第三章高效液相色譜分析教材

第三章

高效液相色譜分析法

黃寶華二OO九年六月概述高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術基礎上建立的一種液相色譜法一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別二、HPLC與GC差別三、高效液相色譜儀流程圖四、特點圖示固定相——CaCO3顆粒流動相——石油醚色帶一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設備和檢測手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動相柱效低（H↑，n↓）

分析周期長無法在線檢測2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動相柱效高（H↓，n↑）

分析時間大大縮短可以在線檢測二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別1．分析對象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測占有機物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%2．流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?．操作條件差別三、高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）四、HPLC的特點和應用圖示back液液色譜與氣液色譜

速率方程式的區(qū)別P66基本一致，差別在于傳質(zhì)阻力項對液液色譜，影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項，縱向擴散項可以忽略不計Cu=(Cs+Cm)uCmum=Hm+HsmHm流動的流動相中的傳質(zhì)阻力項Hsm滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力項圖示如何提高柱效要降低液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm要求色譜柱的固定相填料顆粒盡可能細小而均勻，孔徑要大，填充要緊密，從而使流動相和固定相的接觸面積增大，流動相流通的路徑細小而均勻，滯留的流動相所占的體積分數(shù)盡可能小，提高傳質(zhì)速率減小粒度是提高柱效的最有效途徑HPLC法中分離條件的選擇1.固定相與裝柱方法的選擇：選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp≤10μm）

首選化學鍵合相，勻漿法裝柱2.流動相及其流速的選擇：選粘度小、低流速的流動相——甲醇，1ml/min

3.柱溫的選擇：

選室溫250C左右高效液相色譜法的主要類型及其分離原理一、液固吸附色譜法（LSC）二、液液分配色譜法（LLC）三、化學鍵合相色譜法（BPC）四、離子交換色譜法（IEC）五、離子對色譜法（IPC）六、離子色譜法（IC）七、空間排阻色譜法（SEC）各類高效液相色譜法

化學鍵合相色譜法（BPC）（一）化學鍵合相（二）反相鍵合相色譜（三）正相鍵合相色譜（一）化學鍵合相利用化學反應將固定液的官能團鍵合在載體表面1．分離機制：分配+吸附（以LLC為基礎）2．特點：1）不易流失2）熱穩(wěn)定性好3）化學性能好4）載樣量大5）適于梯度洗脫（二）反相鍵合相色譜固定相：極性小的烷基鍵合相

C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC約80%問題）流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動相極性>固定相極性底劑+有機調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）

例：水+甲醇，乙腈，THF硅烷化鍵合相（≡Si-O-Si-C）︱≡Si–OH+C18H37SiCl3→≡Si-O–Si–C18H37+HCl

∣有機氯硅烷與硅醇基發(fā)生反應這種固定相在pH=2～8.5范圍內(nèi)對水穩(wěn)定，有機分子與載體間的結合牢固，固定相不易流失穩(wěn)定性好。十八烷基硅烷鍵合相（Octadecylsilane

簡稱ODS或C18）：是最常用的非極性鍵合相。它們用于反相色譜法，在70℃以下和pH2～8范圍內(nèi)可正常工作。

流動相極性與k的關系：

流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑出柱順序：極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問題）（三）正相鍵合相色譜固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相流動相：極性?。ㄍ琇SC）

底劑+有機極性調(diào)節(jié)劑例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇續(xù)前流動相極性與k的關系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓出柱順序：結構相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小）分離物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類等流動相溶劑和樣品溶液的處理流動相或樣品溶液中微小的機械雜質(zhì)會造成泵的柱塞、進樣閥的閥芯故障.機械雜質(zhì)在柱頭的積累會影響柱的正常使用流動相過濾器使用注射器過濾膜凈化樣品六通閥六通閥手柄（a）裝樣（b）進樣HAMILTON平頭液相注射器10ul/25ul/50ul/100ulHPLC柱常由內(nèi)部拋光的直形不銹鋼管制成。固定相的裝填需要專門的設備和技術。大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱。市售HPLC柱有各不同的型號，按分析對象性質(zhì)進行相應的選擇，如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，HPLC柱粒徑一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。一般常規(guī)分析柱內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm），柱長為10~30cm左右，就可滿足復雜混合物分析的需要。例如:用25cm×0.46cm的Lichrosorb-ODS（5μm）柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分。AgilentZORBAXstablebond-C18液相色譜柱

參考價￥4500,4.6x250mm,5umSB0340液相保護柱

用于液相色譜柱前保護

液相色譜柱對流動相的要求：1）與固定液不反應2）對樣品有良好溶解度

k=1~10k=2~5最理想的3）與檢測器匹配：

UV（常用，測定波長應大于溶劑的截止波長）熒光，電化學4）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈）使用前過濾、脫氣洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）類似GC的等溫度洗脫2）梯度洗脫：在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例即不斷改變其極性（兩個泵）適于分析極性差別較大的復雜組分類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）液相色譜檢測器的基本類型溶質(zhì)性質(zhì)檢測器僅對被分離組分物理或物化特性有響應紫外、熒光、電化學檢測器總體性質(zhì)檢測器對試樣和流動相總的物理或物化特性有響應示差折光、電導檢測器HPLC的檢測器要求

