新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范 第20部分：核酸熒光PCR法質(zhì)量控制

DB32/T3762.20—2022

目次

前言................................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3術(shù)語和定義........................................................................1

4實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)........................................................................1

5生物安全防護(hù)......................................................................2

6質(zhì)量管理體系文件..................................................................2

7人員..............................................................................2

8環(huán)境設(shè)施..........................................................................2

9儀器設(shè)備和供應(yīng)品..................................................................3

10檢測樣本.........................................................................3

11性能驗(yàn)證.........................................................................4

12內(nèi)部質(zhì)量控制.....................................................................4

13外部質(zhì)量控制.....................................................................4

14實(shí)驗(yàn)環(huán)境消毒與廢棄物處理.........................................................5

I

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新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范

第20部分：核酸熒光PCR檢測質(zhì)量控制

1范圍

本文件規(guī)定了新型冠狀病毒核酸熒光PCR檢測實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)、生物安全防護(hù)、質(zhì)量管理體系

文件、人員、環(huán)境設(shè)施、儀器設(shè)備和供應(yīng)品、檢測樣本、性能驗(yàn)證、內(nèi)部質(zhì)量控制、外部質(zhì)量控制以及

實(shí)驗(yàn)環(huán)境消毒與廢棄物處理方面的通用要求。

本文件適用于新型冠狀病毒核酸熒光PCR檢測的質(zhì)量控制。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

RB/T214檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評價(jià)檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)通用要求

CNAS-CL02醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則

全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程原中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

熒光PCRreal-timefluorescencePCR

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，

結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣本模板的初始濃度，用于鑒別病原微生物。

3.2

質(zhì)量控制qualitycontrol

為達(dá)到質(zhì)量要求所采取的作業(yè)技術(shù)和活動(dòng)。

3.3

內(nèi)部質(zhì)量控制internalqualitycontrol

實(shí)驗(yàn)室為持續(xù)監(jiān)控測量過程和測量結(jié)果以確定結(jié)果是否足夠可靠達(dá)到可以發(fā)布的程度而采取的一

組操作。

4實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)

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生物安全二級實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）應(yīng)向設(shè)區(qū)的市級人民政府衛(wèi)生主管部門備案，臨床檢測機(jī)構(gòu)基因擴(kuò)

增實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)取得“臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室”資質(zhì)，并在核定的范圍內(nèi)開展工作。

5生物安全防護(hù)

未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作在采用可靠方法滅活前進(jìn)行核酸提取及樣本滅活等操作，應(yīng)在

BSL-2進(jìn)行，同時(shí)采用生物安全三級實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）的個(gè)人防護(hù)，配備N95及以上級別防護(hù)口罩、

醫(yī)用無紡布帽、護(hù)目鏡或防護(hù)面屏、連體防護(hù)服、一次性手術(shù)衣、一次性PE手套、乳膠手套、鞋套、

防水靴套等防護(hù)裝備；感染性材料或活病毒在采用可靠方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測操作應(yīng)在BSL-2進(jìn)

行。

6質(zhì)量管理體系文件

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)GB19489、RB/T214、CNAS-CL02、《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》等文件建立質(zhì)量管

理體系文件。

7人員

7.1采樣人員

從事新冠病毒核酸檢測樣本采集的人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)，熟悉樣本種類和采集方法，熟練掌握

樣本采集操作流程及注意事項(xiàng)，做好樣本信息的記錄，確保樣本質(zhì)量符合要求、樣本及相關(guān)信息可追溯。

7.2檢測人員

實(shí)驗(yàn)室檢測人員應(yīng)具備實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)歷以及相關(guān)專業(yè)技術(shù)技能，接受過新冠病毒核酸PCR檢測技

能和生物安全培訓(xùn)。檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)按照所開展檢測項(xiàng)目及樣本量配備實(shí)驗(yàn)室檢測人員，以保證及時(shí)、高效

完成檢測和結(jié)果報(bào)告。

8環(huán)境設(shè)施

8.1實(shí)驗(yàn)室總體布局和各部位的安排應(yīng)減少潛在的對樣本的污染和對人員的危害。

8.2開展新冠病毒核酸檢測的實(shí)驗(yàn)室一般設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增分析

區(qū)，各區(qū)的主要功能包括：

a)試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的制備，以及離心管、吸

頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。

b)樣本制備區(qū)：轉(zhuǎn)運(yùn)箱的開啟、樣本的滅活，核酸提取及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管（孔）等。

c)擴(kuò)增分析區(qū)：核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析。

8.3根據(jù)所使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。如采用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測為一體的自動(dòng)

化分析儀，樣本制備區(qū)和擴(kuò)增分析區(qū)可合并。

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8.4各區(qū)域在物理空間上應(yīng)完全相互獨(dú)立，不得有空氣的直接相通，各區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記，不同區(qū)

域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。

8.5人員開展工作應(yīng)嚴(yán)格遵守從“試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增分析區(qū)”的單一流程制度，

不得逆向進(jìn)入前一工作區(qū)。

8.6試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)宜采用常壓或正壓，樣本制備和擴(kuò)增分析區(qū)采用常壓或負(fù)壓且兩區(qū)壓力持平。

有正壓控制的工作區(qū)，從緩沖間到核心工作間壓力遞增；有負(fù)壓控制的工作區(qū)，從緩沖間到核心工作間

壓力遞減；各房間之間壓差宜不低于10Pa，可通過安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行的方式實(shí)現(xiàn)。

8.7當(dāng)檢測方法對環(huán)境條件有要求或環(huán)境條件影響檢測結(jié)果時(shí)，應(yīng)監(jiān)測、控制和記錄環(huán)境條件，并設(shè)

