T-ZJSC 0003-2023 岱衢族大黃魚實(shí)時(shí)熒光PCR 鑒定方法

CCSB50T/ZJSCDaiqu-populationLarimichthyscrocea2023-12-26發(fā)布浙江省水產(chǎn)學(xué)會(huì)發(fā)布IT/ZJSC0003-2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容有可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由浙江省水產(chǎn)學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：浙江海洋大學(xué)、浙江省海洋水產(chǎn)研究所、浙江省舟山市水產(chǎn)研究所、象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司、寧波市海洋與漁業(yè)研究院、浙江中惟科創(chuàng)海洋科技有限公司、舟山市綠色漁業(yè)發(fā)展有限公司。本文件主要起草人：嚴(yán)小軍、江麗華、陶震、宋偉華、周永東、徐志進(jìn)、吳雄飛、徐萬土、樂利平、徐方成、張曉林、許永久、馬家志、祝捍皓。T/ZJSC0003-2023岱衢族大黃魚實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定方法本文件描述了岱衢族大黃魚的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（以下簡稱實(shí)時(shí)熒光PCR）鑒定方法。本文件適用于養(yǎng)殖及自然海域捕獲岱衢族大黃魚的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T32755-2016大黃魚3術(shù)語和定義GB/T32755-2016界定的術(shù)語和定義適用于本文件。3.1岱衢族大黃魚Daiqu-populationLarimichthyscrocea指分布于黃海南部至東海中部的野生原種活體大黃魚及其繁育的后代。3.2單核苷酸多態(tài)性（SNP）singlenucleotidepolymorphism單個(gè)核苷酸的變異引起的基因組水平上DNA序列的多態(tài)性，其形式包括單堿基的插入、缺失、轉(zhuǎn)換和顛換。3.3Ct值cyclethreshold每個(gè)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4總則所有待檢測樣品均應(yīng)符合GB/T32755-2016關(guān)于大黃魚的種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求。5原理通過10個(gè)SNP標(biāo)記組合的檢測結(jié)果，鑒定樣品是否屬于岱衢族大黃魚。2T/ZJSC0003-20236試劑與材料6.1除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)定。6.2苯酚（C6H6O）。6.3三氯甲烷（CHCl3）。6.4異戊醇[(CH)CHCHCHOH]。養(yǎng)殖池塘與培育水槽面積比例大于10:1。6.5無水乙醇（C2H6O）。6.6苯酚-三氯甲烷-異戊醇（按25:24:1比例混合）。6.7蛋白酶K裂解液（10mg/mL）：將100mg蛋白酶K溶解于10mL滅菌蒸餾水中，保存在-20℃待用。6.8Tris-HCl（1mol/L,pH=8.0）：稱取12.1gTris堿至容器中，加入90mL一級水溶解，加入適量濃HCl調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至100mL，高壓滅菌室溫保存。6.9EDTA溶液（0.5mol/L,pH=8.0用90mL一級水溶解18.61gEDTA，加NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，加水定容到100mL，高溫滅菌室溫保存。6.10NaCl溶液（1mol/L）：用100mL一級水溶解5.85gNaCl，高壓滅菌室溫保存。6.11NaAc溶液（3mol/L，pH=5.4）：用80mL一級水溶解24.60gNaAc，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容至100mL，高壓滅菌室溫保存。6.12SDS溶液（20%）：用90mL一級水溶解20g電泳級SDS，水浴加熱助溶，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，加水定容到100mL，室溫保存。6.13組織裂解液：分別量取Tris-HCl溶液（6.8）1mL、EDTA溶液（6.9）20mL、NaCl溶液（6.10）1mL、SDS溶液（6.12）5mL，混合均勻，加一級水定容至100mL，室溫保存。含10mmol/LTris-HCl,pH8.0,0.1mol/LEDTA,10mmol/LNaCl,1%SDS的混合溶液。6.14DNA提取純化試劑盒。6.15熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒。6.16引物（濃度均為10μmol/L），具體信息參見附錄A。