培養(yǎng)盤孔槽計數(shù)并查閱MPN表，可以確定原始水樣中最可能的菌落總數(shù)。本方法未稀釋水樣的檢測范圍為<738MPN/mL。4.2.2培養(yǎng)基與試劑可根據(jù)如下成分配制，也可選用符合質(zhì)控要求的制品：a)葡萄糖1.25gd)酵母提取物3.5ge)4-甲基傘形酮磷酸酯0.0375g5將上述成分溶解于純水中，調(diào)整pH為6.7～7.3,經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。制備好的培養(yǎng)基于2℃~8℃條件下保存?zhèn)溆?。按如下成分配制：b)純水1000ml充分溶解后，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min。4.2.3.1采樣容器：100mL無菌玻璃瓶、無菌塑料瓶或無菌塑料袋。4.2.3.4高壓蒸汽滅菌器。4.2.3.9培養(yǎng)盤：定量培養(yǎng)用無菌塑料盤，含有84個孔槽，每個孔槽容納0.06mL待測水樣。檢測所需水樣為1mL。若水樣污染嚴重，可對水樣進行稀釋。以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1mL充分混勻的水樣，注入盛有9mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩混勻后取1mL進行檢測，必要時可加大稀釋度，以10倍逐級稀釋。向一無菌試管中加入9mL制備好的液體培養(yǎng)基；如選用符合要求的成品培養(yǎng)基，則向裝有0.1g培養(yǎng)基的試管中加入9mL無菌生理鹽水。取1mL水樣加入上述試管中，渦旋振蕩混勻。將混勻后的水樣倒入培養(yǎng)盤中心位置，將培養(yǎng)盤蓋好，放置在水平桌面上，緊貼桌面順時針輕柔晃動培養(yǎng)盤，將待測水樣分配到培養(yǎng)盤的所有孔槽中。將培養(yǎng)盤90°~120°豎起，使多余的水樣由盤內(nèi)海綿條吸收，將培養(yǎng)盤緩慢翻轉過來，倒置放于36℃±1℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h?？莎B放培養(yǎng)，不宜超過10層。6將培養(yǎng)后的培養(yǎng)盤取出，倒置于暗處或紫外燈箱內(nèi)，在6W366nm紫外燈下約13cm處觀察，記錄產(chǎn)生藍色熒光的孔數(shù)。如未放置在紫外燈箱內(nèi)，觀察時需佩戴防紫外線的護目鏡。培養(yǎng)盤中的84個孔，無論熒光強弱，只要呈現(xiàn)藍色熒光即為陽性，但海綿條的熒光不計入結果。根據(jù)顯藍色熒光的孔數(shù)，對照表2查出孔數(shù)對應的每毫升樣品中的菌落總數(shù)的MPN值。如果樣品進行了稀釋，讀取的結果應乘以稀釋倍數(shù)并報告之，結果以MPN/mL表示。如果所有孔均未顯熒光，則可報告為菌落總數(shù)未檢出。表2菌落總數(shù)MPN表陽性孔數(shù)菌落總數(shù)/(MPN/mL)95%置信區(qū)間下限上限0122413624835466778897陽性孔數(shù)菌落總數(shù)/(MPN/mL)下限上限8陽性孔數(shù)菌落總數(shù)/(MPN/mL)95%置信區(qū)間下限上限4074254444664914144404704324764.2.5.2不同稀釋度的選擇及報告方法選擇菌落總數(shù)在<738MPN/mL范圍內(nèi)的稀釋度，如果只有一個稀釋度的結果符合此范圍，則將結果乘以稀釋倍數(shù)報告結果。9若有兩個或兩個以上稀釋度的結果均落在<738MPN/mL范圍內(nèi)，則選擇稀釋度最小的結果乘以稀釋倍數(shù)報告結果。若所有稀釋度的培養(yǎng)盤上均無藍色熒光，則以未檢出報告結果。每新購或新配制一批培養(yǎng)基，都應做陽性對照，可選用有證的菌落總數(shù)質(zhì)控標樣，按其標準證書要求配制標準樣品。接種培養(yǎng)步驟應符合4.2.4.2的要求，按照4.2.4.3進行結果計數(shù)，試驗數(shù)據(jù)處理應符合4.2.5的要求。計數(shù)結果與標樣的標準值相比，生長率應≥0.7。每新購或新配制一批培養(yǎng)基，都應做陰性對照，用1mL無菌水代替實際水樣。接種培養(yǎng)步驟應符合4.2.4.2的要求，結果計數(shù)應符合4.2.4.3的要求，試驗數(shù)據(jù)處理應符合4.2.5的要求。如無熒光產(chǎn)生則為陰性。5總大腸菌群5.1多管發(fā)酵法經(jīng)36℃士1℃培養(yǎng)24h,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、經(jīng)證實試驗和革蘭氏染色檢測水中總大腸菌群的5.1.2培養(yǎng)基與試劑按如下成分配制：e)溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L)1mLf)純水1000mL將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于純水中，調(diào)整pH為7.2～7.4,再加入1mL16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝于裝有小倒管的試管中，經(jīng)115℃高壓蒸汽滅菌20min后，于0℃~4℃冷藏避光保存。5.1.2.2二倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液除純水為500mL,其他成分應符合5.1.2.1的要求。按如下成分配制：e)純水100f)伊紅水溶液(20.0g/L)滅菌20min。臨用時加熱融化瓊脂，冷至50℃~55℃,加入伊紅和美藍水溶液，混勻，傾注平皿。按如下成分配制：a)結晶紫b)乙醇[g(C?H?OH)=95%]將結晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。注：結晶紫不可用龍膽紫代替，前者是純品，后者不是單一成分，易出現(xiàn)假陽性。結晶紫溶液放置過久會產(chǎn)生沉淀，不能再用。