動(dòng)物疫病診斷技術(shù)　第2部分：α皰疹病毒-地方標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明

1《動(dòng)物疫病診斷技術(shù)第2部分：α皰疹病毒》編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況（一）任務(wù)來(lái)源本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局2022年下達(dá)的《全省標(biāo)準(zhǔn)化創(chuàng)新發(fā)展項(xiàng)目計(jì)劃的通知》立項(xiàng)，魯市監(jiān)標(biāo)函[2022]247號(hào)文件。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。馬，驢等大動(dòng)物疫病防控的權(quán)威科研人員和基層從業(yè)人員，對(duì)全省規(guī)?；i場(chǎng)，雞場(chǎng)，牛場(chǎng)，驢場(chǎng)以及馬場(chǎng)的疫病情況比較熟悉。同時(shí)，也積累了可靠的數(shù)據(jù)和具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，為此標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)。（二）起草單位、起草人及任務(wù)分工（1）起草單位聊城大學(xué)、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)、聊城市東昌府區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、青島立見(jiàn)生物科技有限公司、山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院、山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院、德州市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì)、煙臺(tái)市農(nóng)村經(jīng)濟(jì)經(jīng)營(yíng)管理站、陽(yáng)信縣畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心、山東鳳祥股份有限公司、臨沂澤潤(rùn)牧業(yè)有限責(zé)2任公司、東阿阿膠股份有限公司和隆銘牛（日照）肉牛養(yǎng)殖有限公司。（2）起草人及任務(wù)分工李亮亮：聊城大學(xué)，主持標(biāo)準(zhǔn)制定，負(fù)責(zé)匯總編寫本標(biāo)準(zhǔn)全部?jī)?nèi)容。李玉保、王彤彤、劉文強(qiáng)、王長(zhǎng)法、劉桂芹、趙霞：聊城大學(xué)，參與標(biāo)準(zhǔn)制定，負(fù)責(zé)編寫馬皰疹病毒病和雞皰疹病毒病感染相關(guān)材料。王剛：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，參與標(biāo)準(zhǔn)制定，負(fù)責(zé)編寫豬偽狂犬病相關(guān)材料。曹學(xué)香：聊城市東昌府區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，參與調(diào)研山東省內(nèi)馬皰疹病毒病流行情況。孫榮釗：青島立見(jiàn)生物科技有限公司，參與編寫豬偽狂犬病和雞皰疹病毒病相關(guān)材料。劉煥奇、任慧英、胡學(xué)遠(yuǎn)：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，參與標(biāo)準(zhǔn)制定，負(fù)責(zé)編寫牛皰疹病毒病相關(guān)材料。王志遠(yuǎn)，董建寶：山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，參與編寫豬偽狂犬病和馬皰疹病毒病相關(guān)材料。肖躍強(qiáng)：山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，參與編寫牛皰疹病毒病相關(guān)材料。申艷瑋：德州市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì)，參與調(diào)研山東省內(nèi)豬偽狂犬病和雞皰疹病毒病流行情況。劉洪明：煙臺(tái)市農(nóng)村經(jīng)濟(jì)經(jīng)營(yíng)管理站，參與調(diào)研山東省內(nèi)牛3皰疹病毒病流行情況。王玉燕：陽(yáng)信縣畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心，參與調(diào)研豬偽狂犬病和雞皰疹病毒病流行情況。徐江濤：山東鳳祥股份有限公司，參與編寫馬立克氏病相關(guān)材料。邱洪凱：臨沂澤潤(rùn)牧業(yè)有限責(zé)任公司，參與編寫豬偽狂犬病相關(guān)材料。嵇傳良、于杰：東阿阿膠股份有限公司，參與編寫馬皰疹病毒病相關(guān)材料。遲浩帥：隆銘牛（日照）肉牛養(yǎng)殖有限公司，參與編寫牛皰疹病毒病相關(guān)材料。（三）起草過(guò)程2022年11月-2023年1月標(biāo)準(zhǔn)制定小組廣泛查閱國(guó)內(nèi)外有關(guān)豬，雞，牛，馬和驢α皰疹病毒研究的相關(guān)文獻(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)和權(quán)威部門出版物，對(duì)相關(guān)研究成果進(jìn)行了全面匯總，準(zhǔn)備申報(bào)工作。2023年2月-2023年3月標(biāo)準(zhǔn)制定小組結(jié)合山東省內(nèi)規(guī)?；B(yǎng)豬企業(yè)，養(yǎng)雞企業(yè)，養(yǎng)牛企業(yè)，養(yǎng)馬企業(yè)，養(yǎng)驢企業(yè)α皰疹病毒病發(fā)生的實(shí)際情況，編制了《動(dòng)物疫病診斷技術(shù)第二部分：α皰疹病毒》草案，形成征求意見(jiàn)稿。