用于腫瘤基因治療的慢病毒載體研究進展

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【關(guān)鍵詞】慢病毒載體;基因治療;人類免疫缺陷病毒Ⅰ型;綜述

基因治療有望成為治療遺傳病、腫瘤、病毒感染及其他難治性疾病的有效手段，但目前基因轉(zhuǎn)移方法的局限性成為實現(xiàn)這一愿望的最大障礙。慢病毒(LV)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒屬的一個亞科，其中包括靈長類LV如人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIVⅠ)、HIVⅡ、猴免疫缺陷病毒(SIV)和非靈長類LV如Visna病毒、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)等7個亞屬。其中對HIVⅠ的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性研究較多。HIVⅠ具有可感染非分裂細胞、目的基因整合至靶細胞基因組長期表達、感染率高、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點，彌補了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體等病毒載體的缺陷，適于體內(nèi)基因治療，因此有望成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體。對該類載體的研究進展做一綜述。

1LV的基因結(jié)構(gòu)[1～3]

人類免疫缺陷病毒直徑110～120nm，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，大致呈球形。病毒外膜是磷脂雙分子層，來自宿主細胞，膜上有表面蛋白(gp120)與鑲嵌蛋白(gp41);gp41是跨膜蛋白，gp120為刺突，并與gp41通過非共價作用結(jié)合。包膜內(nèi)面是蛋白P17形成的球形基質(zhì)蛋白(Matrix)，以及衣殼蛋白(p24)形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼在電鏡下呈高電子密度。衣殼內(nèi)含有病毒的RNA基因組和其他來自宿主細胞的成分(如tRNAlys3，作為逆轉(zhuǎn)錄的引物)。

病毒基因組是兩條相同正股RNA鏈，全長約9200bp。兩端是長末端重復(fù)序列(LTR)，含順式調(diào)控元件,序列為5′U3RU53′，控制前病毒的表達?，F(xiàn)已證明，在LTR有啟動子和增強子并含負調(diào)控區(qū)。LTR之間的序列至少編碼9個蛋白，可分為3類：結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)控蛋白、輔助蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol、Env基因編碼。gag基因產(chǎn)生相對分子質(zhì)量55000的蛋白P55。P55病毒編碼的一個蛋白切成4個小蛋白：MA(P18基質(zhì)蛋白)、CA(P24衣殼蛋白)、NC(P7核衣殼蛋白)及P6。GagPol融合蛋白病毒編碼的一個蛋白切為4個小蛋白：RT(P50逆轉(zhuǎn)錄酶)、RNaseH(P15RNAH)、IN(P31整合)及Pro(P10蛋白)。Env起先是相對分子質(zhì)量160000的蛋白,在感染宿主細胞之后，宿主細胞將gp160切為gp41與gp120。調(diào)控蛋白tat、rev基因編碼,Tat和Rev蛋白分別在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平對病毒基因表達進行調(diào)節(jié)。輔助蛋白4個輔助基因vpu、vpr、vif、nef編碼。MAN、IN和vpr這3種分子元件決定了LV載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細胞。這3類蛋白利用細胞核的輸入機制，靶向作用于細胞核的前整合復(fù)合物(PIC)。細胞核的輸入系統(tǒng)包括：胞質(zhì)蛋白、importina、importinb及核孔蛋白。importina含有一個細胞定位序列(NKS)的結(jié)合位點，當(dāng)含有NL的蛋白與importina結(jié)合發(fā)生構(gòu)象變化，與importinb相互作用，然后importinb通過與核孔蛋白結(jié)合，靶向作用于核孔復(fù)合物[4]。而在實際構(gòu)建時，vpr可以完全敲除而不影響LV載體感染非分裂期細胞的能力。

2LV載體系統(tǒng)的演進

對LV載體進行改造使其具有高效的基因轉(zhuǎn)移、長期穩(wěn)定的基因表達及生物安全性一直是研究的熱點。到目前為止，已有3代LV載體產(chǎn)生。第一代LV載體以人的HIVⅠ研究最為廣泛。保留順式作用元件包括病毒本身的LTR以及病毒的包裝信號ψ、Gag基因部分p17區(qū)域、Rev反應(yīng)元件(RRE)。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶等工具逐漸去除掉野生型LV復(fù)制所需要的Gag、Pol、Env基因，部分除掉vpu、vpr、vif、nef致病基因，以保證載體的生物安全性。于這種載體已經(jīng)缺少形成完整病毒所需要的蛋白基因，所以它不能依靠自身基因形成完整的病毒顆粒[5]。而后將編碼病毒衣殼和包膜結(jié)構(gòu)的基因分別克隆于另外兩個質(zhì)粒中，一個表達Gag和Pol,另一個表達Env,即轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、包膜表達質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒帶一個強啟動子，如CMV啟動子用來控制除Env以外所有病毒結(jié)構(gòu)基因的表達，它還保留了病毒的LTR區(qū)并且被插入了外源基因，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上人工插入標(biāo)記基因(如LacZ、NeuoR、Gpt、Gfp)并可以在標(biāo)記基因之后外源基因插入之前引入內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，這樣就可以一個啟動子來轉(zhuǎn)錄出一個雙順反子mRNA，而不同的核糖體來分別翻譯出兩種蛋白。第一代LV載體系統(tǒng)的特點是在構(gòu)建3種包裝質(zhì)粒時，為了降低產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒(RCV)的可能性，盡可能減少3種質(zhì)粒之間的同源序列，但包裝質(zhì)粒中仍然保留了HIV的輔助基因。第二代LV載體在生物安全性上作了大量的改進，包裝結(jié)構(gòu)基因質(zhì)粒上進一步刪去了編碼輔蛋白Nef、Vif、Vpr的基因[6]，只保留了gag、pol、tat、rev，生物安全性進一步提高。第三代LV載體的主要特征是構(gòu)建了自我失活型的質(zhì)粒(刪除了病毒3′端LTR上的U3)。因為在病毒整合宿主基因組后，病毒3′端LTR的U3發(fā)生跳躍后能啟動病毒基因的轉(zhuǎn)錄。而U3是病毒的啟動子，當(dāng)刪除病毒3′端LTR的U3后，病毒基因組就不能復(fù)制，即使在發(fā)生病毒基因與宿主基因重組的情況下，病毒的基因組也不能被復(fù)制，因此只能轉(zhuǎn)錄整合目的基因，消除了產(chǎn)生活性病毒的可能性[7]。另一種改進是在LV載體包裝結(jié)構(gòu)基因質(zhì)粒上進一步刪去了tat基因?？傊?，第三代LV在不影響感染能力的前提下，其生物安全性大大提高。

