高考生物一輪復(fù)習(xí)選擇性必修3第十單元生物技術(shù)與工程第51講基因工程的基本工具和基本操作程序?qū)W案

第51講基因工程的基本工具和基本操作程序【課標(biāo)要求】1.闡明重組DNA技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定等步驟。3.活動(dòng)：（1）DNA的粗提取與鑒定。（2）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定。考點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具1.基因工程的概念2.重組DNA技術(shù)的基本工具（1）限制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱限制酶）。①主要來(lái)源：。②種類：分離的限制酶有種。③特點(diǎn)（專一性）：識(shí)別雙鏈DNA分子的。使每一條鏈中特定部位的斷開(kāi)。④[易錯(cuò)提醒]限制酶作用的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵，不是氫鍵；在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割2次此DNA分子，產(chǎn)生4個(gè)末端。（2）DNA連接酶。（3）載體。[易錯(cuò)提醒]與膜載體的區(qū)別：基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)，并利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。[答案自填]1.DNA分子轉(zhuǎn)基因遺傳特性生物類型基因重組2.（1）①原核生物②數(shù)千③特定核苷酸序列磷酸二酯鍵（2）磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端黏性末端和平末端（3）環(huán)狀雙鏈DNA分子噬菌體、動(dòng)植物病毒一個(gè)至多個(gè)自我復(fù)制受體DNA標(biāo)記[教材命題點(diǎn)思考]1.天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程載體？為什么？提示：不可以。含有復(fù)制原點(diǎn)、含有一種或多種限制酶的識(shí)別序列、有標(biāo)記基因等特點(diǎn)的DNA分子才可以直接用作基因工程的載體。實(shí)際上，天然的DNA分子一般不完全具備上述條件，往往需要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。2.實(shí)踐中常用某些病毒載體作為基因工程工具，除具備普通質(zhì)粒載體的條件外，還應(yīng)具有的條件是______________________________（答出2點(diǎn)即可）。提示：對(duì)靶細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)化效率、不能增殖、對(duì)細(xì)胞無(wú)害3.限制酶EcoRⅠ只能識(shí)別序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)EcoRⅠ的切點(diǎn)，請(qǐng)畫出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。提示：—GAATTC……GAATTC——CTTAAG……CTTAAG—目的基因1.限制酶的選擇原則（1）根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類。①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，如圖可選擇PstⅠ。②不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，防止破壞目的基因，如圖不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶（但要確保質(zhì)粒上也有這兩種限制酶的切割位點(diǎn)，而且這兩種限制酶切割后不會(huì)完全破壞標(biāo)記基因）。（2）根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類。（3）根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶，圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，丙Ti質(zhì)粒宜選?。ㄔO(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ）。2.標(biāo)記基因的作用可用于檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。1.（2023·高考新課標(biāo)卷）某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（）A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割，目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接解析：選C。只用一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)使質(zhì)粒和目的基因發(fā)生自身環(huán)化或使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，A項(xiàng)不符合題意；用酶1切割目的基因，產(chǎn)生的是黏性末端，用酶3切割質(zhì)粒，產(chǎn)生的是平末端，無(wú)法連接，B項(xiàng)不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4DNA連接酶連接，使目的基因定向插入質(zhì)粒中，C項(xiàng)符合題意；酶2和酶4切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，易導(dǎo)致目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化或使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，并且用酶4切割會(huì)破壞標(biāo)記基因，D項(xiàng)不符合題意。2.圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因（TetR）和氨芐青霉素抗性基因（AmpR）。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）EcoRⅤ酶切位點(diǎn)為，EcoRⅤ酶切出來(lái)的線性載體P1為末端。（2）用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。（3）為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長(zhǎng)情況見(jiàn)下表（“＋”代表生長(zhǎng)，“－”代表不生長(zhǎng)）。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是（填表中字母）類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是、。平板類型菌落類型ABC無(wú)抗生素＋＋＋氨芐青霉素＋＋－四環(huán)素＋－－氨芐青霉素＋四環(huán)素＋－－（4）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物，結(jié)果從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是___________________________________________________。解析：（1）由題圖可知，EcoRⅤ酶切出來(lái)的載體質(zhì)粒為平末端。（2）由題圖可知，目的基因的兩端各有一個(gè)游離的腺嘌呤脫氧核苷酸，由于載體P1為平末端，所以載體P1的兩端應(yīng)該各添加一個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷酸，這樣在DNA連接酶的作用下才能把目的基因和載體P1連接起來(lái)。