2023年4月-2023年6月以函審的方式廣泛征求來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所，中國(guó)農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所，山東畜牧總站，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東省農(nóng)業(yè)4科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所等高校科研院所的專家和陽(yáng)谷榮發(fā)牧業(yè)，高唐縣阿多寶畜禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社等有關(guān)企業(yè)技術(shù)人員的意見(jiàn)，先后發(fā)出30條，回函的單位或?qū)＜覕?shù)為22個(gè)，通過(guò)意見(jiàn)反饋，進(jìn)行對(duì)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容和編制說(shuō)明進(jìn)一步修改和完善，形成送審稿。2023年7月-2023年9月，進(jìn)行企業(yè)回歸驗(yàn)證；9月7日在省畜牧局在濟(jì)南召開了山東省地方標(biāo)準(zhǔn)組織專家審查會(huì)議，省市場(chǎng)監(jiān)督管理局對(duì)審查會(huì)進(jìn)行監(jiān)督指導(dǎo)，來(lái)自山東師范大學(xué)、山東省動(dòng)物疾病與控制中心等單位的9名專家提出標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容刪減，格式修改等意見(jiàn)，起草小組根據(jù)審查意見(jiàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行修改完善，審查委員會(huì)對(duì)修改內(nèi)容確認(rèn)無(wú)誤，最終形成報(bào)批稿。二、地方標(biāo)準(zhǔn)制定目的和意義皰疹病毒（herpesviruses）是一類有囊膜、基因組為雙鏈DNA的病毒。主要分為α皰疹病毒、β皰疹病毒、γ皰疹病毒3種亞型。其中α皰疹病毒對(duì)動(dòng)物的危害程度最大。該類病毒宿主廣泛，包括豬、雞、牛、馬和驢等多種動(dòng)物，且在國(guó)內(nèi)外均有分布。隨著國(guó)內(nèi)畜牧業(yè)規(guī)?；⒓s化發(fā)展，畜禽疫病發(fā)病率逐年上升，疫病防控仍是現(xiàn)階段的一大難題。動(dòng)物疫病的診斷作為動(dòng)物疫病防控的重要組成部分，是控制疫病發(fā)生的主要手段。因此，針對(duì)主要?jiǎng)游镆卟〉牟≡贫ㄏ鄳?yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，有利于推動(dòng)相關(guān)動(dòng)物疫病的監(jiān)測(cè)與管理，尤其是疫病診5斷標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，可降低疫病在本區(qū)發(fā)生概率。山東作為國(guó)內(nèi)畜牧業(yè)生產(chǎn)大省，生豬、雞、牛、以及特色畜種驢、馬的飼養(yǎng)量年位居全國(guó)前列。近年來(lái)，以豬偽狂犬病毒，雞皰疹病毒2型，牛皰疹病毒1型，以及馬皰疹病毒1/4/8型為代表的α皰疹病毒在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)肆虐，給畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)巨大牛皰疹病毒1型，以及馬皰疹病毒1/4/8型制定診斷標(biāo)準(zhǔn)，用于指導(dǎo)基層生產(chǎn)實(shí)踐。本文件旨在規(guī)定豬、雞、牛以及馬屬動(dòng)物皰疹病毒的臨床特征和實(shí)驗(yàn)室診斷方法?？捎糜谥笇?dǎo)規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場(chǎng)該類病毒的診斷和檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)的制定和推廣應(yīng)用有助于在規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)有效診斷該病，做到及早發(fā)現(xiàn)，盡早采取干預(yù)措施，減少經(jīng)濟(jì)損失，以利于提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，增加企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。有利于提高我省對(duì)該類動(dòng)物皰疹病的綜合防治水平，最終推動(dòng)我省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。綜上所述，根據(jù)前期山東省多地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)α皰疹病毒發(fā)病率統(tǒng)計(jì)，基于養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全規(guī)范和預(yù)防為主的原則，有針對(duì)性制定《動(dòng)物疫病診斷技術(shù)第二部分：α皰疹病毒》的地方標(biāo)準(zhǔn)，涵蓋偽狂犬病毒，雞皰疹病毒2型，牛皰疹病毒1型以及馬皰疹病毒1/4/8型等的診斷方法，來(lái)規(guī)范規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)該類病毒的診斷與防控，最大限度地減少此類皰疹病毒感染造成的巨大危害，提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效6三、地方標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定起草，主要遵循：先進(jìn)性、規(guī)范性、實(shí)用性、統(tǒng)一性和協(xié)調(diào)性等原則。結(jié)合山東省規(guī)模化畜禽場(chǎng)豬偽狂犬病，雞馬立克氏病，牛傳染性鼻氣管炎，馬鼻肺炎等發(fā)病情況，特編制針對(duì)豬，牛和馬，驢皰疹病毒的診斷技術(shù)規(guī)范，填補(bǔ)了我省這方面的空白。同時(shí)對(duì)于基層臨床疾病的防控具有指導(dǎo)意義。（二）主要技術(shù)內(nèi)容1.術(shù)語(yǔ)與定義本標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。2.1豬偽狂犬病該病由豬偽狂犬病毒（Porcinepseudorabiesvirus，PRV）引起豬的一種急性傳染病。