按如下成分配制：c)純水300mL按如下成分配制：a)沙黃0.25gc)純水90mL將沙黃加入乙醇中，待完全溶解后加入純水。5.1.2.4.5.1將培養(yǎng)18h～24h的培養(yǎng)物涂片。5.1.2.4.5.2將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液5.1.3.1培養(yǎng)箱：36℃±1℃。5.1.3.4顯微鏡。5.1.3.8錐形瓶。5.1.3.9小倒管。5.1.4.1.1用無菌吸管或移液器吸取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1mL水樣注入到9mL無菌生理鹽水中，混勻后取1mL(即0.1mL水樣)注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種5管；對已處理過的出廠自來水，需經(jīng)常檢驗或每天檢驗一次的，可直接接種5份10mL水樣雙料培養(yǎng)基，每份接種10mL水樣。5.1.4.1.2檢驗水源水時，如污染較0.01mL、0.001mL,每個稀釋度接種5管單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，每個水樣共接種15管。接種1mL以下水樣時，應作10倍遞增稀釋后，取1mL接種，每遞增稀釋一次，換用1支1mL無菌吸管。5.1.4.1.3將接種管置于36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24h±2h,如所有乳糖蛋白胨培養(yǎng)管都不產(chǎn)氣產(chǎn)酸，則可報告為總大腸菌群未檢出，如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則按下列步驟進行。將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，于36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18h～24h,觀察菌落形態(tài)，挑取符合下列特征的菌落進行革蘭氏染色鏡檢：——深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；——紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；——淡紫紅色、中心較深的菌落。經(jīng)上述染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，同時接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，置36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h,有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實有總大腸菌群存在。5.1.5試驗數(shù)據(jù)處理根據(jù)證實為總大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN表(見表3和表4),報告每100mL水樣中的總大腸菌群MPN值。稀釋樣品查表后所得結果應乘稀釋倍數(shù)。如所有乳糖發(fā)酵管均為陰性時，可報告總大腸菌群未檢出。表3總大腸菌群5管法MPN表5個10mL管中陽性管數(shù)012345表4總大腸菌群15管法MPN表接種量/mL總大腸菌群/總大腸菌群/110000000000000123452457900000022222201234546790000001101234524679000000333333012345679表4總大腸菌群15管法MPN表(續(xù))總大腸菌群/接種量/mL總大腸菌群/11000000444440123458911111144444401234500000055555501234591111115555550123451111000000012345246822222200000001234557911101234546822222211012345791222222012345682222222222220234591113333330123458222222333333012345表4總大腸菌群15管法MPN表(續(xù))總大腸菌群/總大腸菌群/112222224444440123453333334444440123452222225555550123453333335555550123453333330000000123458444444000000012345333333101234544444411110123453333332222220234544444422222202345333333333333012345444444333333012345表4總大腸菌群15管法MPN表(續(xù))總大腸菌群/接種量/mL總大腸菌群/11444444444444012345555555222222012345444445555550123455555553333330123455555550000000123455555554444440123455555551111012345555555555555012345注：總接種量55.5mL,其中5份10mL水樣，5份1mL水樣，5份0.1mL水樣。用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾水樣后，將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，能形成典型菌落，經(jīng)革蘭氏染色和證實試驗，來檢測水中總大腸菌群的方法。