7主要儀器設(shè)備7.1熒光定量PCR儀。7.2手持電動(dòng)組織研磨器。7.3紫外分光光度計(jì)。7.4臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（額定最高轉(zhuǎn)速大于12000r/min）。T/ZJSC0003-20237.6水浴鍋。7.7-20℃冰箱和-80℃超低溫冰箱。8樣品檢測8.1DNA模板提取8.1.1酚-三氯甲烷-異戊醇提取法取待測大黃魚肌肉/皮膚組織15mg，加入400μL組織裂解液（6.13），用手持研磨器研磨，加入5μL蛋白酶K（10mg/mL）（6.7），55℃水浴3h，用苯酚-三氯甲烷-異戊醇(6.6)、三氯甲烷各抽提一次，吸取上層水相，加入1/10體積3mol/LNaAc溶液和2.5倍體積無水乙醇，混勻后置-20℃沉淀1h，4℃12000r/min條件下離心5min，棄上清，沉淀晾干后溶解于滅菌一級水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.2DNA提取試劑盒法按照試劑盒（6.14）規(guī)定的方法提取樣品DNA。8.1.3DNA模板質(zhì)量檢測用紫外分光光度計(jì)測定DNA的純度與濃度，分別讀取260nm和280nm處的吸收值（記為OD260和OD280）。當(dāng)OD260/OD280比值應(yīng)為1.71.9時(shí)，DNA的質(zhì)量符合實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的要求。DNA的濃度為50倍的OD260(ng/μL)。調(diào)整DNA濃度至100ng/μL，并置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2實(shí)時(shí)熒光PCR檢測8.2.1對照設(shè)置陽性對照：含有岱衢族大黃魚基因組靶DNA片段的質(zhì)粒為陽性對照，陽性質(zhì)粒模板的構(gòu)建按照附錄A.2的要求執(zhí)行?？瞻讓φ眨喊藴y試樣品DNA模板以外所有的反應(yīng)試劑，在PCR反應(yīng)體系用相同體積的滅菌一級水代替模板DNA。8.2.2熒光定量PCR反應(yīng)體系配置熒光定量PCR反應(yīng)體系（20μL）見表1，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行。表1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系試劑體積2×實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增預(yù)混液正向引物（10μmol/L）0.4反向引物（10μmol/L）0.4DNA模板一級水補(bǔ)至204T/ZJSC0003-2023總體積注：DNA模板若為陽性質(zhì)粒模板與空白對照，單個(gè)反應(yīng)的體積均為1μL。8.2.3熒光定量PCR反應(yīng)條件第一階段，預(yù)變性95℃30s；第二階段，擴(kuò)增95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。8.2.4PCR反應(yīng)質(zhì)量控制每個(gè)待檢樣品共包含10對引物的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，所有空白對照應(yīng)無Ct值；所有陽性對照Ct值<35，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，表明反應(yīng)體系工作正常。9結(jié)果判定在熒光定量PCR反應(yīng)體系正常工作的前提下，只有10對引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陽性時(shí)，待測樣品可判定為岱衢族大黃魚。PCR擴(kuò)增結(jié)果依據(jù)熒光曲線和Ct值判定，判定規(guī)則如下：a)PCR擴(kuò)增曲線Ct值≤30，并出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，PCR擴(kuò)增結(jié)果判定為陽性。b)PCR擴(kuò)增曲線無Ct值，PCR擴(kuò)增結(jié)果判定為陰性。c)PCR擴(kuò)增曲線Ct值介于30和35之間時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行PCR檢測；若重測結(jié)果Ct值≥35或無Ct值，判斷為陰性；若重測的Ct值仍介于30和35之間，則判為陽性。10樣品保存與復(fù)核10.1樣品保存與結(jié)果記錄送檢樣品應(yīng)置于-80℃冰箱保存。對送檢的樣品至少保存1個(gè)月，以備復(fù)檢。記錄包括樣品的來源、采樣時(shí)間、檢測時(shí)間、地點(diǎn)、方法、結(jié)果等，并有實(shí)驗(yàn)人員簽字。保存實(shí)時(shí)熒光PCR檢測陽性結(jié)果照片。10.2復(fù)核復(fù)核只是針對有異議的情況才進(jìn)行。