(高清版)GBT 18644-2020 豬囊尾蚴病診斷技術(shù)

ICS11.220代替GB/T18644—2002Diagnostictechniquesforporcinecysticercosis國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì) 12規(guī)范性引用文件 1 1 14.1試劑 14.2儀器設(shè)備 14.3蟲體采集 24.4壓片制備 24.5顯微鏡檢查 24.6顯微鏡檢查結(jié)果判定 2 25.1試劑 25.2儀器設(shè)備 2 3 35.5PCR操作程序 35.6擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測 45.7試驗(yàn)成立條件 4 4 46.1試劑 46.2儀器設(shè)備 46.3樣品 56.4試驗(yàn)步驟 56.5試驗(yàn)成立條件 6 67Dot-ABC-ELISA 67.1試劑 67.2儀器設(shè)備 77.3樣品 77.4試驗(yàn)步驟 77.5試驗(yàn)成立條件 87.6Dot-ABC-ELISA結(jié)果判定 8IⅡGB/T18644—2020附錄A(規(guī)范性附錄)生理鹽水及豬囊尾蚴頭節(jié)形態(tài)特征 附錄B(規(guī)范性附錄)PCR引物位置、溶液配制及電泳結(jié)果 附錄C(規(guī)范性附錄)ELISA試劑及其配制 附錄D(資料性附錄)豬囊尾蚴TS-CC18重組蛋白的制備 附錄E(資料性附錄)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的加樣 附錄F(資料性附錄)豬囊尾蚴TS-CC18和烯醇化酶單克隆抗體的制備 附錄G(資料性附錄)Dot-ABC-ELISA相關(guān)試劑配制及結(jié)果判定 ⅢGB/T18644—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T18644—2002《豬囊尾蚴病診斷技術(shù)》,與GB/T18644—2002相比，除編輯性修—范圍部分增加了PCR和Dot-ABC-ELISA技術(shù)(見第1章);-——增加了縮略語部分(見第3章);——增加了病原的PCR檢測方法(見第5章);——修改了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的檢測抗原和檢測步驟，直接對血清樣品進(jìn)行抗體檢測(見第6章，2002年版的第3章);——增加了檢測循環(huán)抗原的Dot-ABC-ELISA方法(見第7章);——增加了綜合判定(見第8章);——增加了生理鹽水及豬囊尾蚴頭節(jié)圖片(見附錄A),PCR引物位置、溶液配制及電泳圖片(見附錄B),ELISA試劑及其配制(見附錄C,2002年版的附錄A),豬囊尾蚴TS-CC18重組蛋白的制備(見附錄D),間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)加樣示例(見附錄E),豬囊尾蚴TS-CC18和烯醇化酶單克隆抗體的制備(見附錄F),Dot-ABC-ELISA相關(guān)試劑配制及結(jié)果判定(見附錄G)。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：--—GB/T18644—2002。GB/T18644—2020豬囊尾蚴病(porcinecysticercosis)是由豬帶絳蟲(Taeniasolium)的幼蟲所引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將該病列為需申報(bào)的疾病之一。目前，該病廣泛存在于發(fā)展中嚴(yán)重威脅人類健康。豬囊尾蚴病的診斷包括病原學(xué)診斷與血清學(xué)診斷。病原學(xué)診斷的目的在于確定臨床剖檢樣本中蟲體的形態(tài)特征，在顯微鏡下觀察頭節(jié)頂突上有內(nèi)外兩圈排列整齊的小鉤，即可判為豬囊尾蚴。若囊尾蚴主要寄生于肝臟，則要注意與亞洲帶絳蟲囊尾蚴相區(qū)別。目前，該病的生前診斷主要采用血清學(xué)方法，且抗原來源非常有限。鑒于以上原因，本次對GB/T18644—2002《豬囊尾蚴病診斷技術(shù)》的修訂，除間接ELISA所用抗原改為豬囊尾蚴期特異性18ku基因(TS-CC18)重組蛋白外，還增加了血清循環(huán)抗原(CAg)檢測方法和病原的PCR檢測方法，以滿足豬囊尾蚴病流行病學(xué)調(diào)查、藥物治療效果評價(jià)和動(dòng)物流通風(fēng)險(xiǎn)評估等不同需求。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時(shí)，可能涉及到第6章間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)相關(guān)的專利使用。