5.2.2培養(yǎng)基與試劑5.2.2.1品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基按如下成分配制：a)蛋白胨10.0gh)堿性品紅乙醇[g(C?H?OH)=95%]溶液(50.0g/L)20mLi)純水1000mL先將瓊脂加到500mL純水中，煮沸溶解，于另500mL純水中加入磷酸氫二鉀、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，補足純水至1000mL,混勻后調(diào)pH為7.2～7.4,再加入乳糖，分裝，經(jīng)115℃高壓蒸汽滅菌20min后，于0℃~4℃冷藏保存。本培養(yǎng)基也可不加瓊脂，制成液體培養(yǎng)基，使用時加2mL～3mL于滅菌吸收墊上，再將濾膜置于墊上培養(yǎng)。將上法制備的儲備培養(yǎng)基加熱融化，用無菌吸管或移液器按比例吸取一定量的50.0g/L的堿性品紅乙醇溶液置于無菌空試管中，再按比例稱取所需的無水亞硫酸鈉置于另一無菌試管中，加無菌水少許，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以滅菌。吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉色為止，將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加到已融化的儲備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻(防止產(chǎn)生氣泡),立即將此種培養(yǎng)基15mL傾入無菌的空平皿內(nèi)。待冷卻凝固后置冰箱內(nèi)備用。此種已制成的培養(yǎng)基于0℃~4℃冷藏保存不宜超過兩周。如培養(yǎng)基已由淡粉色變成深紅色，則不能再用。應符合5.1.2.1的要求。5.2.3儀器設備5.2.3.1過濾設備：配備濾器和抽濾裝置。5.2.3.3無齒鑷子。5.2.3.4其他儀器設備應符合5.1.3的要求。5.2.4試驗步驟5.2.4.1準備工作5.2.4.1.1濾膜滅菌：將濾膜放入燒杯中，加入純水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需更換純水洗滌2次～3次，以除去殘留溶劑?；蚴褂梅弦蟮囊淮涡詿o菌濾膜。5.2.4.1.2濾器滅菌：用點燃的酒精棉球火焰滅菌。也可用高壓蒸汽滅菌器121℃高壓蒸汽滅菌5.2.4.2過濾水樣用鑷子夾取無菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水樣(如水樣含菌數(shù)較多，可減少過濾水樣量，或將水樣稀釋)注入濾器中，打開濾器閥門，在一5.07×10?Pa(一0.5大氣壓)下抽濾。過濾完水樣后，再抽氣約5s,關上濾器閥門，取下濾器，用鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不應留有氣泡，然后將平皿倒置，放入36℃±1℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h±2h。5.2.5試驗數(shù)據(jù)處理5.2.5.1挑取紫紅色且具有金屬光澤的菌落、深紅色不帶或略帶金屬光澤的菌落和淡紅中心色較深的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。5.2.5.2凡革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則判定為總大腸菌群陽性。5.2.5.3按公式(1)計算濾膜上生長的總大腸菌群數(shù)，以每100mL水樣中的總大腸菌群菌落數(shù)5.3酶底物法總大腸菌群在選擇性培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),通過分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，以此原理來檢測水中總大腸菌群的方法。5.3.2培養(yǎng)基與試劑5.3.2.1MMO-MUG培養(yǎng)基采用MinimalMediumONPG-MUG(MMO-MUG)培養(yǎng)基，可按下述成分配制培養(yǎng)基或選用符合質(zhì)控要求的制品。每1000mLMMO-MUG培養(yǎng)基所含基本成分為：b)無水硫酸錳0.5mgc)無水硫酸鋅0.5mgd)無水硫酸鎂100mgf)氯化鈣50mgg)亞硫酸鈉40mgh)兩性霉素B(AmphotericinB)k)茄屬植物萃取物(Solanium萃取物)500mg按如下成分配制：b)純水1000mL溶解后，分裝到稀釋瓶內(nèi)，每瓶90mL,121℃高壓蒸汽滅菌20min。5.3.3.8封口機：用于51孔定量盤。檢測所需水樣為100mL。若水樣污染嚴重，可對水樣進行稀釋，取10mL水樣加入到90mL無菌將100mL水樣加入100mL無菌稀釋瓶中，加入2.7gMMO-MUG培養(yǎng)基粉末，混合均勻使之完全溶解后，放入36℃±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。5.3.4.3.1將100mL水樣加入100mL無菌稀釋瓶中，加入2.7gMMO-MUG培養(yǎng)基粉末，混合均勻使之完全溶解。5.3.4.3.2準備10支無菌試管，用無菌吸管分別從前述稀釋瓶中取10mL水樣至各試管中，放入36℃±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。5.3.4.4.1將100mL水樣加入100mL無菌稀釋瓶中，加入2.7gMMO-MUG培養(yǎng)基粉末，混搖使之完全溶解均勻。5.3.4.4.2將前述100mL水樣全部倒入51孔無菌定量盤內(nèi)，以手撫平定量盤背面，去除孔穴內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機封口。放入36℃±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。5.3.5試驗數(shù)據(jù)處理將水樣培養(yǎng)24h后進行結果判讀，如果結果為可疑陽性，可延長培養(yǎng)時間到28h進行結果判讀，超過28h之后出現(xiàn)的顏色反應不作為陽性結果。水樣經(jīng)24h培養(yǎng)之后如果顏色變成黃色，判斷為陽性反應，表示水中含有大腸菌群。