由指定的單位或人員負(fù)責(zé)，校核與評價(jià)實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)記錄及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果等資料的完整性和真實(shí)性。T/ZJSC0003-2023附錄A（規(guī)范性）岱衢族大黃魚熒光定量PCR檢測引物序列及陽性模板構(gòu)建A.1岱衢族大黃魚SNP檢測的特異性引物序列正向引物SNP1-F:5’-CCTCACTGCCTCTTTGAGA-3’反向引物SNP1-R:5’-ATGGGCTTTTGTTTTATTAGGAG-3’2)引物對2正向引物SNP2-F:5’-GCCATCCCTCCATCTCC-3’反向引物SNP2-R:TGCCAGAATCCGACTTGT-3’3)引物對3正向引物SNP3-F:5’-CACATGGACTCAGTGTTAAGAA-3’反向引物SNP3-R:5’-TCACCTCACATAAGTGTTAATCT-3’4)引物對4正向引物SNP4-F:5’-CGTGAATAAAACGAGATCAGT-3’反向引物SNP4-R:5’-TCCGATCCTCTTCTCTGAT-3’5)引物對5正向引物SNP5-F:5’-CCCTTCCATCAGCGACTC-3’反向引物SNP5-R:5’-TTATTTCGAGATGAGCAATACTGA-3’6)引物對6正向引物SNP6-F:5’-CACGGCCTTAGACACTTC-3’反向引物SNP6-R:5’-CACCATTCATCTGATAACAAGTC-3’7)引物對7正向引物SNP7-F:5’-GGCTGACAAGTTTATATAGTGC-3’反向引物SNP7-R:5’-TAGGCTCCGTACATTACA-3’8)引物對8正向引物SNP8-F:5’-CATAACGATCCCTGGACC-3’反向引物SNP8-R:5’-AGTCCTGACAGCTAAAGAAG-3’9)引物對9正向引物SNP9-F:5’--ATTATTTCCTGTCATCCATCTC-3’反向引物SNP9-R:5’-CATCTCTGCGTCTTCTCT-3’正向引物SNP10-F:5’-GCTTTTCTCTACTACTCCGTG-3’反向引物SNP10-R:5’-GTTGTCTGTTCATCTGTCTT-3’注：為了增加分辨率，以上各正向引物中3’端附近，人工引入新的錯(cuò)配，以加粗斜體標(biāo)記；下劃線標(biāo)記的核苷酸位點(diǎn)為SNP位點(diǎn)。A.2陽性模板序列及其質(zhì)粒構(gòu)建采用DNA全人工合成的方法，分別獲取以下10個(gè)DNA片段，用酶切連接等方法分別將其插入至pM18T載體（或其它同類型克隆載體）上，轉(zhuǎn)化至Escherichiacoli工程菌株DH5α中進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。用質(zhì)粒提取試劑盒獲取含有目的片段的質(zhì)粒，作為實(shí)時(shí)熒光PCR陽性模板。6T/ZJSC0003-20231)引物對1的陽性模板片段序列：>Seq1TATCAGAAAAGTGCTGCAGCACAGAACAAGAGGAAACACATCAGCTCCAGCAGAGGAAAAGGGAAAGCTTGTGGCGGATATCCTCACTGCCTCTTTGTAGAGGTGTCTCATCCTGTGGCCTGGATAAAAAACAAGTCAACTTTTTAGGAATAAAAAGGAAGCAGCATAAATTTATGAGCGATTAACATGGATTAGTCAGCAGCTCCAAAGTCAAAGTACCTCCTAATAAAACAAAAGCCCATGTATATTGTATAATATTGTATAATGTCTTTTTTTTGTTGTTGCTTCAGCTTGTAGTGTCTCTGTTGTTGTGCTGACTCAGCATCTTACAGGACAGGATACAGAAGATGCTGGAAATAGACTGAAGCCTGAGTCTGGGAATCTCTCTGACATAAAGTCAA2)引物對2的陽性模板片段序列：>Seq2AGACAATGTGATGTCGCAGTGAAATTTCCCACCGTCGCCCAACGATAATACAAAAGCAATCAGCTGCAGCAGAGGCAGAAACAGCCATCCCTCCATCATCCGTAGCCTCAGGAGACGAGAATATAACACAGCCACATGACAGGTTATCTCCTAACCACATGTCAGTGTGGGATGTGGTTTCAGTCGTAATGCAGAAAGCCATTTTTGGGTGTTGTCGAAAGACTGTTTTTTAAGGAAAAGTTAAATTAAAGTAGACAAGTCGGATTCTGGCACAACAAAAACATGGAATTACATCACTTAAGTACTAAAAAGCTCCTAGAATGACGTGAACATCCCAAAATAATGTTTTCTTCTTCTTTGGGTTAAGTTTTTACCAACTTTAACACATCCAGGGTGTTTTA3)引物對3的陽性模板片段序列：>Seq3GCACAATGTGATCACAATAACAAAAAAGTCGATTTATACTTTTATACTGTTATCATGCTCACTCTATCAAGACCATACCCACATGGACTCAGTGTTATGAAAGCATGTAAACGGCGGCATGATGTGAACGGTCAAAACAGGCCATTTACATAAACTTAGTTTGAGACTAGTCTTGGCCTTAGACTGCTCTTAAATTACCAGGTTTCACTGTGTGTTGCTTCAAGATTAACACTTATGTGAGGTGAGAACATTTGCGAGCTCTCCCTTTAGCTAAGCCTGAGGTGAGAACTTTGTTGAAATGCAACAATCTGTAAGAACATCAGGTAGAACACAAAGGTATACACAGGTACACTAAAAAAAGAAACAGAGGAGCAAATTCTATATTAATGAGAGTGCAACTT4)引物對4的陽性模板片段序列：>Seq4CTCATACAGATTTTTCCTAGTTTCTTATCTGTAGACGCATCCTGAAATTTAACATGAATGGAAATAAATTGTAAATAATACGTGAATAAAACGAGATGAGTGTTTTAACCTTTTTATCCTGTGACATATTCAGTCATTTATGTTGTCCCTGTCATATCTGCACCCAGGAGGATAAGAACCTCATTCATGGAAACGTTTGTGCCAAGAATGTTCTTCTGATCAGAGAAGAGGATCGGACCACAGGCAGCCTGCCCTTCATTAAACTCAGTGATCCAGGCATCAGCATCACCGTGCTGCCCAAAGAAGGTGAGACACGCGTCTGCATGTTGTGTGAAGACTTGTGCATCACGCCATCACTTCCATTTATGTATCTCTTTCTTTCTGTCCATCAGTTCTGGTGG5)引物對5的陽性模板片段序列：>Seq5TTGCCAAATACTTTTTTTTTTTTTCAAGCATCAGAACAATTTCATCCAGTCAGAAGAGGACTTGTCCACACTGAATACTAATTCCCTTCCATCAGCGTCTCTTATTTGGTCTGGATGACAAAAGTTTGCCACAAAACTGCATATAGTCACGTGTGTCAGTGCTCCATGCCACATTGCTGTGAGTCACACAGAGCAGTTGCCGTTGCATAAACATGATCTTGATGAATCCATCAGTATTGCTCATCTCGAAATAAAAGCAGGGCAGCGACCTGCACGCAGCCGGAGATCTGACACTCACAGGTGCTTGGCCACTGCTGAGGCAGGCAGACTGAAGGCAGAGACTGTTTGCTCTAAAGTTAATCAGTAACTGCACATGTTCAGGTCACCTCTTCTGTGTTACC6)引物對6的陽性模板片段序列：>Seq6TCCAACCGAGGAGCTGCATGCTGCCTGAATGACAATCATGCTCCTCTCCCAAAGCAGGCAGGGTCAGAGTGAAAGTGCACATCCACGGCCTTAGACAGTTCGACAGAAACACATGAAACCAATGACTGAGGCCTCTGTTGTACTGCCAACGCAAAGATAAGATCATTTTCTTGACCTTGAAATGAGCACTGCCTCTACATTTTGTGCTTTAAAGTCACATTTTATAACTTAGCTAACAAAAACGATGCTACTCTGACTTGTTATCAGATGAATGGTGTCTCATCTCTTCTTTTACTATGTGACATTGTGCTCTGGGTATGCATTTACTACACAAAACCAAAAAGCAGTCTGTGTTAAGTGCAAGATTAACAAATCTTACCAGTATCTGTTGTGCTCATCTA7)引物對7的陽性模板片段序列：T/ZJSC0003-2023>Seq7AAGGAGCAGAGTCTGGTCAAGCACAGTTTGGGAAAATGTGTGGAAGGCGTTAACGAGCAGGTTTCAGTGGCGGAGTGAAGGCTGACAAGTTTATATACTGCGAAAGATTGAGCACGCGGACGCGCGCACGAGTGCGGCGGGAAGAAACGCGCGCGTGCGCATTAAGCAATGACCGTACATTAGCTTAATGAGACGTAGCATCATCTACTATGCTGTAATGTACGGAGCCTACTGTGTACTCGAGGCTGTGAGGAGGAGCTTTAAAACACTCCAAACCTGTTTTACCTGAAGAGTTTTGCTTTGTTTGGTTTGCATTAAAAATCTCAACTATCTGGCTAACACCATATTCTATATCTGGCAGCGCCATGACTAGCTCAGATGTCACACTTCCTACTATTCGC8)引物對8的陽性模板片段序列：>Seq8TAATTCTTCTGTGCTTAGTGCAGCTTCTCTTTTTTTCCAATAGTCTCTCAAGAGCTGTCTGTCAGCATCGTGAAACAAGACCACATAACGATCCCTGCACCAGTATCAAGAGAGCATATGATCCCAGACTTTTTCAGTCACACTGCTGTCTAATATATGCGCACACACCATGCCTACCAAGCAAAGACAAACACACACGTGCACATCTTGTTTCCAGGGCTTTGCTTCTTTAGCTGTCAGGACTGCAGGTGCTCCTTACCCTCAGTCACTTTCTTGTTTTGTCATGTGCGAGGACATTGTATTGACTCGTTCCCAAGAGGCTTCATGTCTCCTTCAAATTAATATAGCTGTATGGCATGTCGTGCAGCAACAGCTACAGGCAGAAGCCTTCAT