分子生物學(xué)題庫(kù)1

n一概論2.染色體DNA通常與細(xì)胞膜相連

1、生物大分子：具有較大的分子量，由簡(jiǎn)單的小分子(核音3.具有操縱子結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)基因?yàn)槎囗樂(lè)醋樱舾蓚€(gè)功能相關(guān)的結(jié)

酸或氨基酸)排列組成，蘊(yùn)含豐富信息并且具有復(fù)雜的空間構(gòu)基因串聯(lián)在一起，受同一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)

結(jié)構(gòu)。數(shù)個(gè)操縱子還可以由一個(gè)共同的調(diào)節(jié)基因(regulatorygene)

2、分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史即調(diào)節(jié)子(regulon)所調(diào)控

(1)準(zhǔn)備階段(19世紀(jì)后期-20世紀(jì)50年代初)期間的重大4.結(jié)構(gòu)基因都是單拷貝，rRNA基因?yàn)槎嗫截?，基因組DNA

突破：①確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)；②確定了生中不編碼的部份所占比例比真核細(xì)胞基因組少得多，比病毒基因

物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。組多

(2)現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段(20世紀(jì)50年代初5.不出現(xiàn)基因重疊現(xiàn)象

-70年代初)1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)6具有同基因(isogene)：編碼同工酶

模型作為現(xiàn)在分子生物學(xué)誕生的標(biāo)志。期間的主要進(jìn)展：①(isoenzyme)

“中心法則”的建立；②對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。7.DNA分子中具有各種功能的識(shí)別區(qū)域如：復(fù)制起始區(qū)(OriC)

(3)初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段(20復(fù)制終止區(qū)(TerC)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)

世紀(jì)70年代以后)以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，8.具有終止子(termintor)這些區(qū)域往往具有特殊的順序，并且

標(biāo)志著人類開始了深入認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并能動(dòng)改造生命的新時(shí)含有反向重復(fù)順序

期。期間的主要發(fā)展：①重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展；②基9.結(jié)構(gòu)基因中無(wú)內(nèi)含子

因組的研究；③單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展；9、真核生物的基因組特點(diǎn)

④基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制；⑤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究。(1)每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目；

二基因的結(jié)構(gòu)與功能(2)基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物基因組，具有許多復(fù)制起始點(diǎn)；

1、基因：DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核昔酸序列，(3)真核基因都由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)

是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。物為單順?lè)醋樱?/p>

2、基因組：泛指一個(gè)有生命體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳物(4)真核生物含有大量重復(fù)順序；

質(zhì)。(5)真核生物基因組內(nèi)非編碼序列占90%以上；

3、衛(wèi)星DNA：由2-10bp組成重復(fù)單位，重復(fù)單位成串排列(6)真核基因是斷裂基因；

而成，由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用等密(7)功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族；

度梯度離心法將其與主體DNA分開。(8)真核生物基因組中存在一些可移動(dòng)的遺傳因素。

4、超基因：人體基因組中幾個(gè)屬于中度重復(fù)序列的長(zhǎng)分散片三人類基因組計(jì)劃

段的基因簇，在一個(gè)基因簇內(nèi)含有幾百個(gè)功能相關(guān)而結(jié)構(gòu)不1、遺傳作圖(geneticmapping)：通過(guò)親本的雜交或檢查家族史

同的基因。來(lái)分析后代的基因或其他特異分子標(biāo)記物間重組率，并用重組

5、多基因家族：由某一祖先基因經(jīng)過(guò)重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一率來(lái)表示兩個(gè)基因之間距離的線性連鎖圖譜。

組基因。多基因家族大致可分為兩類：①基因家族成簇地分2、物理作圖(physicalmapping)：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)直接