水樣顏色未發(fā)生變化，判斷為陰性反應。定性反應結果以總大腸菌群檢出或未檢出報告。5.3.5.3.1將培養(yǎng)24h之后的試管取出觀察，如果試管內(nèi)水樣變成黃色則表示該試管含有總大腸菌群。計數(shù)有黃色反應的試管數(shù)，對照表5查出其代表的總大腸菌群MPN值。結果以MPN/100mL表示。如所有管均未產(chǎn)生黃色，則可報告為總大腸菌群未檢出。表5總大腸菌群10管法MPN表陽性試管數(shù)總大腸菌群/95%置信區(qū)間下限上限0010.0320.2630.694表5總大腸菌群10管法MPN表(續(xù))陽性試管數(shù)總大腸菌群/下限上限567895.3.5.4.1將培養(yǎng)24h之后的定量盤取出觀察，如果孔穴內(nèi)的水樣變成黃色則表示該孔穴中含有總大腸菌群。5.3.5.4.2計算有黃色反應的孔穴數(shù)，對照表6查出其代表的總大腸菌群MPN值。結果以MPN/100mL表示。如所有孔均未產(chǎn)生黃色，則可報告為總大腸菌群未檢出。表6總大腸菌群51孔定量盤法MPN表陽性孔數(shù)總大腸菌群/95%置信區(qū)間上限上限0012344.256784.5920.522.123.925.727.529.4表6總大腸菌群51孔定量盤法MPN表(續(xù))陽性孔數(shù)總大腸菌群/95%置信區(qū)間上限上限—6耐熱大腸菌群6.1多管發(fā)酵法經(jīng)44.5℃培養(yǎng)24h,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、經(jīng)證實試驗和革蘭氏染色檢測水中耐熱大腸菌群的方法。6.1.2培養(yǎng)基與試劑按如下成分配制：將上述成分溶解于純水中，分裝到帶有小倒管的試管中，115℃高壓蒸汽滅菌20min,最終pH為應符合5.1.2.3的要求。6.1.3.1恒溫水浴箱或恒溫培養(yǎng)箱：44.5℃±0.5℃。6.1.3.2其他儀器設備應符合5.1.3的要求。6.1.4.1自總大腸菌群乳糖發(fā)酵試驗中的陽性管(產(chǎn)酸產(chǎn)氣)中取1滴轉種于EC培養(yǎng)基中，置44.5℃±0.5℃水浴箱或隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(水浴箱的水面應高于試管中培養(yǎng)基液面),培養(yǎng)24h±2h,如所有管均不產(chǎn)氣，則可報告為未檢出，如有產(chǎn)氣者，則轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，置44.5℃±0.5℃培養(yǎng)18h～24h,凡平板上有典型菌落者，則證實為耐熱大腸菌群陽性。6.1.4.2如檢測未經(jīng)含氯消毒劑消毒的水，且只想檢測耐熱大腸菌群時，或調(diào)查水源水的耐熱大腸菌群污染時，可直接用多管發(fā)酵方法，可按照5.1.4.1的要求，接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液后直接在44.5℃士0.5℃培養(yǎng)，以下步驟按照6.1.4.1的要求進行。根據(jù)證實為耐熱大腸菌群陽性的管數(shù)，對照MPN表，報告每100mL水樣中耐熱大腸菌群的用孔徑為0.45μm的濾膜過濾水樣，細菌被阻留在膜上，將濾膜貼在添加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上，44.5℃培養(yǎng)24h能形成特征性菌落，以此來檢測水中耐熱大腸菌群的方法。本方法適用于生活飲用水及低濁度水源水中耐熱大腸菌群的測定。按如下成分配制：i)純水1000mL在1000mL純水中先加入玫紅酸(10.0g/L)的氫氧化鈉溶液[c(NaOH)=0.2mol/L]10mL,混不可高壓蒸汽滅菌。制好的培養(yǎng)基應存放于2℃~10℃,不超過96h。本培養(yǎng)基也可不加瓊脂，制成液體培養(yǎng)基，使用時加2mL～3mL于滅菌吸收墊上，再將濾膜置于墊上培養(yǎng)。6.2.3.1恒溫水浴箱或隔水式恒溫培養(yǎng)箱：44.5℃±0.5℃。6.2.3.3其他儀器設備應符合5.2.3的要求。6.2.4.1準備工作應符合5.2.4.1的要求。平皿倒置，44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。耐熱大腸菌群在此培養(yǎng)基上菌落為藍色，非耐熱大腸菌群菌落為灰色至奶油色。6.2.4.4對可疑菌落轉種EC培養(yǎng)基，44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h,如產(chǎn)氣則證實為耐熱大腸菌群。按公式(2)計算濾膜上生長的耐熱大腸菌群數(shù)，以每100mL水樣中的耐熱大腸菌群菌落數(shù)(CFU/100mL)報告結果。7大腸埃希氏菌將總大腸菌群多管發(fā)酵法在初發(fā)酵時陽性的培養(yǎng)物，接種在含有熒光底物的培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生以此來檢測水中大腸埃希氏菌的方法。按如下成分配制：a)胰蛋白胨b)乳糖c)3號膽鹽或混合膽鹽d)磷酸氫二鉀e)磷酸二氫鉀f)氯化鈉h)純水將上述成分加入純水中，充分混勻，加熱溶解，在366nm紫外燈下檢查無自發(fā)熒光后分裝于試管中，115℃高壓蒸汽滅菌20min,最終pH為6.7～7.1。7.1.4.1接種：用無菌接種環(huán)或無菌棉簽將總大腸菌群多管發(fā)酵法在初發(fā)酵時產(chǎn)酸產(chǎn)氣的試管中液體接種到EC-MUG管中。實驗室生物安全要求應依據(jù)GB19489。將培養(yǎng)后的EC-MUG管在暗處用紫外燈照射，如果有藍色熒光產(chǎn)生則表示水樣中含有大腸埃希將總大腸菌群濾膜法檢測陽性的濾膜，置于含有熒光底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此來檢測水中大腸埃希氏菌的方法。