豬是偽狂犬病毒的貯存宿主，患病豬、帶毒豬以及帶毒鼠類為本病重要傳染源。本病最主要的傳播途徑為空氣傳播，另外，在豬群中也存在鼻分泌物傳播為狂犬病毒的現(xiàn)象。該病流行具有季節(jié)性，常發(fā)生在寒冷的季節(jié)。2.2雞馬立克氏病7該病由雞皰疹病毒2型（GallidAlphaherpesvirus2，GaHV-2即馬立克氏病病毒（Marek’sdiseasevirus,MDV）引起雞的一種淋巴細(xì)胞增生性疾病。病雞和帶毒雞是傳染來(lái)源，本病主要通過(guò)空氣傳播，另外污染的飼料和飲水，以及飼養(yǎng)人員流動(dòng)也可傳播帶毒。本病主要是2-5月齡雞常發(fā)。2.3牛傳染性鼻氣管炎引起牛的一種接觸性傳染病。病牛和帶毒牛是主要傳染源，病毒主要存在于鼻、眼、陰道分泌物和排泄物中。本病主要由飛沫經(jīng)呼吸道傳播，另外可通過(guò)生殖道黏膜、眼結(jié)膜傳播。該病常發(fā)于秋、冬寒冷季節(jié)。2.4馬鼻肺炎type,EHV-1/4/8）感染引起的一種急性、熱性傳染病。該病的主要傳染源是病馬或驢和恢復(fù)后的帶毒馬或驢,病毒可存在于患病動(dòng)物的血液、鼻液及流產(chǎn)的胎膜和胎兒組織中,部分公馬或驢的精液中也可帶毒。本病主要經(jīng)呼吸道傳染，另外，消化道及交配也可傳染。該病多發(fā)生于秋冬和早春。3.1臨床診斷3.1.1豬偽狂犬病該病的潛伏期一般為2～6天，剛配種的母豬發(fā)病時(shí)易出現(xiàn)8隱形流產(chǎn)；母豬發(fā)病早期無(wú)顯著癥狀，妊娠母豬分娩前或后1周出現(xiàn)食欲下降甚至廢絕，且出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)，產(chǎn)死胎或弱胎；公豬出現(xiàn)睪丸萎縮、陰囊腫大，精子活力低。哺乳仔豬感染以后出現(xiàn)高熱，抽搐、震顫和共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀。3.1.2雞馬立克氏病該病的潛伏期一般為3～4周，可根據(jù)皰疹病毒侵害部位的不同分為四種類型。①神經(jīng)型患病雞出現(xiàn)站立不穩(wěn)，呈“劈叉”姿勢(shì)，為典型癥狀。翅膀下垂；低頭或斜頸等。②內(nèi)臟型常見(jiàn)于50～70日齡的雞，病雞精神萎頓，食欲減退，消瘦，羽毛松亂，雞冠蒼白或黑紫色、皺縮，伴有黃白色或黃綠色下痢常因脫水導(dǎo)致死亡。③眼型病雞出現(xiàn)瞳孔縮小，虹膜邊緣不整齊，顏色常為灰白色。輕者對(duì)光線強(qiáng)度的反應(yīng)遲鈍，重者失明。④皮膚型病雞常出現(xiàn)毛囊腫大或皮膚結(jié)節(jié)。3.1.3牛傳染性鼻氣管炎本病潛伏期為7天左右，將本病根據(jù)皰疹病毒侵害部位的不同分為四種類型：①呼吸道型病牛體溫升至40℃以上，鼻粘膜充血，出現(xiàn)散發(fā)性小膿皰，出現(xiàn)咳嗽，呼吸困難，咽下障礙。②結(jié)膜角膜炎型病牛出現(xiàn)結(jié)膜和角膜充血，眼瞼腫大，流淚，角膜渾濁，有壞死性斑點(diǎn)。9③生殖器型母牛病牛體溫升高，精神沉郁，食欲廢絕，外陰腫脹有小膿皰；出現(xiàn)子宮炎導(dǎo)致流產(chǎn)，產(chǎn)死胎。公牛感染出現(xiàn)傳染性膿皰型包皮龜頭炎，喪失配種能力。④腦膜炎型以6月齡以內(nèi)的犢牛已發(fā)，體溫升高，出現(xiàn)驚厥，共濟(jì)失調(diào)，角弓反張等現(xiàn)象。3.1.4馬鼻肺炎本病潛伏期為2-10天左右，主要導(dǎo)致馬屬動(dòng)物出現(xiàn)鼻肺炎，孕畜流產(chǎn)，以及神經(jīng)癥狀?；疾?dòng)物初期體溫升高，流鼻液，鼻黏膜，眼結(jié)膜充血，下頜淋巴結(jié)腫大，同時(shí)血液中白細(xì)胞數(shù)量明顯減少，感染嚴(yán)重者因呼吸困難而死亡。孕馬或驢出現(xiàn)流產(chǎn)，或驢駒死亡。以1～2歲馬或驢多發(fā),3歲后呈隱性感染。3.2實(shí)驗(yàn)室診斷3.2.1豬偽狂犬病病料樣品采集采集患病豬的鼻拭子、血液、肺組織、淋巴結(jié)、腦和扁桃體等組織，參考NY∕T541要求進(jìn)行。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)與電泳分析取200uL鼻拭子或病料組織的上清液借助商品化試劑盒制備DNA，鑒于PRV的檢測(cè)需要鑒別是自然野毒感染還是人工疫苗免疫。利用特異性引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列參見(jiàn)表1，其中g(shù)E引物用于野毒鑒別，gB引物用于常規(guī)檢測(cè)）,具體操作步驟參照附錄A。目的片段大小為368bp或480bp。名稱片段大小PRV-gE-FTTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG368bpPRV-gE-RTTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCAPRV-gB-FAGGTGTCGTTGGTGGTGT480bpPRV-gB-RACGGCGACCTGGACG實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)鑒于PRV的檢測(cè)需要區(qū)分野毒感染還是疫苗免疫，以純化的DNA為模版，利用特異性引物分別進(jìn)PCR（引物序列參見(jiàn)表2，gE引物用于鑒別野毒，gB引物用于常規(guī)檢測(cè)）,qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。9表2.熒光定量PCR引物信息9名稱片段大小qPRV-gE-FCTGTACGTGCTCGTGATGACqPRV-gE-RCTCCTTGRTGACCGTGACGqPRV-gB-FGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATqPRV-gB-RACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC野毒分離與檢測(cè)：將判定為豬偽狂犬病陽(yáng)性的腦，肺臟或淋巴結(jié)等病料借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，5000rpm/min離心10min。收集上清借助0.22μm濾膜除菌后，接種至PK-15細(xì)胞中，同時(shí)添加1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素，設(shè)置空白對(duì)照組。