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對于該專利的真實(shí)性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)保證，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：地址：甘肅省蘭州市鹽場堡徐家坪1號。請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。GB/T18644—2020豬囊尾蚴病診斷技術(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬囊尾蚴病的顯微鏡檢查、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR法)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA)、斑點(diǎn)生物素-親和素復(fù)合物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ABC-ELISA)診斷技術(shù)及綜合判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬和野豬的囊尾蚴病診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。CNAS-GL029:2018基因擴(kuò)增領(lǐng)域檢測實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可指南3縮略語下列縮略語適用于本文件。Avidin-HRP:親和素-辣根過氧化物酶(Avidin-HorseradishPeroxidase)DAB:二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-Diaminobenzidine)Dot-ABC-ELISA:斑點(diǎn)生物素-親和素復(fù)合物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-Avidin-Biotin-Complex-ELISA)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)HRP:辣根過氧化物酶(HorseRadishPeroxidase)IPTG:異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside)NC:硝酸纖維素(Nicrocellulose)OPD:鄰苯二胺(O-phenylenediamine)PBS:磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferedSaline)PBST:洗滌液(PBScontaining0.5%Tween-20)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)TMB:四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-TetramethylBenzidine)4顯微鏡檢查4.1試劑生理鹽水配制見附錄A中的A.1。4.2儀器設(shè)備—2GB/T18644—2020肌肉或內(nèi)臟組織，用手術(shù)刀將其切成約1cm厚的薄片，仔細(xì)檢查切口有無蟲體。成熟的豬囊尾蚴為長生的則為圓球形，直徑8mm～10mm。以手術(shù)刀和鑷子剝離肌肉等組織中的囊尾蚴，用生理鹽水吸盤(見圖A.1),即判為豬囊尾蚴；如頂突無小鉤則判為亞洲帶絳蟲囊尾蚴。豬囊尾蚴蟲體應(yīng)于—20℃或—70℃冰箱凍存。5.1.1.3MgCl?(25mmol/L)。5.1.2.1電泳緩沖液：50×TAE貯存液(見附錄B中的B.2.1),臨用時(shí)加蒸餾水配成1×TAE緩沖液(見B.2.2)。5.1.2.4DNAMarker(DNA標(biāo)志物):條帶大小依次為100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。5.2.1PCR擴(kuò)增儀。5.2.2臺式低溫高速離心機(jī)。5.2.3穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽。5.2.4凝膠成像儀(或紫外透射儀)。3GB/T18644—20205.2.5微量可調(diào)移液器(量程為0.1pL～2.5μL、0.5μL～10μL、10μL～200μL、100μL～1000pL)。5.2.6無核酸酶的離心管與吸頭。5.2.7PCR擴(kuò)增管。根據(jù)豬帶絳蟲線粒體ND1部分序列設(shè)計(jì)如下引物：PCR擴(kuò)增片段的核苷酸序列及引物的位置見B.1。