按如下成分配制：a)蛋白胨b)牛肉浸膏e)純水將上述成分加入純水中，充分混勻，加熱溶解，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15min,最終pH為6.6～7.0。在無菌操作條件下傾倒平板備用。傾倒好的平板可于0℃~4℃冷藏保存2周。7.2.3.2其他儀器設備應符合5.2.3的要求。7.2.4.1接種：在無菌操作條件下將有典型菌落生長的濾膜轉移到NA-MUG平板上，細菌截留面朝上，進行培養(yǎng)。實驗室生物安全要求應符合GB19489的要求。7.2.4.2培養(yǎng)：將已接種的NA-MUG平板于36℃±1℃培養(yǎng)4h。7.2.5試驗數(shù)據(jù)處理將培養(yǎng)后的NA-MUG平板在暗處用波長為366nm功率為6W的紫外燈照射，如果菌落邊緣或菌落背面有藍色熒光產(chǎn)生則表示該菌落為大腸埃希氏菌。記錄有藍色熒光產(chǎn)生的菌落數(shù)并報告，報告格式按總大腸菌群濾膜法的要求。7.3酶底物法大腸埃希氏菌在選擇性培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),可分解色原底物后釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，并能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase),分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此技術來檢測大腸埃希氏菌的方法。7.3.2培養(yǎng)基與試劑應符合5.3.2的要求。7.3.3.2其他儀器設備應符合5.3.3的要求。應符合5.3.4的要求。7.3.5試驗數(shù)據(jù)處理結果判讀應符合5.3.5.1的要求，對照表同總大腸菌群酶底物法中表5與表6。水樣變?yōu)辄S色同時有藍色熒光判斷為大腸埃希氏菌陽性，水樣未變黃色而有熒光產(chǎn)生不判定為大腸埃希氏菌陽性。將經(jīng)過24h培養(yǎng)顏色變成黃色的水樣，在暗處用波長為366nm的紫外燈照射，如果有藍色熒光產(chǎn)生判斷為陽性，表示水中含有大腸埃希氏菌。水樣如未產(chǎn)生藍色熒光，判斷為陰性。結果以大腸埃希氏菌檢出或未檢出報告。7.3.5.3.1將培養(yǎng)24h水樣顏色變成黃色的試管，在暗處用波長為366nm的紫外燈照射，如果有藍色熒光產(chǎn)生，則表示大腸埃希氏菌為陽性。7.3.5.3.2計算有熒光反應的試管數(shù)，對照表5查出其代表的大腸埃希氏菌MPN值。結果以MPN/100mL表示。如所有管均未產(chǎn)生熒光，則可報告大腸埃希氏菌未檢出。7.3.5.4.1將培養(yǎng)24h顏色變成黃色的水樣的定量盤在暗處用波長為366nm的紫外燈照射，如果有藍色熒光產(chǎn)生，則表示該定量盤孔穴中大腸埃希氏菌為陽性。7.3.5.4.2計算有熒光反應的孔穴數(shù)，對照表6查出其代表的大腸埃希氏菌MPN值。結果以MPN/100mL表示。如所有孔均未產(chǎn)生熒光，則可報告大腸埃希氏菌未檢出。8.1免疫磁分離熒光抗體法采用過濾和反向沖洗技術從水樣中富集賈第鞭毛蟲孢囊，借助免疫磁分離技術將賈第鞭毛蟲孢囊從其他雜質(zhì)中分離出來，再經(jīng)過酸化脫磁、異硫氰酸熒光素酯/4'6-二脒基-2-苯基吲哚(FITC/DAPI)染色，最后經(jīng)過顯微鏡檢確認和計數(shù)的方法。8.1.2培養(yǎng)基與試劑8.1.2.1磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)按如下成分配制：b)氯化鉀0.2gc)磷酸氫二鈉1.44gd)磷酸二氫鉀0.24g上述成分混合溶解于純水中后，用1mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液將pH調(diào)到7.1～7.3,于0℃~4℃冷藏保存可儲存1周。8.1.2.2賈第鞭毛蟲/隱孢子蟲免疫磁分離試劑盒所含試劑如下：a)抗隱孢子蟲單克隆抗體磁微粒；b)抗賈第鞭毛蟲單克隆抗體磁微粒；c)緩沖液A(15mL);d)緩沖液B(10mL)。免疫磁分離試劑盒，于0℃~4℃冷藏保存。8.1.2.3免疫熒光染色試劑盒抗隱孢子蟲/賈第鞭毛蟲單克隆抗體-異硫氰酸鹽熒光素試劑盒，于0℃~4℃冷藏保存。8.1.2.4封固劑(2%DABCO/甘油)按如下成分配制：a)甘油/PBS緩沖鹽溶液(60%/40%)100mL室溫條件下可儲存12個月。在1000mL純水中溶解132.2g的Tris鹽酸(C?H?ClNO?),然后再加19.4g的Tris堿(C?H?NO?)。用1mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液將pH調(diào)到7.3～7.5。用孔徑0.22μm的濾膜過濾滅菌后，移到一個無菌的塑料容器中。在室溫條件下可儲存6個月。將37.22g乙二胺四乙酸二鈉鹽二水化合物(Na?EDTA·2H?O)溶解到200mL的純水中，然后用1mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液將pH調(diào)到7.9～8.1,室溫條件下可儲存6個月。按如下成分配制：a)月桂醇聚醚-12(Laureth-12)4.0gb)Tris溶液(1mol/L)40mLc)Na?EDTA二水合物溶液(0.5mol/L)8mL稱取1.0g月桂醇聚醚-12到玻璃燒杯中，然后加100mL純水。用電爐將燒杯加熱，使月桂醇聚醚-12溶解，然后再將其轉移到1000mL有刻度的量筒中。用純水將燒杯沖洗幾次，確保所有的沖洗液都轉移到量筒中。加10mLpH為7.4的Tris溶液、2mLpH為8.0的Na?EDTA二水合物溶液和150μLA型止泡劑。最后用純水稀釋到1000mL。室溫條件下可儲存1個月。按如下成分配制：a)磷酸氫二鈉1.44gb)磷酸二氫鉀0.2ge)吐溫-200.1mL將1.44g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀及8.0g氯化鈉加入900mL純水，攪拌20min至完全溶解，加入0.1mL吐溫-20并繼續(xù)攪拌10min,然后用純水稀釋至1000mL。