37℃吸附后1h，換成3%FBSDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3d～5d，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析：①將PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進(jìn)行分析，參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，若待測(cè)樣品中擴(kuò)增出片段大小分別368bp或480bp符合預(yù)期，且空白對(duì)照沒(méi)有條帶，將陽(yáng)性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測(cè)序，若測(cè)序的序列與NCBI公布的標(biāo)準(zhǔn)序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可以確診為豬偽狂犬病毒感染陽(yáng)性，否則判定為陰性。②qRT-PCR結(jié)果顯示待檢測(cè)樣品Ct值大于35且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線時(shí)判定為陰性，Ct值小于35且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線時(shí)判定為陽(yáng)性。③若PK-15細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落。需進(jìn)一步收取細(xì)胞提取DNA，借助上述特異性引物，進(jìn)行PCR或qRT-PCR檢測(cè)和測(cè)序確定，若易感細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。3.2.2雞馬立克氏病采集病料樣品采集患病雞的血液、淋巴組織、脾臟組織或腫瘤細(xì)胞或羽髓勻漿等，參考NY∕T541要求進(jìn)行。PCR檢測(cè)與電泳分析將待測(cè)病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模版，借助特異性引物（序列參見(jiàn)表3）進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進(jìn)行電泳分析,目的片段大小為434bp。qRT-PCR檢測(cè)以純化的DNA為模版，利用特異性引物分別進(jìn)qRT-PCR檢測(cè)（序列參見(jiàn)表3）,qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。表3.引物信息名稱片段大小MDV073-FATTTGATTCAGATTTTGTTTCT360bpMDV073-RGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCqMDV073-FGTTTCTCCAGATTCCACCTC213bpqMDV073-RTGCAACAATGCGTTCTTAT野毒分離與檢測(cè)：將判定為雞皰疹病毒2型陽(yáng)性的病料組織借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，5000rpm/min離心10min。收集上清借助0.22μm濾膜除菌后，接種至雞胚胎纖維細(xì)胞（DF-1）中，同時(shí)添加1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素，設(shè)置空白對(duì)照組。37℃吸附后1h，換成3%FBSDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3d～5d，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析①PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進(jìn)行分析，參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，若待測(cè)樣品中擴(kuò)增出片段大小分別434bp符合預(yù)期，且空白對(duì)照沒(méi)有條帶，將陽(yáng)性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測(cè)序，若測(cè)序的序列與NCBI公布的標(biāo)準(zhǔn)序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可以確診為雞皰疹病毒2型感染陽(yáng)性，否則判定為陰性。②qRT-PCR結(jié)果顯示待檢測(cè)樣品Ct值大于35且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線時(shí)判定為陰性，Ct值小于35且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線時(shí)判定為雞皰疹病毒2型感染陽(yáng)性。并最終全部脫落。需進(jìn)一步收取細(xì)胞提取DNA，借助上述特異性引物，進(jìn)行PCR或qRT-PCR檢測(cè)和測(cè)序確定，若易感細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。3.2.3牛傳染性鼻氣管炎病料樣品采集采集鼻拭子，血液，流產(chǎn)胎兒肺臟，生殖道分泌物等病料，按NY∕T541要求進(jìn)行。PCR檢測(cè)將待測(cè)病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模版，借助特異性引物（序列參見(jiàn)表4）進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進(jìn)行電泳分析,目的片段大小為479bp。qRT-PCR檢測(cè)以純化的DNA為模版，利用特異性引物分別進(jìn)qRT-PCR檢測(cè)（序列參見(jiàn)表4）,qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。4表4.引物信息4名稱片段大小BoHV-1gB-FTACGACTCGTTCGCGCTCTCBoHV-1gB-RGGTACGTCTCCAAGCTGCCCqBoHV-1gB-FCTGGCACACGACGGACGATGqBoHV-1gB-FCGCCTCCACTTCTTCCACGATG野毒分離與檢測(cè)：將判定為牛皰疹病毒1型陽(yáng)性的組織病料借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，5000rpm/min離心10min。