（3）由題圖可知，構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)四環(huán)素抗性基因被破壞，所以導(dǎo)入目的基因的菌落只能在沒(méi)有抗生素或含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中存活，故應(yīng)該選B類菌落。A類菌落能在題表中條件下存活，說(shuō)明導(dǎo)入的是P0質(zhì)粒。C類菌落只能在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中存活，說(shuō)明C類菌落沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒。（4）據(jù)題圖分析，目的基因的外側(cè)鏈只能用丙作引物，內(nèi)側(cè)鏈可用甲、乙作引物。如果用甲、丙作引物，則無(wú)論目的基因是否插入正確，都能通過(guò)PCR擴(kuò)增大量目的基因，如果用乙、丙作為引物，當(dāng)目的基因插入不正確（反向插入）時(shí)，乙、丙兩引物都結(jié)合在外側(cè)，PCR不能正常進(jìn)行，因此選用乙、丙作為引物可以進(jìn)行PCR鑒定。若擴(kuò)增出的DNA片段為400bp，則正好是目的基因反向連接后，外側(cè)鏈用乙作引物，內(nèi)側(cè)鏈用甲作引物擴(kuò)增出的片段。答案：（1）平（2）胸腺嘧啶（T）DNA連接（3）BA類菌落含有P0C類菌落未導(dǎo)入質(zhì)粒（4）乙、丙目的基因反向連接考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序[學(xué)生用書(shū)P355]1.目的基因的篩選與獲?。?）目的基因的獲取方法：人工合成目的基因、利用目的基因、通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因。（2）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因。[易錯(cuò)提醒]變性過(guò)程雙鏈DNA解聚為單鏈不需要解旋酶。在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量；引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，作為新子鏈的合成起點(diǎn)，只能結(jié)合在母鏈的3′端，使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸；真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，故PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心（1）（2）組成。[易錯(cuò)提醒]啟動(dòng)子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的區(qū)別項(xiàng)目位置作用啟動(dòng)子位于DNA分子上RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程起始密碼子位于mRNA分子上決定翻譯的開(kāi)始終止子位于DNA分子上決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束終止密碼子位于mRNA分子上決定翻譯的結(jié)束（3）[易錯(cuò)提醒]若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會(huì)出現(xiàn)三種情況：目的基因與目的基因連接；目的基因與質(zhì)粒連接；質(zhì)粒與質(zhì)粒的連接，需篩選出重組質(zhì)粒。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）植物細(xì)胞。[易錯(cuò)提醒]農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入：第一次拼接是指將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指將插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是指將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入（非人工操作）是指將含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過(guò)花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。（2）動(dòng)物細(xì)胞：法，將目的基因注入動(dòng)物的中。（3）原核生物：先用處理大腸桿菌細(xì)胞，使之處于一種能吸收周圍環(huán)境中的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。4.目的基因的檢測(cè)與鑒定[易錯(cuò)提醒]分子水平檢測(cè)是否插入了目的基因和是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA時(shí)，都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則；都使用基因探針，探針是放射性同位素或熒光標(biāo)記的含目的基因的單鏈DNA片段。[答案自填]1.（1）PCR獲取和擴(kuò)增（2）DNA半保留復(fù)制引物脫氧核苷酸耐高溫溫度兩種引物耐高溫的DNA聚合酶指數(shù)形式瓊脂糖凝膠電泳2.（1）在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代（2）RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄（3）目的基因相同3.（1）花粉管通道Ti質(zhì)粒T-DNA染色體DNA（2）顯微注射受精卵（3）Ca2＋DNA分子4.染色體DNA目的基因mRNA抗原—抗體轉(zhuǎn)基因[教材命題點(diǎn)思考]1.目前在PCR反應(yīng)中使用TaqDNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是什么？提示：在PCR過(guò)程中，要加熱超過(guò)90℃，所以使用TaqDNA聚合酶，而不使用在高溫下會(huì)失活的大腸桿菌DNA聚合酶。2.以mRNA為材料可以獲得DNA，其原理是_________________________________________________。提示：在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則可以合成DNA3.從受體細(xì)胞中分離純化出目的蛋白，該蛋白作為抗原注入機(jī)體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生的可與此蛋白結(jié)合的相應(yīng)分泌蛋白是，該分泌蛋白可用于檢測(cè)受試者血清中的HIV，檢測(cè)的原理是_____________________________________。提示：抗體抗原、抗體特異性結(jié)合4.為確定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否培育成功，既要用檢測(cè)目的基因是否已插入，又要在個(gè)體水平上鑒定，后者的具體過(guò)程是_________________________________________________________________。提示：PCR技術(shù)將培育的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中，觀察該煙草植株的生長(zhǎng)狀態(tài)[模型命題點(diǎn)思考]5.據(jù)圖回答下列問(wèn)題。（1）從圖中可以看出，目的基因是________________________________________________________________________，使用的載體是，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法是。（2）若進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定，則采用的方法是______________________________________________________。