按如下成分配制：b)EDTA檸檬酸三鈉0.3gd)吐溫-800.1mLe)純水1000mL將0.2g焦磷酸四鈉、0.3gEDTA檸檬酸三鈉加入900mL純水，攪拌10min至完全溶解，加入10mLTris-HCl(1mol/L)并攪拌5min使之混合。再加入0.1mL吐溫-80并繼續(xù)攪拌10min,然后用純水稀釋至1000mL,并調(diào)節(jié)pH為7.2～7.6。量取0.1mol鹽酸，緩慢加入1000mL純水中，混勻后備用。8.1.2.9氫氧化鈉溶液(1mol/L)稱取1mol氫氧化鈉，加入1000mL純水中，完全溶解后備用。甲醇含量大于99.5%的分析級甲醇。在微型離心管中加入1mgDAPI,然后加入500μL的甲醇(2mg/mL)?？捎?℃~4℃冷藏避光保存15d。用50mLPBS稀釋10μLDAPI母液，用時配制，于0℃~4℃冷藏避光保存。稱取50.0g次氯酸鈉，溶于1000mL水中，完全溶解后備用。該方法所需器材如下。f)流量控制閥：壓力為0.21MPa(對于處理水可任意選擇)。h)塑料連接。該方法所需器材如下。a)濾芯：壓縮后的多孔海綿濾膜模塊(600mm壓縮到30mm的60層多孔海綿濾膜，其中單層多孔海綿濾膜厚10mm,外徑55mm,內(nèi)徑18mm)。b)濾器：帶進出水樣接口及配套軟管和輔助工具。c)蠕動泵。e)夾子。g)流量控制閥(1L/min～4L/min)。該方法所需器材如下。a)水平振蕩器：有臂的水平振蕩裝置，臂上有垂b)250mL錐形離心管。d)旋渦攪拌器。e)塑料洗耳球。f)10mL吸管。g)50mL吸管。j)磁粒濃縮器1:適合Leighton管內(nèi)液體磁分離。k)磁粒濃縮器2:適合微型離心管內(nèi)液體磁分離。1)錐形具塞5mL微量離心管。該方法所需器材如下。a)手動或自動多孔海綿濾膜模塊淘洗主設備及配套裝置(濃縮管及底座，洗滌管及不銹鋼虹吸b)真空泵。c)磁力攪拌器和攪拌棒。e)磁粒濃縮器1:適合Leighton管內(nèi)液體磁分離。f)磁粒濃縮器2:適合微型離心管內(nèi)液體磁分離。該方法所需器材如下。a)多孔海綿濾膜模塊快速淘洗裝置：可壓縮空氣與淘洗液，自動完成8次及以上反向沖洗程序。b)空氣壓縮機：壓力大于0.5MPa,可壓縮15L空氣。c)離心機：2000g離心力。e)蠕動泵。f)磁粒濃縮器1:適合Leighton管內(nèi)液體磁分離。g)磁粒濃縮器2:適合微型離心管內(nèi)液體磁分離。8.1.3.3.2濕度孵化盒。所有玻璃器皿和塑料器皿都應在使用后及洗滌前經(jīng)高壓消毒。用熱濃洗滌劑溶液清潔器材，然后將它們放到不低于50.0g/L的次氯酸鈉溶液中，至少在室溫浸泡30min。用純水沖洗器材，然后將其放到?jīng)]有卵囊的環(huán)境中干燥。宜盡可能使用一次性物品。8.1.4試驗步驟8.1.4.1.1采樣量因水樣中的卵囊數(shù)量很少，因此需要濃縮較大體積的水樣，采樣的體積取決于水樣的類型：水源水可采集20L;生活飲用水采集100L。按以下步驟采樣。a)連接濾囊以外的采樣系統(tǒng)。b)打開蠕動泵的開關，并將流量調(diào)到2L/min。c)在作業(yè)線上安裝濾囊，用適當?shù)膴A子將濾囊的進口和出口分別連接固定。d)記錄水表上指示的體積。e)將采樣系統(tǒng)連接到自來水龍頭或其他水源上。f)通過濾囊過濾適當體積的水樣。g)在過濾結束的時候，記錄濾囊過濾的水樣體積。h)將連接在水源上的采樣系統(tǒng)取下。i)打開泵，盡快把濾囊放空。過濾后，可于0℃~4℃冷藏避光保存濾囊，一般不要超過72h。選用符合技術參數(shù)要求的設備，并參考該設備的說明書進行操作。舉例說明如下。a)取下濾囊進水口的乙烯帽，用量筒加110mL淘洗液A到每個濾囊的外腔中。b)將濾囊插到有臂的水平振蕩器夾子上，濾囊的出水閥在12點鐘的位置。c)打開振蕩器的開關，將樣本振蕩10min。d)將濾囊中的淘洗液A傾注到250mL的錐形離心管中，再將110mL淘洗液A加入濾囊的外腔中。e)將過濾器插到振蕩器的夾鉗上，出水閥轉到3點鐘位置。在80%的功率下，再搖10min。f)重復操作步驟d),將乙烯帽小心取下，將濾囊中的淘洗液傾注到250mL的錐形離心管中。按以下步驟濃縮。a)將裝有淘洗液樣本的錐形離心管置于1500g離心15min。自然減速，以免攪起沉淀物。b)用移液器小心地將上清液吸掉，使上清液剛好到沉淀物的上面(不要攪起沉淀物)。c)如果壓實的沉淀物體積小于或等于0.5mL,加純水到離心管中，使其總體積為10mL。將試管置于旋轉式攪拌器上10s～15s,以便使沉淀物再懸浮。d)如果壓實的沉淀物體積大于0.5mL,用公式(3)確定在離心管中需要的總體積：總需要體積(mL)=沉淀物體積×10mL/0.5mL (3)將再懸浮的沉淀物調(diào)整到一個0.5mL相同壓實的沉淀物體積，加純水到離心管中，使其總體積到上面計算的水平。將試管旋轉攪拌10s～15s,以便使沉淀物再懸浮。記錄這個再懸浮物的體積。8.1.4.1.3多孔海綿濾膜模塊采樣和淘洗步驟按以下步驟采樣a)將濾芯(螺栓頭朝下)安裝在支架上，擰緊蓋子(蓋子即為進樣口)。b)將濾器連接到需采樣的水源進行采樣。注1:為使液體流經(jīng)濾芯需在頂部施加0.05MPa的壓力。推薦的0.05MPa工作壓力形成的液體流速為3L/min~4L/min。工作壓力最大不超過0.8MPa。注2:采樣時如使用導流泵、蠕動泵等泵類裝置，安裝在濾器上游。注3:樣品采集可在水源現(xiàn)場或實驗室完成。過濾后，于0℃~4℃冷藏避光保存濾芯，一般不要超過72h。選用符合技術參數(shù)要求的設備，并參考該設備的說明書進行操作。舉例說明如下。a)手工淘洗1)第一次淘洗。將3μm濾膜放置到濃縮器中，組裝好濃縮管和洗滌管。將濾芯從支架上取下，安裝到淘洗器的活塞頂部。將淘洗器的狹口與洗滌管用快接頭連接。拉下淘洗器的延伸臂至鎖住，從濾芯上去除螺栓。再連接上不銹鋼虹吸管。向濃縮管注入600mL淘洗液B,隨后連接到快接頭上。將活塞上下活動20次，以沖洗解壓的濾芯。拆下濃縮管，擠壓活塞5次以清除過濾器中的殘留液體。2)第一次淘洗液濃縮。將濃縮管與磁性攪拌棒連接，放置在磁性攪拌盤上，以60r/min~120r/min攪拌。