取上清用0.22μm濾膜除菌后，接種至牛腎細(xì)胞（MDBK）中，同時(shí)加入1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素，設(shè)置空白對(duì)照組。37℃吸附后1h，換成3%FBSDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3d～5d，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析①PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進(jìn)行分析，參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，若待測(cè)樣品中擴(kuò)增出片段大小為479bp，符合預(yù)期，且空白對(duì)照沒(méi)有條帶，將陽(yáng)性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測(cè)序，若測(cè)序的序列與NCBI公布的標(biāo)準(zhǔn)序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可以確診為牛皰疹病毒1型感染陽(yáng)性，否則判定為陰性。②qRT-PCR結(jié)果顯示待檢測(cè)樣品Ct值大于35且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線時(shí)判定為陰性，Ct值小于35且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線時(shí)判定為牛皰疹病毒1型感染陽(yáng)性。③若MDBK細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落。需進(jìn)一步收取細(xì)胞提取DNA，借助上述特異性引物，進(jìn)行PCR或qRT-PCR檢測(cè)和測(cè)序確定，若易感細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。3.2.4馬鼻肺炎病料樣品采集采集鼻拭子，血液，馬或驢的流產(chǎn)胎盤，肺臟和腦等病料組織，按NY∕T541要求進(jìn)行。PCR檢測(cè)將待測(cè)病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模版，借助特異性引物（序列參見(jiàn)表5）進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進(jìn)行電泳分析,目的片段大小為792bp,482bp或316bp。表5.PCR名稱片段大小EHV-1gB-FGAACCTCAGCCAACCCAEHV-1gB-RGCACTTTGCGGACGAACEHV-4gB-FTTGCCGCAACTCGCTCGTCAAG482bpEHV-4gB-FCTTAATCGCATTTAGACCGAEHV-8gG-FTCAGACTGTCACTCGTGGGAEHV-8gG-RCCTGAAGGCCGTTTAACACAqRT-PCR檢測(cè)：以純化的DNA為模版，利用特異性引物分別進(jìn)qRT-PCR檢測(cè)（序列參見(jiàn)表6）,qRT-PCR具體操作步驟參照附錄B。表6.qRT-PCR引物信息名稱片段大小qEHV-1gB-FGCCATACGTCCCTGTCCGACAA302bpqEHV-1gB-RCCTCCACCTCCTCGACGATGCqEHV-4gB-FCGCAGAGGATGGAGACTTTTACAqEHV-4gB-FCATGACCGTGGGGGTTCAAqEHV-8gG-FGACGCGTAACGTTGGATGTGqEHV-8gG-RAATGTAACGTTTGCCCACGC野毒分離與檢測(cè)：將判定為馬皰疹病毒（EHV-1/4/8）陽(yáng)性的組織病料借助研磨儀勻漿后，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，5000rpm/min離心10min。取上清用0.22μm濾膜除菌后，接種至兔腎細(xì)胞（RK-13）中，同時(shí)加入1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素，設(shè)置空白對(duì)照組。37℃吸附后1h，換成3%FBSDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3d～5d，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。數(shù)據(jù)處理分析：①PCR產(chǎn)物借助1.0%核酸膠進(jìn)行分析，參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，若待測(cè)樣品中擴(kuò)增出片段大小為792bp,482bp或316bp，符合預(yù)期，且空白對(duì)照沒(méi)有條帶，將陽(yáng)性片段克隆至pMD-18T載體，送生物公司測(cè)序，若測(cè)序的序列與NCBI公布的標(biāo)準(zhǔn)序列（參考附錄C）同源性大于95%，則可以確診為EHV-1，EHV-4或EHV-8感染陽(yáng)性，否則判定為陰性。②qRT-PCR結(jié)果顯示待檢測(cè)樣品Ct值大于35且無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線時(shí)判定為陰性，Ct值小于35且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線時(shí)判定為馬皰疹病毒1型，馬皰疹病毒4型或馬皰疹病毒8型感染陽(yáng)性。并最終全部脫落。需進(jìn)一步收取細(xì)胞提取DNA，借助上述特異性引物，進(jìn)行PCR或qRT-PCR檢測(cè)和測(cè)序確定，若易感細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳3代，若盲傳后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，則判定為未分離到病毒。