布在某一條染色體上，其可同時(shí)發(fā)揮作用，合成某些蛋白質(zhì)；分析DNA分子，測(cè)定人類基因組DNA分子的物理長(zhǎng)度，從而

②一個(gè)基因家族的不同成員成簇地分布不同染色體上，這些構(gòu)建能顯示包括基因在內(nèi)的、序列特征的位置圖譜。

不同成員編碼一組功能上緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)。3、序列作圖(sequencemapping)：測(cè)出人類基因組的全部DNA

6、假基因：在多基因家族中不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物的成員。序列。

7、病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)4、基因作圖(genemapping)：確定每一個(gè)基因的結(jié)構(gòu)、特性和

1、病毒基因組很小，且大小相差較大。功能。

2.病毒基因組可以由DNA組成，或由RNA組成。四基因的表達(dá)與調(diào)控

3.多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的RNA鏈組成。掌握原核基因表達(dá)調(diào)控的基本概念及主要類型

4.基因重疊。1、基因表達(dá)調(diào)控，即對(duì)基因表達(dá)過(guò)程的調(diào)節(jié)，分為兩個(gè)層次，

5.基因組的大部分可編碼蛋白質(zhì)，只有非常小的一部份不編碼即轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控；

蛋白質(zhì)。2、原核基因調(diào)控機(jī)制的類型與特點(diǎn)

6.形成多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)。(1)正轉(zhuǎn)錄調(diào)控：調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白。

7.病毒基因組都是單倍體(逆轉(zhuǎn)錄病毒除外)。①正控誘導(dǎo)：效應(yīng)物使激活蛋白處于活性狀態(tài)。

8.噬菌體(細(xì)菌病毒)的基因是連續(xù)的，而真核細(xì)胞病毒的基②正控阻遏：效應(yīng)物使激活蛋白處于非活性狀態(tài)

因是不連續(xù)的。(2)負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控：調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白。

8、細(xì)菌基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)①負(fù)控誘導(dǎo)：阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。

1.形成類核②負(fù)控阻遏：阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。

(3)可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)：是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的(1)弱化子：當(dāng)操縱子被阻遏，RNA合成被終止時(shí)，起終止轉(zhuǎn)

作用下，由原來(lái)關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)錄信號(hào)作用的那一段核甘酸序列。

的誘導(dǎo)下使基因活化。如乳糖操縱子。(2)作用機(jī)理：在色氨酸操縱子的前導(dǎo)序列中可能存在前導(dǎo)肽,

(4)可阻遏調(diào)節(jié)：這類基因平時(shí)都是開啟的，處在生產(chǎn)蛋白由1、2、3、4四個(gè)區(qū)組成，3-4配對(duì)區(qū)正好位于終止密碼子的

質(zhì)或酶的工作過(guò)程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累識(shí)別區(qū)域。trp弱化子對(duì)RNA聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯

而將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)。如色氨酸操縱子。中核糖體的位置，當(dāng)核糖體覆蓋前導(dǎo)肽的1、2區(qū)時(shí)，3、4區(qū)形

掌握乳糖操縱子的負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機(jī)理(葡萄糖成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄；當(dāng)核糖體覆蓋1區(qū)時(shí)，2、

效應(yīng)及其機(jī)制)3區(qū)配對(duì)，RNA聚合酶繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。

1、乳糖操縱子包括：掌握在DNA水平的基因表達(dá)調(diào)控：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因擴(kuò)增、重

(1)啟動(dòng)子(promotor,P)；排與交換。DNA甲基化對(duì)基因活性的調(diào)控

(2)操縱基因(operator,0)；1、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變：基因活躍表達(dá)時(shí)啟動(dòng)區(qū)部分DNA序列解

(3)結(jié)構(gòu)基因(Z、Y、A)：分別編碼半乳糖昔酶、B-開成單鏈，從而不能繼續(xù)纏繞在核小體上而“裸露”于組蛋白表

半乳糖背透過(guò)酶、B-半乳糖甘乙?；D(zhuǎn)移酶面。

2、乳糖操縱子調(diào)控模型的主要內(nèi)容：2、基因重排：一個(gè)基因可以通過(guò)從遠(yuǎn)離其啟動(dòng)子的地方移到距

(1)ZYA基因的產(chǎn)物由同一條多順?lè)醋拥膍RNA分子所編它很近的位點(diǎn)而被啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