置允許范圍。

9儀器設(shè)備和供應(yīng)品

9.1應(yīng)選擇國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的試劑，擴(kuò)增儀選用擴(kuò)增檢測試劑盒推薦的型號，使用核酸提

取儀時(shí)宜使用儀器配套的提取試劑。

9.2宜選用帶濾芯的一次性加樣器吸頭。

9.3對可能影響檢測質(zhì)量的供應(yīng)品（包括實(shí)驗(yàn)用水）應(yīng)在使用前進(jìn)行符合性驗(yàn)收。

9.4應(yīng)對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性或有效性有影響的設(shè)備，包括用于測量環(huán)境條件等輔助測量設(shè)備有計(jì)劃地

實(shí)施檢定或校準(zhǔn)。設(shè)備在投入使用前，應(yīng)采用核查、檢定或校準(zhǔn)等方式，以確認(rèn)其是否滿足檢測的要求。

9.5對于沒有檢定、校準(zhǔn)規(guī)程，但需出具檢測數(shù)據(jù)的儀器設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)隨機(jī)說明書和有關(guān)技術(shù)

資料確定可接受標(biāo)準(zhǔn)、維護(hù)和驗(yàn)證的程序及頻次。

9.6設(shè)備出現(xiàn)故障或者異常時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采取相應(yīng)措施，如停止使用、隔離或加貼停用標(biāo)簽、標(biāo)記，

直至修復(fù)并通過檢定、校準(zhǔn)或核查表明能正常工作為止。應(yīng)核查這些缺陷或偏離對以前檢測結(jié)果的影響。

9.7實(shí)驗(yàn)室配制的試劑應(yīng)貼好標(biāo)簽，并在標(biāo)簽上注明試劑名稱、容量、溶劑類型、配制及使用日期和/

或保質(zhì)期。若試劑有特殊使用說明、有毒有害提示或使用限制也應(yīng)在標(biāo)簽上注明。

10檢測樣本

10.1樣本種類

包括口咽拭子、鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物、便標(biāo)本/肛拭

子、血液、血清、尿液、物體表面、污水等。

10.2樣本包裝

所有樣本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種

類、姓名及采樣日期或等效標(biāo)識。密閉后的樣本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份樣本。

10.3樣本送檢

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樣本采集后室溫放置不超過4h，應(yīng)在4h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。如果需要長途運(yùn)輸樣本，應(yīng)采用干冰等

制冷方式進(jìn)行保存，嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)定包裝運(yùn)輸。

10.4樣本接收

應(yīng)在生物安全柜內(nèi)打開內(nèi)包裝，樣本運(yùn)送人員和接收人員對樣本進(jìn)行雙簽收。

10.5樣本保存

樣本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測，能在24h內(nèi)檢測的樣本可置于4℃保存；24h內(nèi)無法檢測的樣本則應(yīng)置

于-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为?dú)保存

樣本，避免反復(fù)凍融。

11性能驗(yàn)證

11.1在用于樣本檢測前，實(shí)驗(yàn)室檢測人員應(yīng)對由提取試劑、提取儀、擴(kuò)增試劑、擴(kuò)增儀等組成檢測系

統(tǒng)進(jìn)行必要的性能驗(yàn)證，性能指標(biāo)包括但不限于精密度（至少要有重復(fù)性）和最低檢測限，以確認(rèn)能否

復(fù)現(xiàn)商品試劑盒說明書載明的性能參數(shù)，能否達(dá)到預(yù)期的檢測目的。宜選用高靈敏的試劑（檢測限≤500

拷貝/mL）。

11.2每當(dāng)試劑盒的試劑組分或試驗(yàn)過程改變，或使用新批號或新貨運(yùn)號的試劑盒之前，應(yīng)重新進(jìn)行性

能驗(yàn)證。

12內(nèi)部質(zhì)量控制

12.1標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制定

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定并嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，包括試劑準(zhǔn)備、樣本前處理、核酸提取、核酸擴(kuò)增、結(jié)果

分析及報(bào)告、可疑樣本復(fù)檢流程。

12.2內(nèi)部質(zhì)量控制方式

12.2.1每批檢測至少有1份弱陽性質(zhì)控品（第三方質(zhì)控品，通常為檢出限的1.5倍～3倍）、3份陰

性質(zhì)控品（生理鹽水）。質(zhì)控品隨機(jī)放在待測樣本中，參與從提取到擴(kuò)增的全過程。

12.2.2應(yīng)選擇合適的內(nèi)源性對照如“管家”基因或外源性對照如假病毒作為內(nèi)對照以評價(jià)實(shí)驗(yàn)過程的

完整性。

12.2.3物品和環(huán)境樣本的采集檢測，還需在采樣前及采樣過程中至少設(shè)一個(gè)現(xiàn)場空白樣本及一個(gè)運(yùn)輸

空白樣本，以進(jìn)行過程中的質(zhì)量控制。

12.2.4應(yīng)定期采用保存液、生理鹽水或DEPC（焦碳酸二乙酯）水開蓋放置過夜或拭子擦拭等方式對

樣品處理區(qū)域（含生物安全柜）、提取設(shè)備、加樣器、冰箱把手、門把手等部位進(jìn)行環(huán)境污染監(jiān)測。

12.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性的判定

當(dāng)出現(xiàn)下述情況中的任何一種或多種，當(dāng)次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效，查找原因，重做實(shí)驗(yàn)。

a)陰性質(zhì)控品出現(xiàn)擴(kuò)增；

b)陽性質(zhì)控品無擴(kuò)增；

c)內(nèi)對照不滿足試劑盒說明書規(guī)定的要