3.2.5綜合判定若患病動(dòng)物（豬，雞，牛，馬或驢）出現(xiàn)呼吸困難，流產(chǎn)和神經(jīng)癥狀等，則可判定為疑似α皰疹病毒感染，需借助PCR，熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，最后結(jié)合病原分離和測(cè)序等方法進(jìn)行確診。（三）確定依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)成員主要針對(duì)豬偽狂犬病病毒（PRV），雞皰疹病毒2型（GaHV-2），牛皰疹病毒1型（BoHV-1）以及馬皰疹病毒1型，4型或8型（EHV-1/4/8）等α皰疹病毒診斷開展系統(tǒng)的研究。1.病毒的基因組和復(fù)制特點(diǎn)PRV，GaHV-2，BoHV-1，和EHV-1/4/8同屬于α皰毒亞科，是該病毒屬中基因組最短的病毒亞科。基因組大小在125kb左右。主要特點(diǎn)是宿主范圍廣，病毒復(fù)制周期短，增殖速度較快，易誘發(fā)細(xì)胞病變，并在周圍神經(jīng)系統(tǒng)潛伏感2.流行特點(diǎn)和致病性PRV）引起豬的一種急性傳染病。豬是偽狂犬病毒的貯存宿主，患病豬、帶毒豬以及帶毒鼠類為本病重要傳染源。本病最主要的傳播途徑為空氣傳播，另外，在豬群中也存在鼻分泌物傳播為狂犬病毒的現(xiàn)象。該病流行具有季節(jié)性，常發(fā)生在寒冷的季節(jié)。該病主要導(dǎo)致發(fā)熱及腦脊髓炎，成年豬表現(xiàn)為一種亞臨診感染；妊娠母豬可見(jiàn)流產(chǎn)、死胎；育肥豬可見(jiàn)呼吸困難；仔豬以神經(jīng)癥狀為主。Alphaherpesvirus2，GaHV-2）引起雞的一種淋巴組織增生性疾病。病雞和帶毒雞是傳染來(lái)源，本病主要通過(guò)空氣傳播，另外污染的飼料和飲水，以及飼養(yǎng)人員流動(dòng)也可傳播帶毒。本病主要是2-5月齡雞常發(fā)。該病主要導(dǎo)致雞外周神經(jīng)、內(nèi)臟器官、肛膜、肌肉及皮膚內(nèi)發(fā)生淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)，并發(fā)展成淋巴瘤。從而造成雞肢體麻痹、不食、拉稀、脫水、貧血等癥狀。2.3牛傳染性鼻氣管炎：該病由牛皰疹病毒1型（Bovineherpesvirus1，BoHV-1）引起牛的一種接觸性傳染病。病牛和帶毒牛是主要傳染源，病毒主要存在于鼻、眼、陰道分泌物和排泄物中。本病主要由飛沫經(jīng)呼吸道傳播，另外可通過(guò)生殖道黏膜、眼結(jié)膜傳播。該病常發(fā)于秋、冬寒冷季節(jié)。該病導(dǎo)致牛出現(xiàn)呼吸道及氣管黏膜發(fā)炎、呼吸困難、流鼻汁等癥狀，還可引起生殖道感染、結(jié)膜炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)、乳房炎等多種病型。herpesvirustype,EHV-1/4/8）感染引起的一種急性、熱性傳染病。該病的主要傳染源是病馬或驢和恢復(fù)后的帶毒馬或驢,病毒可存在于患病動(dòng)物的血液、鼻液及流產(chǎn)的胎膜和胎兒組織中,部分公馬或驢的精液中也可帶毒。本病主要經(jīng)呼吸道傳染，另外，消化道及交配也可傳染。該病多發(fā)生于秋冬和早春。該病主要導(dǎo)致馬屬動(dòng)物出現(xiàn)呼吸道癥狀，孕馬或驢流產(chǎn)，神經(jīng)癥狀等。3.前期相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)比對(duì)GenBank公布的PRV，GaHV-2，BoHV-1，和EHV-1/4/8等多株。發(fā)現(xiàn)PRV的gE和gB蛋白基因序列相對(duì)保守，而且臨床上主要應(yīng)用PRV-gE基因缺失疫苗，該疫苗免疫雖能阻止臨床發(fā)病,但難以完全阻止野毒感染。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)GaHV-2的MDV073基因比較保守。和EHV-8的保守區(qū)域設(shè)定特異性PCR引物（詳見(jiàn)表1）和qPCR引物（詳見(jiàn)表2）。TTTGAATTCTTACGACACGATTTGATTCAGATTTTGTTACAAGTTCAAGGCCCACATC為了驗(yàn)證本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)引物的有效性，我們分別借助普通PCR引物分別現(xiàn)存的病毒進(jìn)行檢測(cè)和規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)采集的待測(cè)血樣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如下：3.1PRV檢測(cè)引物有效性測(cè)試，臨床樣本檢測(cè)，病原分離與①PRVgE引物濃度篩選圖1.PCR擴(kuò)增及引物濃度篩選.1-5：引物濃度分別為10.0μM、5.0μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、6：陰性對(duì)照②PRVDNA倍比稀釋PRVgE引物用10.0μM，對(duì)提取病配置相同PCR體系，不同稀釋度模板體積等量）。圖2.引物PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果.1-5：DNA濃度分別為10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,6：陰性對(duì)照③PRVgB引物濃度篩選圖3.PCR擴(kuò)增及引物濃度篩選.1-5：引物濃度分別為10.0μM、5.0μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、6：陰性對(duì)照④PRVDNA倍比稀釋PRVgB引物用10.0μM，對(duì)提取病配置相同PCR體系，不同稀釋度模板體積等量）。圖4.引物PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果.1-5：DNA濃度分別為10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,6：陰性對(duì)照。⑤豬場(chǎng)臨床血液樣品檢測(cè)借助DNA提取試劑盒獲取將收集血液樣品的DNA，以此為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖5.臨床血樣檢測(cè)，1為陰性對(duì)照，2-9為待測(cè)豬血樣⑥臨床血液樣品測(cè)序比對(duì)圖6.MDV測(cè)序比對(duì)結(jié)果⑦野毒分離和鑒定易感細(xì)胞MDBK出現(xiàn)CPE，即細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉絲，并最終全部脫落（圖7）。