碼；3、基因轉(zhuǎn)換：酵母的“交配型轉(zhuǎn)換”現(xiàn)象，通過(guò)基因轉(zhuǎn)換改變

(2)該mRNA分子的啟動(dòng)子(P)位于阻遏基因(D與操縱性別。

基因(0)之間，不能單獨(dú)起始半乳糖苗酶和透過(guò)酶基因的高4、基因擴(kuò)增：某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象。

效表達(dá)；5、DNA甲基化：DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基

(3)操縱基因是DNA上的一小段序列(僅為26bp),是阻遏化則誘導(dǎo)基因的活化和表達(dá)。

物的結(jié)合位點(diǎn)；掌握真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的順式作用元件和反式作用因子的結(jié)

(4)當(dāng)阻遏物與操縱基因相結(jié)合時(shí)，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始構(gòu)

受到抑制；1、啟動(dòng)子：在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及其上游大約100-200bp內(nèi)的一組

(5)誘導(dǎo)物通過(guò)與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不具有獨(dú)立功能的DNA序列，決定RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和

能與操縱基因相結(jié)合，從而激發(fā)lacmRNA的合成。轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵元件，包括：

3、葡萄糖效應(yīng)(降解物抑制作用)：(1)核心啟動(dòng)子(corepromoter)：保證RNA聚合酶正常起始

(1)概念：大腸桿菌生長(zhǎng)在既有葡萄糖又有其他糖類(乳糖等)轉(zhuǎn)錄所必需的DNA序列，確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的

的介質(zhì)中，只能利用葡萄糖，當(dāng)葡萄糖耗盡后才能利用其他轉(zhuǎn)錄。包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和上游的-25到-30bp處的TATA盒。

糖類，即葡萄糖阻斷多種操縱子(葡萄糖敏感操縱子)的表達(dá)。(2)上游啟動(dòng)子元件(UPE)：包括-70bp附近的CAAT盒

(2)機(jī)理：葡萄糖代謝降解物降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，不(CCAAT)和GC盒(GGGCGG)等，能通過(guò)TFIID復(fù)合物調(diào)

能與環(huán)腺甘酸受體蛋白(CRP)或稱代謝降解物激活蛋白節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率，提高轉(zhuǎn)錄效率。

(CAP)形成足夠的cAMP-CAP活性復(fù)合物以促使RNA聚合2、終止位點(diǎn)：3,端存在poly(A)位點(diǎn)，該位點(diǎn)上游15-30bp處有

酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，葡萄糖敏感操縱子不能表達(dá)。保守序列AATAAAo

掌握色氨酸操縱子與負(fù)控阻遏系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)理、及弱化子的3、增強(qiáng)子：指能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA

作用機(jī)理序列。通常具有下列特性：

1、色氨酸的合成有阻遏系統(tǒng)和弱化系統(tǒng)兩個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，不受(1)增強(qiáng)效應(yīng)十分明顯

葡萄糖或cAMP-CAP活性復(fù)合物的調(diào)控。(2)增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無(wú)關(guān)。

2、trp操縱子的阻遏系統(tǒng)(3)大多為重復(fù)序列：(G)TGGA/TA/TA/T(G)。

(1)trpR基因產(chǎn)物稱為輔阻遏蛋白(aporepressor),與色氨(4)增強(qiáng)效應(yīng)有嚴(yán)密的組織和細(xì)胞特異性。

酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物，與操縱基因結(jié)合并關(guān)閉trp(5)要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用，但沒(méi)有基因?qū)Ｒ恍浴?/p>

mRNA轉(zhuǎn)錄。(6)受外部信號(hào)的調(diào)控。

(2)效應(yīng)物是色氨酸，是由trp操縱子所編碼的生物合成途3、沉默子：某些基因的負(fù)性調(diào)節(jié)元件，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子