將真空泵連接到濃縮器上，形成壓力為13.3kPa～40.0kPa的真空。打開活栓，使流出液濃縮到30mL～40mL。將濃縮液輕輕倒入50mL離心管中。3)第二次淘洗。濃縮管中重新加入600mL淘洗液B,再連接到洗滌管上。重復第一次淘洗過程，只需10次。4)第二次淘洗液濃縮。將第一次的濃縮液加入第二次的淘洗液中。按上述方法重復濃縮過程。5)將3μm濾膜轉移到提供的袋子中，加入5mL淘洗液B,隔著袋子用手輕輕摩擦濾膜。清洗2次。將清洗液與濃縮液混合。b)自動淘洗1)第一次淘洗。將3μm濾膜放置到濃縮器中，組裝好濃縮管和洗滌管。打開自動淘洗器電源。將濾芯從支架上取下，安裝到淘洗器的活塞頂部。將淘洗器的狹口與淘洗管用快接頭連接。卸下濾芯上的螺栓。再連接上不銹鋼虹吸管。向濃縮管注入600mL淘洗液B,隨后連接到快接頭上。開始初次浸潤，然后進行第一次淘洗。拆下濃縮管，清除過濾器中的殘留液體。2)第一次淘洗液濃縮。將濃縮管與磁性攪拌棒連接，放置在磁性攪拌盤上，以60r/min~120r/min攪拌。將真空泵連接到濃縮器上，形成壓力為13.3kPa～40.0kPa的真空。打開活栓，使流出液濃縮到30mL～40mL。將濃縮液輕輕倒入50mL離心管中。3)第二次淘洗。濃縮管中重新加入600mL淘洗液B,再連接到洗滌管上。開始淘洗。拆下濃縮管，清除過濾器中的殘留液體。4)第二次淘洗液濃縮。將第一次的濃縮液加入第二次的淘洗液中。按上述方法重復濃縮過程。5)將3μm濾膜轉移到提供的袋子中，加入5mL淘洗液B,隔著袋子用手輕輕摩擦濾膜。清洗2次。將清洗液與濃縮液混合。8.1.4.1.4多孔海綿濾膜模塊采樣及快速淘洗步驟采樣方法如下：a)將濾芯(螺栓頭朝下)安裝在支架上，擰緊蓋子(蓋子即為進樣口);b)將濾器連接到需采樣的水源進行采樣。注1:為使液體流經(jīng)濾芯需在頂部施加0.05MPa的壓力。推薦的0.05MPa工作壓力形成的液體流速為3L/min~4L/min。工作壓力最大不超過0.8MPa。注2:采樣時如使用導流泵、蠕動泵等泵類裝置，安裝在濾器上游。注3:樣品采集可在水源現(xiàn)場或實驗室完成。過濾后，于0℃~4℃冷藏避光保存濾囊，一般不要超過72h。注4:本方法亦適用于濁度高的水源水的采樣。采用符合技術參數(shù)要求的多孔海綿濾膜模塊快速壓力淘洗裝置可使淘洗過程全自動完成，將壓力淘洗裝置準備就緒，向淘洗液瓶中加入足量的淘洗液C,利用連接鎖將淘洗液瓶與壓力淘洗裝置連接，確保二者之間形成良好密封。連接壓縮空氣源和壓力淘洗裝置，保證足夠的空氣壓力和體積。舉例說明如下。a)打開壓力淘洗設備的艙門。b)濾器進樣口朝上，移開樣品阻留器，連接分流調(diào)節(jié)器(濾芯仍在濾器內(nèi))。c)將濾器倒轉，用快接頭連接到壓力淘洗器上。d)將500mL錐形離心瓶放置在樣品收集器支架上，關閉壓力淘洗裝置。e)開始自動淘洗。f)淘洗結束時，打開壓力淘洗裝置。卸下濾器，再取下分流調(diào)節(jié)器，打開濾器，棄掉濾芯。g)將離心瓶蓋好，從樣品收集器支架中取出。按以下步驟濃縮。a)將裝有淘洗液樣本的離心瓶置于2000g離心15min。慢慢減速，以免攪起沉淀物。記錄沉淀物體積。注：勿用制動器!b)離心后，用吸氣裝置將沉淀物上層懸浮液體吸出，保留8mL～10mL液體(吸氣裝置的壓力應小于3.3kPa)。c)如果壓實的沉淀物體積小于或等于0.5mL,將試管置于旋轉式攪拌器20s,然后將樣品轉入Leighton管中；用1mL純水沖洗離心瓶二次，清洗液轉入同一Leighton管中。d)如果壓實的沉淀物體積大于0.5mL,用公式(4)確定在離心管中需要的總體積，以便將再懸浮的沉淀物調(diào)整到相當于0.5mL壓實沉淀物的體積。需要的總體積(mL)=沉淀物體積×10mL/0.5mL (4)加純水到離心管中，使其總體積到上面計算的水平。將試管旋轉攪拌10s～15s,以便使沉淀物再懸浮。記錄這個再懸浮物的體積。8.1.4.2.1長時間在0℃~4℃冷藏保存后，可能會在緩沖液A中形成一些結晶沉淀。為了確保這些沉淀的結晶能夠再溶解，使用前應將其置室溫(15℃~22℃)中直至結晶溶解。8.1.4.2.3定量轉移10mL水樣濃縮物到Leighton管中。8.1.4.2.4將抗隱孢子蟲抗體和抗賈第鞭毛蟲抗體的磁微粒原液置于漩渦混合器上攪拌，以便使珠粒懸浮。通過倒置試管的方法保證珠粒再懸浮，并確定底部沒有殘留的小團。8.1.4.2.5向含有水樣濃縮物和緩沖液樣品的Leighton管中各加100μL上述懸浮的微粒。8.1.4.2.6將含有樣品的Leighton管固定到旋轉式的攪拌器上，25r/min旋轉1h。8.1.4.2.7將試管從攪拌器上取下，然后再將其放在磁粒濃縮器1上，并將試管有平面的一邊朝向磁鐵。8.1.4.2.8用手柔和地以大約90°角頭尾相連地搖動試管，使試管的蓋頂和基底輪流上下傾斜。以每秒大約傾斜一次的頻率持續(xù)2min。8.1.4.2.9如果磁粒濃縮器1中的樣8.1.4.2.10立即打開頂端的蓋，同時將固定在磁粒濃縮器1上的試管中的所有上清液倒到廢液器中。做這一步驟時，不要搖動試管，也不要將試管從磁粒濃縮器1上取下。8.1.4.2.11將試管從磁粒濃縮器1上取下，加1mL緩沖液A。非常柔和地將試管中的所有物質(zhì)再懸浮。不要形成漩渦。8.1.4.2.12將試管中的所有液體定量轉移到有標簽的1.5mL微量離心管中。8.1.4.2.13將微量離心管放到未加磁條的磁粒子濃縮器2中，然后加入磁條。8.1.4.2.14用手180°角輕輕地搖動試管。每秒大約搖動一個180°角，持續(xù)大約1min。在這一步結束時，珠粒和卵囊會在試管的背面形成一個褐色圓點。8.1.4.2.15立即將固定在磁粒濃縮器2上的離心管和頂蓋中的上清液吸出。如果同時處理一個以上的樣品，就要在吸去每個離心管的上清液之前，進行3個180°角的搖動動作，不要擾亂磁鐵鄰近管壁上的附著物。不要搖動離心管。不要將離心管從磁粒濃縮器2上取下。8.1.4.2.16將磁條從磁粒濃縮器2上取下。8.1.4.2.17加50μL0.1mol/L的鹽酸至上8.1.4.2.18將試管放在磁粒濃縮器2上，室溫垂直靜置10min。8.1.4.2.19用力渦旋5s～10s。8.1.4.2.20保證所有樣品都在試管的底部，然后將微量離心管放在磁粒濃縮器2上。