進(jìn)一步收取細(xì)胞提取DNA，借助特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖7.PRV野毒分離與PCR鑒定⑧實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)圖8.gE基因qPCR檢測(cè)圖9.gB基因qPCR檢測(cè)3.2GaHV-2檢測(cè)引物有效性測(cè)試，臨床樣本檢測(cè)，病原分離與鑒定①GaHV-2MDV073引物濃度篩選②GaHV-2DNA倍比稀釋GaHV-2MDV073引物用10.0μM，對(duì)提取病毒DNA模板進(jìn)行10倍數(shù)稀釋10-1，10-2,10-3,-4-5，配置相同PCR體系，不同稀釋度模板體積圖11.GaHV-2引物PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果.1-5：DNA濃度分別為10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,6：陰性對(duì)照。③雞場(chǎng)臨床血液樣品檢測(cè)：將待測(cè)血樣分別借助DNA提取試劑盒獲取將收集血液樣品的DNA，以此為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖12.PCR擴(kuò)增檢測(cè)臨床部分臨床血樣，1為陰性對(duì)照，2-20為血清樣品。④臨床血液樣品測(cè)序比對(duì):選取PCR陽(yáng)性的樣品，將其克隆至pMD18-T載體送華大基因測(cè)序。圖13.序列比對(duì)分析⑤野毒分離和鑒定將組織病料粉碎過(guò)濾后，接種DF-1細(xì)胞，48h后，觀察細(xì)胞結(jié)果如圖15所示。分別收取細(xì)胞樣品提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖14.雞皰疹野毒2型分離與PCR鑒定⑥實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)15.雞皰疹野毒2型MDV073基因qPCR檢測(cè)3.3BoHV-1檢測(cè)引物有效性測(cè)試，臨床樣本檢測(cè)，病原分離與鑒定①BoHV-1gB引物濃度篩選M、0.625μM；6：陰性對(duì)照配置相同PCR體系，不同稀釋度模板體積等量）。圖17.BoHV-1引物PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果.1-5：DNA濃度分別為10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,6：陰性對(duì)照。③牛場(chǎng)臨床血液樣品檢測(cè)將待測(cè)血樣分別借助DNA提取試劑盒獲取將收集血液樣品的DNA，以此為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖18.PCR擴(kuò)增檢測(cè)臨床部分臨床血樣，1為陰性對(duì)照，2-20為血清樣品。④臨床血液樣品測(cè)序比對(duì)選取PCR陽(yáng)性的樣品，將其克隆至pMD18-T載體送華大基因測(cè)序。圖19.序列比對(duì)分析⑤野毒分離和鑒定將組織病料粉碎過(guò)濾后，接種MDBK細(xì)胞，48h后，觀察細(xì)胞結(jié)果如圖20所示。分別收取細(xì)胞樣品提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖20.牛皰疹1型野毒分離與PCR鑒定⑥實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)圖21.BoHV-1gB基因qPCR檢測(cè)3.3EHV-1/EHV-4/EHV-8檢測(cè)引物有效性測(cè)試，臨床樣本檢測(cè)，病原分離與鑒定①EHV-1/EHV-4/EHV-8引物濃度篩選②EHV-1/EHV-4/EHV-8DNA倍比稀釋相應(yīng)的引物為10.0-4，10-5，配置相同PCR體系，不同稀釋度模板體積等量。-2,-3,-4,-5,③EHV-1/EHV-4/EHV-8臨床血液樣品檢測(cè)將待測(cè)血樣分別借助DNA提取試劑盒獲取將收集血液樣品的DNA，以此為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。④測(cè)序分析選取PCR陽(yáng)性的樣品，將其克隆至pMD18-T載體送華大基因測(cè)序。⑤野毒分離與鑒定將組織病料粉碎過(guò)濾后，接種RK-13細(xì)胞，48h后，觀察細(xì)胞結(jié)果如圖26所示。分別收取細(xì)胞樣品提取DNA，借助不同病原引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。⑥EHV-1/EHV-4/EHV-8實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢圖27.EHV-1/EHV-4/EHV-8的qPCR檢測(cè)本標(biāo)準(zhǔn)制定的皰疹病毒診斷方法涵蓋普通PCR和熒光定上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)本標(biāo)準(zhǔn)提供的PCR和定量PCR檢測(cè)引物和方法具有良好的敏感性、特異性、以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，等病原的早期檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種有效的規(guī)范參EHV-1/EHV-4/EHV-8野毒分離的方法，為病原的檢測(cè)和溯源分析奠定基礎(chǔ)。4.第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)驗(yàn)證結(jié)論本標(biāo)準(zhǔn)涉及檢測(cè)內(nèi)容分別由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所檢測(cè)中心，山東潤(rùn)達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司，和冠縣冠康動(dòng)物檢測(cè)服務(wù)有限公司等3家檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。