徑的末端終產(chǎn)物。時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。沉默子的作用可不受序列方向的

(3)當(dāng)培養(yǎng)基色氨酸含量高，它與輔阻遏蛋白結(jié)合，與操縱影響，也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用，并可對(duì)異源基因的表達(dá)起作用。

基因結(jié)合，阻遏mRNA的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)色氨酸不足時(shí)，輔阻遏蛋4、反式作用因子：可使鄰近基因開放(正調(diào)控)或關(guān)閉(負(fù)調(diào)控)

白失去色氨酸并從操縱基因上解離，trp操縱子去阻遏，mRNA的DNA結(jié)合蛋白，核內(nèi)蛋白，包括：

開始轉(zhuǎn)錄。1)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域：

3、trp弱化子的作用機(jī)理(1)螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋：至少有兩個(gè)a螺旋，中間由短側(cè)鏈氨基

酸殘基形成“轉(zhuǎn)折”。一個(gè)a螺旋負(fù)責(zé)識(shí)別DNA的大溝，另(1)概念：能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表

一個(gè)與DNA主鏈骨架非特異性結(jié)合。這類HTH蛋白以二聚達(dá)的工具，其本質(zhì)為DNA。制備的目的基因或外源性DNA片

體形式與DNA結(jié)合段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進(jìn)入受體細(xì)胞并進(jìn)

(2)鋅指：一個(gè)a螺旋與一個(gè)反向平行8片層的基部以鋅原行復(fù)制和表達(dá)

子為中心，通過(guò)與一對(duì)半胱氨酸和一對(duì)組氨酸之間形成配位(2)載體應(yīng)具備的特征

鍵相連接，鋅指環(huán)上突出的賴氨酸、精氨酸參與DNA結(jié)合。①能自我復(fù)制并具較高的拷貝數(shù)；

(3)堿性-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子的肽鏈上每隔6個(gè)氨②分子量一般＜10Kb；

基酸就有一個(gè)亮氨酸殘基，結(jié)果就導(dǎo)致這些亮氨酸殘基都在③帶有遺傳篩選標(biāo)記；

a螺旋的同一個(gè)方向出現(xiàn)。兩個(gè)相同結(jié)構(gòu)的兩排亮氨酸殘基④有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，便于外源基因的插入和篩選；

就能以疏水鍵結(jié)合形成拉鏈型二聚體。該二聚體的氨基端的⑤多克隆位點(diǎn)(MCS)：載體上具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一位

肽段富含堿性氨基酸殘基，借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶點(diǎn)，以供外源DNA插入。

負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)結(jié)合。(3)分類

(4)堿性-螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)：竣基端100-200aa形成兩個(gè)a①克隆載體：能將載體外源基因在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增并產(chǎn)生

螺旋被非螺旋的環(huán)狀結(jié)構(gòu)所隔開；氨基端是堿性區(qū)。該類蛋足夠量目的基因的載體。

白形成同源或異源二聚體后，通過(guò)它們的堿性區(qū)與DNA相結(jié)②表達(dá)載體：能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯

合。的載體。

(5)同源域蛋白：分子中含有約60個(gè)氨基酸的保守序列，(4)常用的載體：質(zhì)粒、噬菌體、粘粒和病毒。

這些序列參與形成了DNA的結(jié)合區(qū)。C端有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋5、DNA重組的基本步驟

(HTH)樣結(jié)構(gòu)。(1)切：從供體細(xì)胞中分離出基因組DNA,用限制性核酸內(nèi)切

2)轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域：具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的催化區(qū)域，常以復(fù)酶分別將外源DNA和載體分子切開；

合物形式出現(xiàn)，依賴于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以外的30-100個(gè)氨(2)接：用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片斷接到載體

基酸殘基完成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用。上，形成DNA重組分子；

(3)轉(zhuǎn)：借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞

五基因工程中；

1、基因工程(GeneticEngineering)(4)增：短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子或使其