提示：（1）Bt抗蟲(chóng)蛋白基因Ti質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（2）用棉葉飼喂棉鈴蟲(chóng)1.PCR循環(huán)圖示與規(guī)律循環(huán)次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物A（或B）的DNA分子數(shù)1372n－1同時(shí)含引物A、B的DNA分子數(shù)0262n－2共消耗的引物數(shù)量26142n＋1－2注：第三輪循環(huán)后，開(kāi)始出現(xiàn)雙鏈等長(zhǎng)的目的基因片段。2.篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如下圖，目的基因插入四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。（2）被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌。（3）篩選方法：將混合處理后的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌，如下圖1、2、3、4、5菌落，再利用無(wú)菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如下圖能生長(zhǎng)的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的即為含有目的基因的菌落，如下圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)?？枷?PCR及應(yīng)用1.（2024·梅州聯(lián)考）PCR引物的3′端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵，5′端無(wú)嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列，dNTP（四種脫氧核苷三磷酸）是DNA合成的原料。下列相關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）A．圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個(gè)環(huán)節(jié)的低B．dNTP作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到3′端C．TaqDNA聚合酶催化磷酸二酯鍵的形成D．經(jīng)過(guò)1個(gè)循環(huán)后，獲得的子代DNA的雙鏈中脫氧核苷酸數(shù)量相同解析：選D。題圖中環(huán)節(jié)為引物與模板堿基互補(bǔ)配對(duì)，表示的是復(fù)性環(huán)節(jié)，復(fù)性的上一環(huán)節(jié)為變性，復(fù)性的溫度（50℃左右）比變性的溫度（90℃以上）低，A項(xiàng)正確；在PCR擴(kuò)增中，子鏈延伸的方向是從5′端到3′端，所以dNTP作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到3′端，B項(xiàng)正確；TaqDNA聚合酶能催化磷酸二酯鍵的形成，C項(xiàng)正確；由于兩個(gè)引物均不在該片段的端點(diǎn)，因此一個(gè)循環(huán)后，得到的兩個(gè)DNA片段中脫氧核苷酸的數(shù)量不一定相同，一般PCR第三輪才可以擴(kuò)增出雙鏈脫氧核苷酸數(shù)量相同的子代DNA，D項(xiàng)錯(cuò)誤。2.重疊延伸PCR是一種通過(guò)寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，經(jīng)過(guò)多次PCR擴(kuò)增，獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴(kuò)增較長(zhǎng)片段的DNA、不同來(lái)源的DNA片段拼接、基因的定點(diǎn)誘變等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，下圖表示利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增某目的基因的過(guò)程。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．引物中G＋C的含量越高，引物與模板DNA結(jié)合的穩(wěn)定性越高B．在第一階段由于引物2和引物3發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，因此兩者置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中C．引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制后，共產(chǎn)生4種雙鏈DNA分子D．在引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段要形成圖示雙鏈DNA，至少要經(jīng)過(guò)2次復(fù)制解析：選C。C與G之間有3個(gè)氫鍵，A與T之間有2個(gè)氫鍵，因此引物中G＋C的含量越高，引物與模板DNA結(jié)合的穩(wěn)定性越高，A項(xiàng)正確；由題圖可知，引物2和引物3分別作用于同一段DNA的兩條鏈，二者會(huì)發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，因此需將它們置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，B項(xiàng)正確；引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制后，各產(chǎn)生2種雙鏈DNA分子，由于引物1和引物4合成的DNA屬于同一種DNA，因此共產(chǎn)生了3種雙鏈DNA分子，C項(xiàng)錯(cuò)誤；在引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段要形成題圖所示雙鏈DNA，至少要經(jīng)過(guò)2次復(fù)制，D項(xiàng)正確?？枷?基因工程的操作程序3.某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點(diǎn)，同時(shí)還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過(guò)程如下圖所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。其中用到的質(zhì)粒是；該質(zhì)粒含有一段特殊的DNA片段，稱為。該方法中農(nóng)桿菌的作用是____________________________________________。（2）在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質(zhì)粒相比，選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶的好處是___________________________________。（3）含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素培養(yǎng)基上都可以生長(zhǎng)繁殖，農(nóng)桿菌中是否已有目的基因？（填“是”或“否”）。為什么？____________________________________。（4）將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行如下操作，篩選出符合要求的農(nóng)桿菌。先把轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接種到A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后，用無(wú)菌牙簽挑取A上的單個(gè)菌落，分別接種到B（含氨芐青霉素）和C（含四環(huán)素和氨芐青霉素）兩個(gè)培養(yǎng)基的相同位置上，一段時(shí)間后，菌落的生長(zhǎng)狀況如下圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請(qǐng)?jiān)趫D中相應(yīng)的位置上圈出來(lái)。