用去離子水將每條引物配成100μmol/L的儲存液，置于—20℃凍存。5.4樣品5.4.2陽性對照：用豬囊尾蚴蟲體提取的DNA。5.4.3陰性對照：依據(jù)蟲體采集部位，用未感染豬肌肉或肝臟提取的DNA。5.5PCR操作程序5.5.1DNA提取用DNA提取試劑盒提取囊尾蚴和肌肉的基因組DNA。DNA提取應(yīng)符合CNAS-GL029:2018基因檢測實(shí)驗(yàn)室區(qū)域的設(shè)置原則。5.5.2PCR反應(yīng)體系采用50μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增體系包括：10×PCR反應(yīng)緩沖液dNTP(2.5mmol/L)MgCl?(25mmol/L)去離子水將PCR擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，設(shè)定擴(kuò)增程序：——第二階段，95℃變性30s,45℃退火40s,72℃延伸60s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；4GB/T18644—2020——第三階段，72℃延伸5min。5.6.11.2%瓊脂糖凝膠的制備：稱取1.2g瓊脂糖，加入100mL1×TAE緩沖液(見B.2.1和B.2.2)中。加熱融化后加5μL質(zhì)量濃度為10mg/mL的溴化乙錠，混勻后倒入放置于水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔),放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液浸沒膠面約3mm。5.6.2加樣：取10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2μL加樣緩沖液(見B.2.3)混勻后加入一個(gè)加樣孔。每次電泳凝膠成像儀下觀察。5.7試驗(yàn)成立條件陽性對照樣品有一條474bp擴(kuò)增條帶，陰性對照無條帶或僅有引物二聚體條帶(<100bp),則試驗(yàn)成立。待測樣品有一條474bp的擴(kuò)增條帶，可判定該蟲種為豬囊尾蚴(見圖B.1)。6間接ELISA6.1試劑6.1.1包被抗原：豬囊尾蚴TS-CC18重組抗原。由構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-28a(十)-TS-CC18轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選高表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用Ni柱親和層析純化制備而成。使用時(shí)用碳酸鹽包被緩沖液(pH9.6)稀釋至工作濃度。然凝結(jié)法分離血清。檢測時(shí)用樣品稀釋液稀釋至工作濃度。6.1.3陽性對照血清：豬高免血清。由TS-CC18純化抗原免疫健康豬制備，檢測時(shí)用樣品稀釋液稀釋6.1.4酶結(jié)合物：兔抗豬IgG-HRP結(jié)合物。檢測時(shí)用樣品稀釋液稀釋至工作濃度。6.1.6洗滌緩沖液：含0.5%吐溫-20的0.002mol/LPBS(pH7.2～7.4),見C.2。6.1.7封閉液1:含0.25%BSA和0.25%酪蛋白等的0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4),見C.3和C.4。6.1.8樣品稀釋液：含0.5%BSA的0.02mol/LPBS(pH7.2～7.4),見C.5和C.6。6.2儀器設(shè)備6.2.2酶標(biāo)儀(帶450nm、490nm和630nm波長濾光片)。6.2.3酶標(biāo)板(96孔)。6.2.4與96孔酶標(biāo)板配套使用的振蕩器。6.2.5血清稀釋板。5GB/T18644—20206.2.7洗板機(jī)或洗滌瓶。6.2.9多道微量可調(diào)移液器(量程為20μL～300μL)。6.2.10與移液器匹配的各種吸頭。6.2.11量筒(100mL和2000mL)。6.2.12計(jì)時(shí)器。6.2.13貯液槽。6.2.14封板膜。6.2.15紗布和吸水紙等。6.4.1豬囊尾蚴TS-CC18重組抗原制備構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(十)-TS-CC18,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選的陽性菌株用終濃度為0.5mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得帶6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽的TS-CC18重組蛋白；采用NiSepharose6FF親和層析法進(jìn)行純化。