(1)狹義：基因工程是指將一種或多種生物體(供體)的基整合到受體細(xì)胞的基因組中；

因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體(受(5)檢：篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效表達(dá)的基

體)內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出新的性狀。其三因工程菌或細(xì)胞。

大要素為供體、受體和載體。6、重組體的篩選和鑒定

(2)廣義：DNA重組技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括：①上(1)遺傳標(biāo)記表型特征篩選

游技術(shù)：外源基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建(即狹義①抗生素抗性標(biāo)記篩選：因大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性標(biāo)

的基因工程)②下游技術(shù)：含有重組外源基因的生物細(xì)胞(基記的特征(如Ampr、Tetr等)，當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)

因工程菌或細(xì)胞)的大規(guī)模培養(yǎng)以及外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分化無(wú)抗性細(xì)菌后，被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性菌獲得抗生素抗性基因而存活

離純化過(guò)程。并形成噬菌斑，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應(yīng)排除未重組的空載體。

2、分子克隆：DNA重組分子大都需在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增，②雙抗生素篩選法：某些質(zhì)粒載體如pBR322質(zhì)粒中裝有Ampr

故基因工程可稱為為分子克隆。和Tetr抗性基因，在這兩個(gè)基因中裝有幾個(gè)常用的MCS,如將

3、基因工程中的重要工具酶外源DNA片段插入BamHI識(shí)別序列時(shí)，則此質(zhì)粒由Tetr變?yōu)?/p>

工具酶功能對(duì)四環(huán)素敏感。這種重組子導(dǎo)入宿主菌后，宿主菌在含四環(huán)素

限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNA瓊脂糖平皿上不能生長(zhǎng)而在含氨革青霉素的平皿上能夠生長(zhǎng)。

在含四環(huán)素和氨葦青霉素的平皿上都能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌只含有空

DNA連接酶連接DNA片段，使切口封合

載體。

DNA聚合酶I合成DNA,填補(bǔ)3'末端

③半乳糖甘酶基因失活篩選(藍(lán)白斑篩選)：某些質(zhì)粒載體帶

逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA

有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ'基因，該基因含一段編碼B-半

多聚核昔酸激酶使多聚核昔酸5'末端磷酸化

乳糖甘酶氨基末端145個(gè)氨基酸a-肽的DNA片段，IPTG可誘

末端轉(zhuǎn)移酶使羥基加尾

3'導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型8一半乳糖

堿性磷酸酶切除末端磷酸基音酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)a-互補(bǔ)，形成完整的B-半乳糖甘酶。該酶能催

化指示劑底物X-gal形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ'基

4、載體因中MCS,laca一肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無(wú)半乳

糖昔酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落。1、生物芯片：是指包被在固相載體(如硅片、玻璃、塑料和尼

④營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記選擇：當(dāng)細(xì)胞生物合成途徑中某個(gè)酶的編碼基因龍膜)上的DNA微陣列、寡核昔酸微陣列和蛋白質(zhì)微陣列。在

失活后，該細(xì)胞成為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，如導(dǎo)入細(xì)胞的重組DNA能一定的條件下進(jìn)行生化反應(yīng)，經(jīng)過(guò)反應(yīng)結(jié)果的顯示和數(shù)據(jù)采集,

彌補(bǔ)缺陷的基因，那么培養(yǎng)基中就不需補(bǔ)充有關(guān)的營(yíng)養(yǎng)成分,最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

由此可挑選出含重組DNA的陽(yáng)性細(xì)菌。2、基因芯片：通過(guò)微陣列技術(shù)將高密度DNA片段陣列以一定

(2)重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選的順序或排列方式使其附著在固相表面作為探針，熒光標(biāo)記的