答案：（1）Ti質(zhì)粒T-DNA感染煙草細(xì)胞，把目的基因插入煙草細(xì)胞的染色體DNA上（2）防止目的基因自連和質(zhì)粒自連，以提高帶有目的基因的重組質(zhì)粒的合成效率，防止目的基因與質(zhì)粒反向連接（3）否含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素基因被破壞（4）4.（2023·廣東選擇考）種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對(duì)野生型擬南芥（2n＝10）進(jìn)行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過(guò)遺傳分析和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)野生型DA1基因發(fā)生一個(gè)堿基G到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推測(cè)突變體的表型與其有關(guān)，開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。回答下列問(wèn)題：（1）擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DA1基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變?cè)斐?，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與植株的種子大小相近。（2）用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DA1基因，用限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)PCR產(chǎn)物和進(jìn)行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備________________________________________________。（3）轉(zhuǎn)化后，T－DNA（其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換）可在基因組單一位點(diǎn)插入，也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株（如下圖所示），用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)的陽(yáng)性個(gè)體即表示其基因組中插入了________________________________________________________。②T1代陽(yáng)性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽(yáng)性率約%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將②中選出的T2代陽(yáng)性植株（填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”）所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽(yáng)性率達(dá)到%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)研究中檢測(cè)該突變，研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因片段，再使用限制性內(nèi)切核酸酶X切割產(chǎn)物，通過(guò)核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測(cè)，相關(guān)信息見(jiàn)下圖，在電泳圖中將酶切結(jié)果對(duì)應(yīng)位置的條帶涂黑。解析：（1）據(jù)題干信息可知，突變體是由野生型DA1基因發(fā)生隱性突變形成的，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DA1基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由隱性突變?cè)斐?，由于轉(zhuǎn)入的基因?yàn)轱@性基因，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近。（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需要用限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的DA1基因和作為載體的Ti質(zhì)粒進(jìn)行切割。為確保插入的DA1基因可以正常表達(dá)，DA1基因（目的基因）的上下游需具備啟動(dòng)子和終止子。（3）①卡那霉素抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因，標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)。用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交，將T1代種子播種在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)的陽(yáng)性個(gè)體即表示其基因組中插入了DA1基因（和卡那霉素抗性基因）。②假設(shè)DA1基因用A表示，結(jié)合題中信息可知，T1代中能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的植株的基因型為Aa或AA或多位點(diǎn)插入，T1代陽(yáng)性植株自交所得T2代種子按單株收種并播種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，當(dāng)T1代陽(yáng)性植株基因型為Aa時(shí)，該植株上所結(jié)種子有75%能夠萌發(fā)并長(zhǎng)成幼苗，因此，應(yīng)選擇陽(yáng)性率約為75%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③T2代陽(yáng)性植株的基因型為1/3AA、2/3Aa，將②中選出的T2代陽(yáng)性植株自交，所得的T3代種子按單株收種并播種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，基因型為AA的植株自交，其后代不會(huì)發(fā)生性狀分離，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，所有種子都能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)，而基因型為Aa的植株自交，其后代會(huì)發(fā)生性狀分離，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上部分種子不能萌發(fā)，因此陽(yáng)性率達(dá)到100%的培養(yǎng)基中的幼苗為純合子（AA），即目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。分析題圖可知，野生型相關(guān)基因中不含限制性內(nèi)切核酸酶X的識(shí)別序列，不能被該酶切割，已知DA1基因的長(zhǎng)度為150bp，因此，野生型相關(guān)基因被限制性內(nèi)切核酸酶X切割并電泳后得到的條帶為150bp。突變型相關(guān)基因中含有限制性內(nèi)切核酸酶X的識(shí)別序列，用該酶切割后，突變基因被切割成100bp、50bp兩種DNA片段，經(jīng)電泳后得到的條帶為100bp和50bp。突變型和野生型相關(guān)基因經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶X切割并電泳后得到的結(jié)果如下圖所示。答案：（1）野生型（2）Ti質(zhì)粒啟動(dòng)子和終止子（3）①DA1基因（和卡那霉素抗性基因）②75③自交100如圖所示：考點(diǎn)三DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定[學(xué)生用書(shū)P360]1.DNA的粗提取與鑒定（1）實(shí)驗(yàn)原理。（2）方法步驟（以洋蔥為例）。[易錯(cuò)提醒]加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀物。