檢測(cè)結(jié)果均與《動(dòng)物疫病診斷技術(shù)第2部分：α皰疹病毒》編制說(shuō)明提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)保持一致（詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)附件）。三、制定本標(biāo)準(zhǔn)的主要依據(jù)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T18641偽狂犬病診斷方法GB/T18643雞馬立克氏病診斷技術(shù)GB/T16548病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程GB/T27621馬鼻肺炎病毒的PCR檢測(cè)方法NY∕T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范NY/T575牛傳染性鼻氣管炎診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)編制團(tuán)隊(duì)成員參考上述相應(yīng)的診斷技術(shù)等研究成果，并結(jié)合我省規(guī)?；i、雞、牛、馬或驢養(yǎng)殖場(chǎng)α皰疹病毒發(fā)病和流行情況。同時(shí)走訪山東省不同地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)，調(diào)查當(dāng)?shù)刎i，雞，牛，馬以及驢的疾病發(fā)生情況，采集血樣、鼻拭子以及流產(chǎn)病料等進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，分別分株α皰疹病毒野毒，經(jīng)過(guò)了規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖企業(yè)的回歸實(shí)踐檢驗(yàn)。匯總分析試驗(yàn)研究，充分考慮我省規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場(chǎng)主要疫病的發(fā)生情況，力求達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容符合實(shí)際、可操作性強(qiáng)。編制標(biāo)準(zhǔn)所依據(jù)的參考文獻(xiàn)主要是最近5年來(lái)在《VirologicaSinica》、《JournalofVeterinaryScience》、《JVirolMethods》、《動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》以及《新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)》等國(guó)內(nèi)外該領(lǐng)域頂尖期刊上發(fā)表的有關(guān)研究論文和成果，代表了針對(duì)偽狂犬病，雞馬立克氏病，牛傳染性鼻氣管炎，馬鼻肺炎的最新進(jìn)展，充分體現(xiàn)了動(dòng)物皰疹病毒診斷制定的科學(xué)性、必要性和合理性。四、與現(xiàn)行相關(guān)法律、行政法規(guī)和其他標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)是以《中華人民共和國(guó)畜牧法》、《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》等為基礎(chǔ)，參考《GB/T18641偽狂犬病診斷18643雞馬立克氏病診斷技術(shù)》,《GB/T16548病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程》和《病死及病害動(dòng)物無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范》（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]25號(hào)）等標(biāo)準(zhǔn)而制定，與現(xiàn)行有關(guān)法律、法規(guī)和國(guó)家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)抵觸關(guān)系。國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)相關(guān)法律、法規(guī)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。五、重大分歧意見(jiàn)的處理過(guò)程、處理意見(jiàn)及其依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)無(wú)重大分歧意見(jiàn)六、對(duì)地方標(biāo)準(zhǔn)自發(fā)布日期至實(shí)施日期之間的過(guò)渡期的建議及理由本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后，為了有效貫徹實(shí)施之，建議有關(guān)部門加強(qiáng)實(shí)施推廣，使相關(guān)人員充分了解標(biāo)準(zhǔn)的各項(xiàng)條款，改變目前我省畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)α皰疹病毒診斷與防控過(guò)程中各個(gè)環(huán)節(jié)存在的無(wú)標(biāo)可依的現(xiàn)狀。七、其他需要說(shuō)明的內(nèi)容提出部門（蓋章）參考文獻(xiàn)：[1].WernikeK,BeerM,FreulingCM,KluppB,MettenleiterTC,MüllerT,etal.Moleculardouble-checkstrategyfortheidentificationandcharacterizationofSuidherpesvirus1.JVirolMethods.2014;209:110-5.[2].RenQ,RenH,GuJ,WangJ,JiangL,GaoS.TheEpidemiologicalAnalysisofPseudorabiesVirusandPathogenicityoftheVariantStraininShandongProvince.FrontVetSci.2022;9:806824.[3].MaZ,HanZ,LiuZ,MengF,WangH,CaoL,etal