①酶切鑒定：少量培養(yǎng)含重組子的菌株，從中分別提取重組樣品DNA/RNA借助堿基互補(bǔ)作用與探針進(jìn)行雜交，從而進(jìn)行

載體DNA和原載體DNA。根據(jù)已知外源基因兩端的酶切位大量的基因表達(dá)及監(jiān)測(cè)等方面的研究。

點(diǎn)，分別用相應(yīng)的兩種內(nèi)切酶進(jìn)行切割。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳3、蛋白質(zhì)芯片：一種以微陣列為基礎(chǔ)，高效的蛋白質(zhì)分析方法。

后，只出現(xiàn)一條區(qū)帶的是原載體本身，而重組載體還多一條4、免疫芯片：芯片上固定的蛋白質(zhì)是特異性的抗體(或抗原)，

外源DNA片段的區(qū)帶?？筛鶕?jù)DNAmark來(lái)分析插入DNA將其配體抗原(或抗體)加上各種標(biāo)記，通過(guò)特異性免疫反應(yīng)即

片段的分子量?？蓪?shí)現(xiàn)基于芯片的免疫檢測(cè)。

②PCR篩選法：提取重組子DNA,利用插入外源基因兩端互七基因治療

補(bǔ)的特異引物，對(duì)重組子DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。此法不僅可1、基因治療：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)

分離擴(kuò)增目的基因，還可對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序。發(fā)揮作用，達(dá)到治療疾病目的的方法。

③核酸雜交技術(shù)篩選：將DNA的克隆片段或轉(zhuǎn)化細(xì)菌平板轉(zhuǎn)2、siRNA：雙鏈小片段RNA被攝入細(xì)胞后，能高效、特異性降

移至硝酸纖維素薄膜上，應(yīng)用特異性的核酸探針對(duì)其進(jìn)行原解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA,從而阻斷體內(nèi)靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)

位雜交，可篩選出陽(yáng)性克隆。對(duì)于噬菌體載體的克隆，此法靶基因缺失的表型。

也可通過(guò)噬菌斑的原位雜交篩選陽(yáng)性克隆。3、基因免疫：將靶抗原編碼基因置于真核表達(dá)調(diào)控元件的調(diào)控

7、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)下，將該質(zhì)粒DNA直接進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)接種，并以與自然感染類

(1)PCR的基本原理似的方式呈遞抗原，誘生特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的理論和

PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞技術(shù)。

內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度4、基因治療的主要內(nèi)容及其三個(gè)核心

下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系(1)基因治療是將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體

統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合內(nèi)發(fā)揮作用，達(dá)到治療疾病目的的方法。

成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物(2)基因治療的主要內(nèi)容：

沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過(guò)程每一步的轉(zhuǎn)換是①基因標(biāo)記：追蹤致病靶點(diǎn)，以獲得進(jìn)一步臨床治療的有用信

通過(guò)溫度的改變來(lái)控制的。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引息；

物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即②基因置換：又稱基因矯正，將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞,

高溫(90-95℃)變性、低溫(40-60℃)退火、中溫(70-75℃)通過(guò)定位重組，以導(dǎo)入的正?；蛉〈蚪M內(nèi)有缺陷的基因，

延伸3個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，不涉及基因組其它改變；

就可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。③基因添加：導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)本身不表達(dá)的基因；

(2)PCR的反應(yīng)條件④基因干預(yù):用RNAi或加核酶等方式抑制或破壞某個(gè)基因使之

①模板不表達(dá)，以達(dá)到治療的目的，類基因治療的靶基因往往是過(guò)度

②緩沖液表達(dá)的癌基因或病毒基因；

③鎂離子：濃度L5-2.0mmol/L,TaqDNA聚合酶活性需要⑤基因疫苗：將編碼某種蛋白抗原的基因插入質(zhì)粒載體，直接

Mg2+。Mg2+濃度過(guò)高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。Mg2+導(dǎo)入機(jī)體，通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主

濃度還會(huì)影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度。產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。

④底物dNTPs：濃度20-200umol/L；升高濃度可加快反應(yīng)速(3)基因治療的三個(gè)核心：基因載體系統(tǒng)、基因表達(dá)系統(tǒng)和治