本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核（無(wú)DNA），可選用雞血細(xì)胞作為材料。2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（1）原理。①PCR原理：DNA的熱變性原理，即通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。②電泳。（2）方法步驟。①PCR擴(kuò)增。準(zhǔn)備→移液→混合→→反應(yīng)。②鑒定PCR產(chǎn)物：瓊脂糖凝膠電泳法。配制瓊脂糖溶液→制備瓊脂糖凝膠→將電泳緩沖液加入電泳槽中→加樣→電泳→取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。[易錯(cuò)提醒]為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理；在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染；離心的目的是使掛在管壁上的液體全部甩下。[答案自填]1.（1）蛋白質(zhì)2mol/L二苯胺藍(lán)（2）4℃離心預(yù)冷的酒精二苯胺藍(lán)色2.（1）②帶電分子大小和構(gòu)象（2）①離心考向1DNA的粗提取與鑒定1.（2024·廣東一模）下列有關(guān)“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是（）A．新鮮豬血、菜花等動(dòng)植物材料均可用于DNA的粗提取B．DNA不溶于體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精而溶于2mol/L的NaCl溶液C．在研磨植物細(xì)胞時(shí)加入研磨液是為了溶解細(xì)胞壁D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后即呈藍(lán)色解析：選B。豬是哺乳動(dòng)物，其成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，不能用于提取DNA，A項(xiàng)錯(cuò)誤；DNA不溶于體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精，但能溶于2mol/L的NaCl溶液，B項(xiàng)正確；溶解植物細(xì)胞壁用纖維素酶和果膠酶，研磨時(shí)加入研磨液是為了溶解DNA并破碎細(xì)胞膜，C項(xiàng)錯(cuò)誤；DNA與二苯胺試劑混勻后需沸水浴加熱才能呈現(xiàn)藍(lán)色，D項(xiàng)錯(cuò)誤。2.下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖，下列相關(guān)敘述正確的是（）A．圖1中的絲狀物不含有DNAB．圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯C．圖1所示操作的原理是DNA溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶酒精D．圖2試管1的作用是證明物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色解析：選B。題圖1中的絲狀物就是粗提取的DNA，A項(xiàng)錯(cuò)誤；題圖2所示實(shí)驗(yàn)的試管中，溶液的液面高于燒杯中的液面，可能導(dǎo)致加熱不充分，試管2中藍(lán)色變化不明顯，B項(xiàng)正確；題圖1所示操作的原理是DNA不溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)溶于酒精，C項(xiàng)錯(cuò)誤；題圖2試管1起對(duì)照作用，目的是證明沸水浴條件下，物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色，而DNA遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色，D項(xiàng)錯(cuò)誤。考向2DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.下列關(guān)于PCR操作過(guò)程的敘述，錯(cuò)誤的是（）A．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理B．PCR利用了DNA的熱變性原理C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換解析：選C。為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理，A項(xiàng)正確；PCR利用了DNA的熱變性原理，B項(xiàng)正確；緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20℃環(huán)境中儲(chǔ)存，使用前，將所需試劑從冰箱取出，放在冰塊上緩慢融化，C項(xiàng)錯(cuò)誤；在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，以免其他成分的污染，D項(xiàng)正確。4.在基因工程操作過(guò)程中，科研人員利用識(shí)別兩種不同序列的限制酶（R1和R2）處理基因載體，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如下圖所示。以下相關(guān)敘述中，錯(cuò)誤的是（）A．該載體最可能為鏈狀DNA分子B．兩種限制酶在載體上各有一個(gè)酶切位點(diǎn)C．限制酶R1與R2的切點(diǎn)最短相距約200bpD．限制酶作用位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致磷酸二酯鍵斷裂解析：選A。當(dāng)僅用一種限制酶切割載體時(shí)，僅產(chǎn)生一種長(zhǎng)度的DNA片段，因此該載體最有可能為環(huán)狀DNA分子，A項(xiàng)錯(cuò)誤；當(dāng)僅用一種限制酶切割載體時(shí)，兩種限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段等長(zhǎng)，而兩種限制酶同時(shí)切割時(shí)則產(chǎn)生兩種長(zhǎng)度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個(gè)酶切位點(diǎn)，B項(xiàng)正確；兩種限制酶同時(shí)切割時(shí)產(chǎn)生600bp和200bp兩種長(zhǎng)度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點(diǎn)最短相距200bp，C項(xiàng)正確；限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點(diǎn)上兩個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D項(xiàng)正確。創(chuàng)設(shè)情境長(zhǎng)句特訓(xùn)[學(xué)生用書(shū)P362][事實(shí)概述類]1.質(zhì)粒載體用EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的片段如下：eq\a\vs4\al(AATTC……G,G……CTTAA)為使載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，還可用另一種限制性內(nèi)切核酸酶切割，該酶必須具有的特點(diǎn)是______________________________________________________。提示：切割產(chǎn)生的DNA片段末端與EcoRⅠ切割產(chǎn)生的末端相同2.在培育某些轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，農(nóng)桿菌的作用是____________________________________________________。提示：侵染植物，將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中[原因分析類]3.若用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，原因是________________________________。