TS-CC18重組抗原詳細(xì)制備及鑒定方法參見附錄D。將純化的TS-CC18蛋白按終濃度50μg/mL稀釋于pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液(見C.1)中；每孔100μL加入96孔酶標(biāo)板，4℃包被過夜。PBST洗板3次后，每孔加120μL封閉液1(見C.4)于37℃作用2h。PBST洗板3次，在干凈紗布或吸收紙巾上拍干。經(jīng)干燥儀充分干燥，用真空包裝機(jī)密封于將待檢血清及陰性、陽性對照血清用樣品稀釋液分別作1:50稀釋(294μL樣品稀釋液加血清參照附錄E中的圖E.1加樣示例圖進(jìn)行加樣。ELISA板A1、A2和A3設(shè)為空白對照孔，A4、A5每孔中加300μLPBST,重復(fù)洗滌3次后在吸水紙上拍干。用樣品稀釋液將兔抗豬酶標(biāo)抗體稀釋至工作濃度(1:20000),每孔100μL,封板后同前孵育60min。66.4.7再洗滌每孔中加300μL的PBST,重復(fù)洗滌4次后在吸水紙上拍干。6.4.8加底物溶液加100μL,封板，避光37℃孵育15min～20min。6.4.9加終止液和判讀結(jié)果每孔加50μL2mol/L的H?SO?終止液，混勻后在分光光度計(jì)490nm/630nm下判讀結(jié)果。6.4.10試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理6.4.10.1計(jì)算空白對照的平均OD?90值。6.4.10.2分別計(jì)算陰性和陽性對照血清的平均OD?90值。6.4.10.3分別計(jì)算每份待檢血清樣品的平均OD?90值。6.4.10.4根據(jù)公式(1)計(jì)算待檢血清與陰性血清平均OD值的比值P/N:P/N=(A?—A?)/(A?—A?)………(1)式中：A?——待檢血清樣品平均OD?90值；A?-——空白對照平均OD?90值；A?——陰性對照血清平均OD?90值。6.5試驗(yàn)成立條件當(dāng)空白對照平均OD?。o值<0.10,陰性對照血清平均OD4oo值≤0.30,陽性對照血清平均OD?90值>1.06.6ELISA結(jié)果判定待檢血清P/N≥2.1判定為陽性，P/N<2.1判為陰性。7Dot-ABC-ELISA7.1.1生物素標(biāo)記單抗：Bio-1F1、Bio-2B5和Bio-6G4單抗制備及標(biāo)記參見附錄F。7.1.2陰性對照抗原：牛血清白蛋白，檢測時(shí)用PBS稀釋至工作濃度(50μg/mL)。7.1.3陽性對照抗原：豬囊尾蚴TS-CC18重組抗原。檢測時(shí)用PBS稀釋至工作濃度(50pg/mL),制備方法參見附錄D。7.1.4Avidin-HRP:親和素-辣根過氧化物酶標(biāo)記物。7.1.60.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2～7.4):見C.3。7.1.720%三氯乙酸(TCA):參見附錄G中的G.1.1。7.1.8封閉液2:含1.0%明膠的0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4),參見G.1.2。7.1.9DAB底物溶液：參見G.1.3。7GB/T18644—20207.2.2圓形打孔器(直徑6mm～8mm)。7.2.31.5mL微量離心管。7.2.5與各移液器匹配的標(biāo)準(zhǔn)吸頭。7.2.737℃恒溫培養(yǎng)箱。7.2.10量筒(100mL和1000mL)。取上層血清用等體積20%TCA室溫沉淀20min,4℃、10000g離心10min,吸取上清于干凈離心管中，作為待檢樣品。將固定樣品的NC膜置于干凈平皿，PBST重復(fù)漂洗3次。將NC膜置于封閉液2中，37℃孵育1h。同7.4.3洗滌。按1:1:1混勻，用PBS稀釋(工作濃度均為1:100)。將NC膜置于稀釋好的抗體工作液中，37℃搖床(50r/min)孵育1h,取出NC膜，用PBST用PBS稀釋Avidin-HRP(工作濃度1:500),與NC膜于37℃搖床(50r/min)孵育1h。移去液將NC膜置于新鮮配制的DAB顯色液中，避光反應(yīng)3min～5min。顯色后迅速取出NC膜置于PBST中終止反應(yīng)，觀察斑點(diǎn)顯色強(qiáng)度。7.5試驗(yàn)成立條件陽性對照孔出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)，陰性對照孔無色或接近無色者試驗(yàn)成立。待檢樣品斑點(diǎn)顯色者(++:棕色；十：淺棕色)判定為陽性，無色或接近無色者判定為陰性(參見8綜合判定8.1受檢樣品經(jīng)第6章ELISA檢測出豬囊尾蚴抗體的，判定為該動(dòng)物豬囊尾蚴抗體陽性。