度，也增加堿基的錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本；降低濃度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)療基因。

速度下降，可提高反應(yīng)的特異性。4種dNTP必須以等摩爾濃5、基因治療的應(yīng)用范圍及前景

度配制，以減少PCR反應(yīng)的錯(cuò)配誤差。1)基因治療的應(yīng)用范圍

⑤TaqDNA聚合酶：濃度l-2.5u/100ul,具有良好的熱穩(wěn)定性,①遺傳性疾?。簢?yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合癥(SCID),黑色素瘤、

75-80°C時(shí)具有最高的聚合酶活性。血友病等；

⑥引物：濃度0.1-0.5umol/L,濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配或非特異②心血管疾病：目前治療的成功率最高，可利用基因縫線、基

性擴(kuò)增、生成引物二聚體，使目的DNA產(chǎn)率下降。退火溫度因球囊、基因支架等方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行治療。

與引物Tm值有關(guān)，引物Tm值在55-80°。范圍較為理想。③腫瘤：恢復(fù)抑癌基因或抑制癌基因的表達(dá)，導(dǎo)入藥物敏感性

六基因診斷基因，抗血管生成基因，免疫效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的方法。

2)基因治療的前景斷和治療有了更加深入的認(rèn)識(shí)，而且從基因水平揭開了控制細(xì)

(1)目前基因治療的問(wèn)題胞生長(zhǎng)和分化的物質(zhì)基礎(chǔ)。

①導(dǎo)入基因的穩(wěn)定高效表達(dá)的問(wèn)題microsatellitemarker又稱shorttandemrepeat(STR)：由較少(通

②導(dǎo)入外源基因的安全性的問(wèn)題常為二、三或四核甘酸單位)的堿基重復(fù)組成，高度多態(tài)性，

③基因治療與社會(huì)倫理道德的問(wèn)題提供的信息量相對(duì)很大；另外可用PCR技術(shù)使操作實(shí)現(xiàn)自動(dòng)

(2)未來(lái)基因治療的發(fā)展化。

未來(lái)將開發(fā)一種能被注射的載體，使它靶向特殊細(xì)胞，將把外顯子(exon),內(nèi)含子(intron)：真核生物的結(jié)構(gòu)基因不僅在

產(chǎn)生的安全、高效基因以高百分率轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞中，載體本身兩側(cè)有非編碼區(qū)，而且在基因內(nèi)部也有許多不編碼蛋白質(zhì)的間

將嵌進(jìn)合適的基因組區(qū)域(或以穩(wěn)定的附加體保持)，將既被隔序列(interveningsequences),稱為內(nèi)含子(intron),編碼區(qū)

管理劑又被人體自身的生理信號(hào)調(diào)節(jié)，將低成本制造高效率則稱為外顯子(exon)。

治病?；蛑委煯a(chǎn)品的數(shù)量將開始幾何級(jí)數(shù)增加，與以人類自私DNA(selfishDNA)：在哺乳動(dòng)物包括人體基因組中，存

基因組計(jì)劃結(jié)果為特征的基因的大量增加相符合。在著大量的非編碼順序。這些順序中，只有很小一部份具有重

八腫瘤相關(guān)基因要的調(diào)節(jié)功能，絕大部分都沒(méi)有什么特殊功用。在這些DNA序

1、癌基因：細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的基因，它的結(jié)構(gòu)異列中雖然積累了大量缺失，重復(fù)或其他突變，但對(duì)生物并沒(méi)有

常或表達(dá)異常，可以引起細(xì)胞癌變。什么影響，它們的功能似乎只是自身復(fù)制，所以人們稱這類DNA

2、細(xì)胞癌基因(原癌基因)：存在于正常細(xì)胞基因組中的癌為自私DNA或寄生DNA(parasiteDNA)。

基因，未激活時(shí)促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等。多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)(polycistronie)：病毒基因組DNA序列中功能上

3、病毒癌基因：存在于病