提示：未處理的大腸桿菌吸收質(zhì)粒（外源DNA）的能力極弱4.若用家蠶作為表達(dá)基因A的受體，在噬菌體和昆蟲(chóng)病毒兩種載體中，不選用作為載體，其原因是_____________________________________。提示：噬菌體噬菌體的宿主是細(xì)菌，而不是家蠶5.若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過(guò)質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是________________________________________________________________________（答出2點(diǎn)即可）。提示：目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)；目的基因無(wú)表達(dá)所需的啟動(dòng)子6.設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理（如下圖所示），請(qǐng)分別說(shuō)明理由。①第1組：______________________________________；②第2組：_______________________________________。提示：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效②引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效7.新冠病毒是一種單鏈RNA病毒，常用“熒光RT—PCR技術(shù)”進(jìn)行檢測(cè)，方法是取檢測(cè)者的mRNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，并大量擴(kuò)增時(shí)，用熒光標(biāo)記的新冠病毒核酸探針來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物中是否含有新冠病毒的cDNA，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）“熒光RT—PCR技術(shù)”所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有：、、熒光標(biāo)記的核酸探針、引物、dNTP、緩沖體系。（2）如果要同時(shí)擴(kuò)增兩種基因，則試劑盒中的引物應(yīng)該有種。下圖為新冠病毒的“ORFla0b基因”對(duì)應(yīng)的cDNA片段結(jié)構(gòu)示意圖，則與之對(duì)應(yīng)的引物結(jié)合的部位應(yīng)該是圖中的（子鏈延伸方向?yàn)槠渥陨淼?′→3′，用圖中數(shù)字作答）。若已知該基因的引物Ⅰ，能否依據(jù)其堿基序列設(shè)計(jì)出另一種引物Ⅱ？，理由是______________________________________________。提示：（1）逆轉(zhuǎn)錄酶耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）（2）44、1不能兩段引物的堿基序列沒(méi)有相關(guān)性（既不相同，也不互補(bǔ)）高考真題體驗(yàn)[學(xué)生用書(shū)P363]1.（2021·高考全國(guó)卷乙）用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過(guò)程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如下圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是。（3）DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能；質(zhì)粒DNA分子上有，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是___________________。（4）表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指__________________________。解析：（1）E.coliDNA連接酶只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來(lái)。T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。（2）DNA連接酶通過(guò)催化兩個(gè)核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，將目的基因片段與質(zhì)粒載體片段連接起來(lái)。（3）作為載體，質(zhì)粒DNA分子上必須有復(fù)制原點(diǎn)，才能使質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能進(jìn)行自我復(fù)制；質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因，可以用添加特定抗生素的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的宿主細(xì)胞，以達(dá)到篩選的目的。（4）啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，RNA聚合酶與該區(qū)域結(jié)合可驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。答案：（1）EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ（2）磷酸二酯鍵（3）自我復(fù)制一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)用添加特定抗生素的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化處理的宿主細(xì)胞（4）位于基因的上游、一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA2.（2022·廣東選擇考）“綠水逶迤去，青山相向開(kāi)?！贝罅Πl(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)已成為全社會(huì)的共識(shí)?；谀承┧缶奶厥獯x能力，有研究者以某些工業(yè)廢氣（含CO2等一碳溫室氣體，多來(lái)自高污染排放企業(yè)）為原料，通過(guò)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丙酮，構(gòu)建一種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）研究者針對(duì)每個(gè)需要擴(kuò)增的酶基因（如下圖所示）設(shè)計(jì)一對(duì)，利用PCR技術(shù)，在優(yōu)化反應(yīng)條件后擴(kuò)增得到目標(biāo)酶基因。（2）研究者構(gòu)建了一種表達(dá)載體pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因組合表達(dá)庫(kù)，經(jīng)篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動(dòng)子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是______________________________，終止子的作用是_______________________。（3）培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)重組梭菌大量表達(dá)上述酶蛋白時(shí)，出現(xiàn)了生長(zhǎng)遲緩的現(xiàn)象，推測(cè)其原因可能是______________________________，此外丙酮的積累會(huì)傷害細(xì)胞，需要進(jìn)一步優(yōu)化菌株和工藝才能擴(kuò)大應(yīng)用規(guī)模。（4）這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。