3三質(zhì)粒表達系統(tǒng)

根據(jù)以上原理，NALDINI等[8]和KAFRI等[9]構(gòu)建了三質(zhì)粒表達系統(tǒng)。三質(zhì)粒系統(tǒng)是包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及轉(zhuǎn)移質(zhì)粒組成的。其中包裝質(zhì)粒在CMV啟動子的控制下，表達HIVⅠ復(fù)制所需的全部反式激活蛋白，但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白Vpu;包膜蛋白質(zhì)粒使用水皰性口炎病毒G蛋白(VSVG)等異源性基因代替env基因，HIVⅠ載體的感染譜得以擴大，HIVⅠ載體顆粒獲得高度穩(wěn)定性并可在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中插入標(biāo)志基因(綠色熒光蛋白GFP);轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上還可以插入需要轉(zhuǎn)入靶細胞的目的片段。通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,就可以生產(chǎn)復(fù)制缺陷的HIV病毒。

4LV的基因治療

腫瘤基因治療是繼手術(shù)、放療等傳統(tǒng)治療方法之后出現(xiàn)的一種全新的腫瘤治療方法。LV載體能夠?qū)⒛[瘤治療基因安全高效地轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，使治療基因長期、穩(wěn)定、高效的表達。目前在基礎(chǔ)和臨床方面取得了許多進展。

TRONO[10]認為重組LV載體是目前最適合神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病基因治療的載體系統(tǒng)。LV載體安全高效的特點使其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用越來越廣泛[11]。楊宇等[12]采用目前安全性最高的4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法成功構(gòu)建了攜EGFP的重組LV載體;Lent/EGFP對非分裂的神經(jīng)細胞具有較強的感染能力,且攜帶的EGFP基因可以在神經(jīng)細胞內(nèi)有效表達。目前,體內(nèi)外實驗中均未發(fā)現(xiàn)LV載體對正常組織細胞有毒副作用,不編碼病毒蛋白,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)不引起免疫反應(yīng)[13]。馬曉生等[14]研究顯示，LV載體對大鼠骨髓間質(zhì)干細胞的轉(zhuǎn)染效率明顯優(yōu)于腺病毒載體，并成功構(gòu)建含hBMP2基因的LV載體，收集到有活性的能表達目的蛋白的重組LV,為今后用于臨床骨缺損基因治療方面的研究提供了重要的理論依據(jù)和材料。作為基因治療中常用的靶細胞，T淋巴細胞是處于非分裂期的細胞,在移植物抗宿主病等疾病中起到重要的作用。提高目的基因?qū)細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率對于這類疾病基因治療具有重要的意義,這是目前研究的重點和難點。李振宇等[15]構(gòu)建了以HIVⅠ為基礎(chǔ)的LV三質(zhì)粒系統(tǒng),并以綠色熒光蛋白基因(GFP)作為標(biāo)志基因,觀察其在小鼠T淋巴細胞中的表達情況。感染小鼠T淋巴細胞48h后,熒光顯微鏡下觀察到T淋巴細胞內(nèi)含有綠色熒光,證實GFP基因在其中表達,FACS分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為(±)%,較同樣條件下逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染小鼠T淋巴細胞的效率(±)%[16]為高(P<)。林健等[17]成功利用LV介導(dǎo)單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVTK)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠膠質(zhì)瘤細胞，為后續(xù)的腦膠質(zhì)瘤基因治療提供了可靠基礎(chǔ)。

造血干細胞是一種具有自我更新能力和多分化潛能的細胞，被認為是基因治療中最有發(fā)展前景的靶細胞。MAY等[18]證實LV載體能夠?qū)⒛康幕蜣D(zhuǎn)移到靶細胞中，并能在其中長期表達。

5存在問題及展望

盡管HIVⅠ載體研究有了很大進展，但距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走。首先，重組病毒滴度還不夠高，難以達到體內(nèi)應(yīng)用的需要;其次，于HIV復(fù)雜的生物學(xué)性質(zhì)，要像目前常用的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣建立穩(wěn)定的HIV載體包裝細胞十分困難，已建立的包裝細胞均不理想[19,20]。研究報道，Vpr是一種使細胞進入靜止期的強誘導(dǎo)劑[21]，也是建立包裝細胞的主要障礙之一。如果去除包裝質(zhì)粒中的vpr基因而不影響載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，則可以建立穩(wěn)定的包裝細胞。

LV載體技術(shù)是目前轉(zhuǎn)基因中最有效和最成功的方法，其技術(shù)操作簡便，能高效地將目的基因以單拷貝的形式插入宿主染色體中，基因表達效率高，對宿主細胞功能系統(tǒng)有良好的適應(yīng)性。相信該載體會對醫(yī)學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生重要的意義。

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