靈敏度高噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）柱外效應小線性范圍寬重復性好適用范圍廣常用的檢測器紫外檢測器ultravioletdetector,UVD示差折光檢測器refractiveindexdetector,RID通用型電導檢測器electricalcondactivitydetector,ECD通用型熒光檢測器fluorophotomericdetector,FD）均屬于非破壞性檢測器。其中RID和ECD是通用型檢測器，分別測量的是一般物質(zhì)均具有的折光率、電導性質(zhì)，對溶劑和溶質(zhì)組分均有響應。UVD和FD是選擇性檢測器，分別只對有紫外吸收、熒光活性的組分有響應，紫外檢測器最小檢測濃度可達10-9g/mL熒光檢測器可達10-11/mL。近幾年出現(xiàn)的蒸發(fā)激光散射檢測器evaporationlaserscatteringdetector,ELSD----高靈敏度的通用型檢測器，預期將獲得廣泛的應用。UV/VIS紫外-可見分光光度檢測器UVDHPLC中應用最廣泛的一種檢測器適用于對紫外光或可見光有吸收的樣品靈敏度高5×10-10g/mL溶質(zhì)性質(zhì)檢測器，選擇性檢測器通用性好可用于梯度洗脫要求溶劑對所選波長無吸收UVDHPLC中應用最廣泛的檢測器當檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器（UV-VIS）優(yōu)點是靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感,可用于梯度洗脫。UVD注意選擇樣品的吸收波長時必須考慮流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長和吸光系數(shù)。溶劑的截止波長可定義為:使用1cm比色皿時以空氣為參比，逐漸降低入射波長，吸光度A＝1時的波長值。也稱極限波長。溶劑的紫外截止波長溶劑的紫外截止波長當小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學不透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。其測量是將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。中國藥典對UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內(nèi)不得超過0.40，在241~250nm范圍內(nèi)不得過0.20，在251~300nm范圍內(nèi)不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。

UVD固定波長檢測器可變波長檢測器光電二極管陣列檢測器（photodiodearraydetector，PDAD）PDAD80年代出現(xiàn)的一種光學多通道檢測器，同時可得到所有波長的吸收值可以對每個洗脫組分進行光譜掃描，經(jīng)計算機處理后，得到三維的光譜和色譜結合的圖譜所得信息為吸收值（A）隨保留時間和波長（λ）而變化的三維圖或輪廓圖通過此圖很容易選擇測定各個分析物的最佳波長。吸收光譜可用于定性（確證是否是單一純物質(zhì)），色譜則用于定量。常用于復雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器（photodiodearraydetector，PDAD）

采用計算機快速掃描采集數(shù)據(jù)，可獲得三維（吸光度，波長，保留時間）色譜-光譜圖P86光電二極管陣列檢測器

（photodiodearraydetector,PDAD）快速掃描紫外可見分光檢測器，是一種新型的光吸收式檢測器。采用光電二極管陣列作為檢測元件，構成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接收器上的全部波長的光信號，然后對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到吸收值(A)是保留時間(tR)和波長(

)函數(shù)的三維色譜光譜圖。由此可及時觀察與每一組分的色譜圖相應的光譜數(shù)據(jù)，從而迅速決定具有最佳選擇性和靈敏度的波長。硅二極管陣列靶直徑16mm＞15000管硅二極管陣列檢測器~是在一硅片上制成光二極管陣列光二極管的p-n結反向偏置，其電導幾乎為零光輻射照n型區(qū)時形成空穴和電子，空穴可流向p區(qū)，電導增加，增加的大小與輻射的功率成正比每個光二極管由絕緣二氧化硅層包圍著的圓柱形p型硅區(qū)形成，都連接到一個共同的n型層硅片硅二極管陣列檢測器靶的表面用電子束掃描，相當于電容充電，使每個p型柱被充電到電子束的電位當光子流撞擊到n型表面，產(chǎn)生光電子，電子逸出而形成空穴，空穴向p區(qū)移動與預先電子束掃描過的p區(qū)的電子結合形成充電電流，結合完成，充電電流停止電子束再次掃描時，由于光照形成的空穴與電子結合形成光電電流，該電流被放大作為信號記錄下來硅二極管陣列檢測器每個二極管測量一窄段光譜,靶表面分成多個通道，每一通道的分析信號分別存到計算機的存儲器中，令二極管陣列靶處于單色器的焦面上，則從每一通道獲得的分析信號就與不同波長的光譜相對應，而成為光學多道分析器二極管陣列檢測器光路圖單光束二極管陣列檢測器的光路圖光源發(fā)出的光先通過檢測池，透射光由全息光柵色散成多色光，射到陣列元件上，使所有波長的光在接收器上同時被檢測。陣列式接收器上的光信號用電子學的方法快速掃描提取出來，每幅圖象僅需要10ms，遠遠超過色譜流出峰的速度，因此可隨峰掃描。ELSD近幾年出現(xiàn)的蒸發(fā)激光散射檢測器（evaporationlaserscatteringdetector,ELSD）是高靈敏度的通用型檢測器，預期將獲得廣泛的應用。液相制備色譜制備色譜分離制備較大量純組分的有效辦法幾十毫克樣品制備色譜柱內(nèi)徑5-50mm,長度15-50cm高壓泵輸出流量＞20(~100)mL·min-1

高效液相色譜法的應用高效液相色譜法的應用遠遠廣于氣相色譜法。它廣泛用于合成化學、石油化學、生命科學、臨床化學、藥物研究、環(huán)境監(jiān)測、食品檢驗及法學檢驗等領域。一.在食品分析中的應用食品營養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋果酸等）、有機胺、礦物質(zhì)等；食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、亮藍等）、抗氧化劑等；食品污染物分析：霉菌毒素（黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等）、微量元素、多環(huán)芳烴等。二.在環(huán)境分析中的應用多環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）、農(nóng)藥（如氨基甲酸脂類，反相色譜）殘留等。三.在生命科學中的應用HPLC技術目前已成為生物化學家和醫(yī)學家在分子水平上研究生命科學、遺傳工程、臨床化學、分子生物學等必不可少的工具。其在生化領域的應用主要集中于兩個方面：低分子量物質(zhì)，如氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇、卟啉、糖類、維生素等的分離和測定。高分子量