從“碳中和”的角度看，該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于_______________________________，具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會(huì)效益。答案：（1）引物（2）作為標(biāo)記基因，篩選含有目的基因的受體細(xì)胞終止轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)（3）CO2等氣體用于大量合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長(zhǎng)（4）廢物的資源化不僅不排放CO2，還可以消耗工業(yè)廢氣中的CO23.（2023·山東等級(jí)考）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J－V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。（1）與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有_________________________________（答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可）。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。（3）重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了，條帶2所檢出的蛋白（填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。解析：（1）RNA聚合酶與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。作為載體必須具備的條件：要具有限制酶的切割位點(diǎn)；要有標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因），以便于重組質(zhì)粒的篩選；具有復(fù)制原點(diǎn)，能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；是安全的，對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，而且要易從供體細(xì)胞分離出來(lái)。題圖甲有啟動(dòng)子和終止子，因此質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶的切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)。（2）用PCR擴(kuò)增分析法確定重組質(zhì)粒中目的基因插入方向是否正確時(shí)，常設(shè)計(jì)一對(duì)引物，一個(gè)引物與目的基因序列互補(bǔ)，另一個(gè)引物與質(zhì)粒序列互補(bǔ)，兩引物延伸方向相反，以擴(kuò)增出兩引物間的序列，若插入方向正確，則可擴(kuò)增出相應(yīng)序列，反之，則不能擴(kuò)增出相應(yīng)序列，故選用的引物應(yīng)為F2、R1或F1、R2，若選用引物F1、R1，不論目的基因插入方向是否正確，都可擴(kuò)增出目的基因序列。b鏈?zhǔn)悄０彐?，而根?jù)題圖上啟動(dòng)子和終止子的位置可知轉(zhuǎn)錄方向是從左向右，對(duì)應(yīng)的模板鏈方向應(yīng)該是3′→5′，非模板鏈（也就是a鏈）是5′→3′；DNA復(fù)制的方向是子鏈的5′→3′，在引物基礎(chǔ)上延伸的方向是5′→3′，所以引物結(jié)合的單鏈的方向是3′→5′；題圖中F1是前引物，在左側(cè)，所以其配對(duì)的單鏈?zhǔn)?′→5′的b鏈，故其序列應(yīng)該與a鏈相應(yīng)部分的序列相同。（3）據(jù)題圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)，均出現(xiàn)條帶1，說(shuō)明條帶1是J－V5融合蛋白?？笿蛋白抗體檢測(cè)出現(xiàn)條帶2，抗V5抗體檢測(cè)不出現(xiàn)條帶2，說(shuō)明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。答案：（1）RNA聚合酶限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)（答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可）（2）F2和R1（或F1和R2）a鏈（3）J－V5融合蛋白不是課時(shí)跟蹤練[學(xué)生用書(shū)P76（單獨(dú)成冊(cè)）]一、選擇題1.用限制酶EcoRⅤ單獨(dú)切割某普通質(zhì)粒，可產(chǎn)生14kb（1kb即1000個(gè)堿基對(duì)）的長(zhǎng)鏈，而同時(shí)用限制酶EcoRⅤ和MboⅠ聯(lián)合切割該質(zhì)粒，可得到三種長(zhǎng)度的DNA片段，見(jiàn)下圖（其中*表示EcoRⅤ限制酶切割后的一個(gè)黏性末端）。若用MboⅠ限制酶單獨(dú)切割該普通質(zhì)粒，則產(chǎn)生的DNA片段的長(zhǎng)度為（）A.2.5和5.5B．2.5和6C．5.5和8D．6和8答案：D2.圖甲、圖乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因。下列敘述正確的是（）A．圖甲中的質(zhì)粒用BamHⅠ切割后，含有4個(gè)游離的磷酸基團(tuán)B．在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用PstⅠ和BamHⅠ切割質(zhì)粒和外源DNAC．用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以保證目的基因與質(zhì)粒正確連接D．導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)解析：選C。題圖甲中的質(zhì)粒只有一個(gè)BamHⅠ的切割位點(diǎn)，切割后形成一個(gè)直鏈DNA，含2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，A項(xiàng)錯(cuò)誤；據(jù)題圖乙可知，BamHⅠ的切割位點(diǎn)在目的基因上，故不能用該限制酶切割外源DNA，B項(xiàng)錯(cuò)誤；用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以保證目的基因與質(zhì)粒正確連接，C項(xiàng)正確；導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌，其重組質(zhì)粒是用PstⅠ和HindⅢ切割形成的，其中的AmpR（氨芐青霉素抗性基因）已被破壞，D項(xiàng)錯(cuò)誤。3.（2022·山東等級(jí)考）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）A．過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)解析：選B。低溫時(shí)DNA酶的活性較低，過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解，A項(xiàng)正確；離心研磨液是為了使細(xì)胞碎片沉淀，B項(xiàng)錯(cuò)誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色，C項(xiàng)正確；細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精，但也有蛋白質(zhì)不溶于酒精，在95%的冷酒精中與DNA一同析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)，D項(xiàng)正確。4.用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到如圖所示電泳圖譜，其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣（Marker），2～10號(hào)為PCR產(chǎn)物；其中2號(hào)的模板為野生型植株DNA，3～9號(hào)模板為轉(zhuǎn)基因植株的DNA，10號(hào)使用蒸餾水代替模板DNA。PCR時(shí)加入的模板DNA如上圖所示。