8.1.4.2.21再將磁條放到磁粒濃縮器2上，以大約90°角頭尾相連地輕輕搖動試管。使試管的蓋頂和基底輪流上下傾斜，以每秒大約傾斜一次的頻率持續(xù)30s。8.1.4.2.22準備一個載玻片，加5μL1mol/L的氫氧化鈉溶液至樣品井中。8.1.4.2.23不要將微量離心管從磁粒濃縮器2上取下。將所有樣品從磁粒濃縮器2上的微量離心管中轉移到有氫氧化鈉的樣品井中。不要擾亂試管背壁上的珠粒。8.1.4.3.1將有樣品的載玻片置37℃培養(yǎng)箱中干燥不超過2h,或置室溫避光自然風干。8.1.4.3.2在該玻片上加一滴(50μL)的純甲醇，然后讓它自然干燥3min～5min。的抗隱孢子蟲單克隆抗體和抗賈第鞭毛蟲單克隆抗體FITC工作稀釋液(1/1:Cellabs/PBS)。8.1.4.3.4加50μL上述FITC單克隆抗體工作稀釋液至玻片上。將載玻片放到濕盒中于36℃±1℃培養(yǎng)30min左右。8.1.4.3.530min后，取出載玻片，然后用一個干凈的頂端帶有真空源的巴斯德玻璃吸管輕輕地吸掉過量的熒光素標記單克隆抗體。8.1.4.3.7加50μLDAPI溶液(使用時配制，即加10μL2mg/mL溶于純甲醇中的DAPI于50mL的PBS中)到玻片上，然后讓它在室溫靜置2min左右。8.1.4.3.8吸掉過量的DAPI溶液。8.1.4.3.11讓載玻片在暗處干燥后，加一滴封固劑，蓋上蓋玻片，打開顯微鏡。預熱15min后，在200倍的熒光顯微鏡下檢查，再依次在400倍的藍光激發(fā)(FITC模式)、400倍的紫外激發(fā)(DAPI模式)下進一步證實。若DAPI染色結果不能確認時，可以使用DIC模式觀察孢囊內(nèi)部結構進行確認。賈第鞭毛蟲的孢囊呈橢圓形，長為8μm～14μm,寬為7μm～10μm。在FITC模式下，孢囊壁會發(fā)出蘋果綠色的熒光。在DAPI模式下，當內(nèi)部呈現(xiàn)亮藍色或者觀察到1個～4個細胞核時，呈DAPI陽性，可確認為賈第鞭毛蟲孢囊；若呈現(xiàn)邊緣綠色，內(nèi)部淺藍色時，呈DAPI陰性，建議采用DIC模式進一步觀察，若能看到孢囊的細胞核、中軸等內(nèi)部結構，可確認為賈第鞭毛蟲孢囊。隱孢子蟲的卵囊呈稍微橢圓的圓形，直徑為4μm～8μm。在FITC模式下，卵囊壁有蘋果綠色熒光。在DAPI模式下，當內(nèi)部呈現(xiàn)亮藍色或者觀察到1個～4個細胞核時，呈DAPI陽性，可確認為隱孢子蟲卵囊；若呈現(xiàn)邊緣綠色，內(nèi)部淺藍色時，呈DAPI陰性，建議采用DIC模式進一步觀察，若能看到卵囊內(nèi)有1個～4個月牙形子孢子，可確認為隱孢子蟲卵囊。計數(shù)整個玻片染色區(qū)域，呈現(xiàn)表7特征的可判斷為孢(卵)囊。表7賈第鞭毛蟲孢囊與隱孢子蟲卵囊的特征蘋果綠色熒光的膜熒光強度可變大小膜與細胞質(zhì)的對照膜的熒光強度大于細胞質(zhì)GB/T5750.12—2023表7賈第鞭毛蟲孢囊與隱孢子蟲卵囊的特征(續(xù))形狀十十賈第鞭毛蟲：橢圓形；隱孢蟲：圓形孢囊壁的完整性十孢囊壁會因破損而失去形狀注1:紫外激發(fā)光下觀察DAPI染色結果用于確認是否為孢(卵)囊，因為假的孢(卵)囊(蘋果綠色物體)呈DAPI陰性(無4個亮藍色核，只有亮藍色胞漿),出現(xiàn)4個亮藍色核和亮藍色胞漿為DAPI陽性，為真孢(卵)囊。注2:當DAPI染色不能確認時，可以使用DIC模式觀察孢(卵)囊內(nèi)部結構。注3:如DIC模式下結構清楚，有助于真孢(卵)囊計數(shù)，如結構不清楚且只有囊壁呈蘋果綠色熒光時，可能是空的孢(卵)囊，或帶有無定形結構的孢(卵)囊，亦可能是有內(nèi)部結構的孢(卵)囊。8.1.5試驗數(shù)據(jù)處理8.1.5.1按公式(5)計算每10升樣本中的孢(卵)囊數(shù)：式中：Y——每10升水中孢囊或卵囊的數(shù)目，單位為個每10升(個/10L);X——計數(shù)樣本的體積中孢囊或卵囊的數(shù)目，單位為個(個);V——離心后再懸浮的體積，單位為毫升(mL);V?——計數(shù)樣品的體積，單位為毫升(mL);V?——過濾后水的體積，單位為升(L)。8.1.5.2按公式(6)計算分析的檢測限：式中：D——每升孢囊或卵囊的檢測限；V——離心后再懸浮的體積，單位為毫升(mL);V?——計數(shù)樣品的體積，單位為毫升(mL);V?——過濾后水的體積，單位為升(L)。8.1.6質(zhì)量控制8.1.6.1免疫熒光質(zhì)量控制免疫熒光試劑盒的質(zhì)量控制應每批次試驗做一次，由陽性對照和陰性對照組成。8.1.6.1.1陰性對照按以下步驟進行，a)準備一個載玻片。b)加50μL純水，然后將它放在培養(yǎng)箱中干燥。c)染色步驟應符合8.1.4.3的要求。d)對整個染色區(qū)域進行計數(shù)，不應找出任何賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲的卵囊。按以下步驟進行。a)準備一個載玻片。b)將陽性對照樣品渦旋2min,以混勻儲存的原蟲孢(卵)囊。c)在玻片上滴加5μL賈第鞭毛蟲孢囊和5μL隱孢子蟲卵囊陽性樣本，然后放在培養(yǎng)箱中干燥。d)染色步驟應符合8.1.4.3的要求。e)對整個染色區(qū)域進行計數(shù)，應找到表7中描述的規(guī)則而均勻的染色孢囊和卵囊。8.1.6.2試驗全程的質(zhì)量控制整個步驟(從采樣到顯微鏡檢查)的質(zhì)量控制應每三個月做一次。它由兩個試驗組成：20L加有原蟲的水作為陽性對照，20L的純水作為陰性對照。按以下步驟進行。a)加20L純水到小口塑料瓶中。b)按樣品分析步驟分析陰性對照水樣。不應找到任何賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊。按以下步驟進行。a)渦旋2min儲存的原蟲孢(卵)囊。b)在一個有10mL純水的燒杯中加一些孢囊和卵囊，以便得到一個最終濃度大約每毫升5×101個孢(卵)囊的溶液。c)用磁棒攪拌30min。d)用載玻片測定這種溶液的濃度10次。e)用載玻片[加大約250個孢(卵)囊到玻片上]測定這種溶液的濃度5次。計數(shù)這兩種方法的濃度和標準差。如果標準差小于2