據(jù)此做出分析不合理的是（）A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B．3號(hào)樣品植株導(dǎo)入的目的基因一定能成功表達(dá)C．9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D．10號(hào)的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有干擾解析：選B。3～9號(hào)是轉(zhuǎn)基因植株，理論上應(yīng)包含目的基因，結(jié)合2號(hào)野生型和10號(hào)蒸餾水組的結(jié)果，推測(cè)包含目的基因的片段大小應(yīng)為250～500bp，A項(xiàng)合理；3號(hào)PCR結(jié)果包含250～500bp片段，包含目的基因，但導(dǎo)入的目的基因不一定能成功表達(dá)，B項(xiàng)不合理；9號(hào)PCR結(jié)果不包含250～500bp片段，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株，C項(xiàng)合理；10號(hào)使用蒸餾水，可排除反應(yīng)體系等對(duì)結(jié)果的干擾，D項(xiàng)合理。5.（2024·湖北十堰高三模擬）下圖為農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)段結(jié)構(gòu)示意圖。農(nóng)桿菌附著植物細(xì)胞后，T-DNA首先在農(nóng)桿菌中從右邊界到左邊界被剪切、復(fù)制，然后進(jìn)入植物細(xì)胞并整合到染色體上，繼而誘發(fā)細(xì)胞異常生長(zhǎng)和分裂，形成植物腫瘤。以下有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）A．Ti質(zhì)粒存在于農(nóng)桿菌的擬核DNA之外B．植物腫瘤的形成與A、B兩個(gè)基因的表達(dá)有關(guān)C．清除植物腫瘤組織中的農(nóng)桿菌后腫瘤不再生長(zhǎng)D．利用T-DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因時(shí)需保留LB、RB序列答案：C6.（2024·梅州質(zhì)檢）為提高紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量，研究人員構(gòu)建紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因（Bapt）的超表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入紅豆杉細(xì)胞，具體流程如下圖所示。相關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）A．p1301載體上應(yīng)含有增強(qiáng)Bapt基因表達(dá)的序列B．超表達(dá)載體中應(yīng)含有潮霉素抗性基因作為標(biāo)記基因C．可使用Bapt基因制成的探針檢測(cè)過(guò)程⑤是否成功D．工廠化生產(chǎn)紫杉醇需將改造后的紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)至愈傷組織解析：選C。根據(jù)題意，研究人員構(gòu)建紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因（Bapt）的超表達(dá)載體，說(shuō)明p1301載體上可能含有增強(qiáng)Bapt基因表達(dá)的序列，A項(xiàng)正確；據(jù)題圖分析，超表達(dá)載體中應(yīng)含有潮霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上，含超表達(dá)載體的紅豆杉細(xì)胞能夠存活，從而起篩選作用，B項(xiàng)正確；由于紅豆杉細(xì)胞中本身存在Bapt基因，無(wú)論超表達(dá)載體是否成功導(dǎo)入，都能與Bapt基因探針形成雜交分子，因此不能通過(guò)Bapt基因探針來(lái)檢測(cè)過(guò)程⑤是否成功，C項(xiàng)錯(cuò)誤；工廠化生產(chǎn)的紫杉醇屬于細(xì)胞產(chǎn)物，則可培養(yǎng)到愈傷組織階段，再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)紫杉醇，D項(xiàng)正確。7.（2024·汕頭高三一模）實(shí)時(shí)熒光定量PCR可定量檢測(cè)樣本中某種DNA含量，其原理是在PCR體系中每加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處時(shí)，會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成，過(guò)程如右上圖所示。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）A．引物與探針均具特異性，與模板結(jié)合時(shí)遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則B．反應(yīng)最終的熒光強(qiáng)度與起始狀態(tài)模板DNA含量呈正相關(guān)C．若用cDNA作模板，上述技術(shù)也可檢測(cè)某基因的轉(zhuǎn)錄水平D．耐高溫的DNA聚合酶催化DNA的合成總是從子鏈的3′端向5′端延伸解析：選D。PCR中，引物是利用目的基因的一部分已知序列設(shè)計(jì)出來(lái)的，探針也是通過(guò)待測(cè)序列的一部分設(shè)計(jì)出來(lái)的，均具有特異性，且二者都是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與模板結(jié)合的，A項(xiàng)正確；由題意可知，熒光的產(chǎn)生是熒光探針被水解所致，因此起始時(shí)的模板DNA含量越高，與其結(jié)合的熒光探針就越多，擴(kuò)增時(shí)水解的探針越多，熒光就越強(qiáng)，B項(xiàng)正確；若用cDNA作模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，水解特異性熒光探針時(shí)會(huì)發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的強(qiáng)度可確定轉(zhuǎn)錄水平，C項(xiàng)正確；耐高溫的DNA聚合酶催化DNA的合成，總是從子鏈的5′端向3′端延伸，D項(xiàng)錯(cuò)誤。8.（2024·江蘇徐州質(zhì)檢）大腸桿菌pUC118質(zhì)粒是基因工程中常用的一種運(yùn)載體，具有氨芐青霉素抗性基因，該質(zhì)粒中某限制酶的唯一切點(diǎn)位于LacZ基因中。在特定的選擇培養(yǎng)基中，若LacZ基因沒(méi)有被破壞，則大腸桿菌菌落呈藍(lán)色；若LacZ基因被破壞，則菌落呈白色。關(guān)于下圖操作的敘述正確的是（）A．試管1中應(yīng)加入限制酶和DNA連接酶處理B．試管2中將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌需用Ca2＋處理C．能在氨芐青霉素培養(yǎng)基中存在的菌落均呈現(xiàn)白色D．試管3應(yīng)選擇藍(lán)色菌落內(nèi)的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)答案：B二、非選擇題9.（2023·梅州二模）二十碳五烯酸（EPA）能促進(jìn)體內(nèi)飽和脂肪酸代謝，是人體自身不能直接從頭合成但又不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。獲取EPA產(chǎn)品的主要途徑是從魚(yú)油等海洋漁業(yè)資源中提取。研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)從海洋細(xì)菌中提取了EPA合成途徑的關(guān)鍵基因pfaB，并將其導(dǎo)入酵母菌內(nèi)，通過(guò)酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)EPA，相關(guān)過(guò)程如下圖所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：注：①～④為四種引物，AmpR：大腸桿菌的篩選標(biāo)記，氨芐青霉素抗性