該結(jié)果可用于豬囊尾蚴病宰前檢疫的初篩和流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測。8.2受檢樣品經(jīng)第7章Dot-ABC-ELISA檢測出豬囊尾蚴抗原的，判定為該動(dòng)物豬囊尾蚴抗原陽性。該結(jié)果可用于豬囊尾蚴活蟲感染的檢測和藥物療效評價(jià)。8.3受檢樣品經(jīng)第4章顯微鏡檢查和第5章PCR法任一項(xiàng)鑒定為豬囊尾蚴蟲體的，確診該動(dòng)物感染豬囊尾蚴。8.4檢疫方法根據(jù)屠宰場具體條件進(jìn)行選擇。89GB/T18644—2020(規(guī)范性附錄)生理鹽水及豬囊尾蚴頭節(jié)形態(tài)特征A.1生理鹽水生理鹽水配制如下：氯化鈉去離子水0.85gmLA.2豬囊尾蚴頭節(jié)形態(tài)特征豬囊尾蚴頭節(jié)形態(tài)特征見圖A.1。圖A.1豬囊尾蚴頭節(jié)形態(tài)特征GB/T18644—2020(規(guī)范性附錄)B.1PCR引物位置7381AAAATAGTGATTTGTCTAGTCATAGATAGTAGTTTAATAACTAGGCCACTTAGTAGTTTA7441GTTAAAATGATTATTTTTGGGTTTATTAGTGGTTTTATGGGTTTGTTAATTTGTTTATTA7501ATTATAGCTTTTTTTATATTAGGGGAACGTAAGATTTTGGGTTATTCTCAATTTCGTAAG7561GGTCCTAATAAGGTTGGTATTGTAGGATTGTTACAAAGGTTTTCTGATTTATTAAAGTTG7621ATAATTAAGTTTAAGAATTGTGGATTTCAGAGTCGTAGTTGAGTTGGTTTGTTTGGGGTT7681ATGTTGTTGGTTAGTTTAGTTATTTATTATTCATTTGTATATGGTGGTTATTATAGGTAT7741AGGTTTAATTCTCTTTCTTTGTTATGGTTTTTGGTTATAACTAGATTTTGTAGTTATTCG7801ATATTATGTACGGGTTGAGGTAGTTATAAAAGTTATTCGTTTTTAAGTTCAATTCGTTGT7861GCTTTTAGGTCTATAAGGTTTGAGGCTTGTTTTATGAGTATTATAATATTTACTGCATTGB.2溶液配制B.2.150×TAE貯存液三羥甲基氨基甲烷(Tris)乙二胺四乙酸(EDTA)冰乙酸加去離子水至B.2.21×TAE緩沖液使用前將50×TAE作50倍稀釋即可。溴酚藍(lán)甘油去離子水242.0g0.25gB.3PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖B.1。GB/T18644—2020700bp500bp400bp300hp200bp2—-陰性對照。圖B.1PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳GB/T18644—2020(規(guī)范性附錄)ELISA試劑及其配制C.1包被緩沖液(CBS,0.05mol/LNa?CO?/NaHCO?,pH9.6)無水碳酸鈉(Na?CO?)無水碳酸氫鈉(NaHCO?)2℃~8℃保存1個(gè)月有效。C.2PBST(pH7.2～7.4)磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O)磷酸二氫鉀(KH?PO?)氯化鉀(KCl)氯化鈉(NaCl)2.93g2.9g0.5mLC.30.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)Na?HPO?·12H?ONaH?PO?·2H?ONaCl加去離子水至2.9g103.4kPa高壓蒸汽滅菌20min,4℃冰箱保存。牛血清白蛋白(BSA)酪蛋白蔗糖滅菌0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)2.0g加Proclin300(防腐劑)0.1mL,充分混勻，4℃保存或—20℃凍存。C.50.02mol/LPBS(pH7.2～7.4)Na?HPO?·12H?ONaH?PO?·2H?ONaClGB/T18644—2020加去離子水至1000mL103.4kPa高壓蒸汽滅菌20min,4℃冰箱保存。C.6樣品稀釋液牛血清白蛋白(BSA)0.5g吐溫-200.05mL0.02mol/LPBS(pH7.2～7.4)100mL加Proclin300(防腐劑)0.1mL,充分混勻，4℃保存或—20℃凍存。C.7OPD底物溶液磷酸鹽-檸檬酸片劑鄰苯二胺片劑(OPD)去離子水定量分裝(5mL/瓶或10mL/瓶),避光-20℃保存。用前避光溶化，每10mL溶液加入10μL30%雙氧水(H?O?),立即使用。C.8終止液(2.0mol/L濃硫酸)取112mL分析純濃硫酸(H?SO?)緩慢加入888mL去離子水中，混勻，分裝室溫保存。GB/T18644—2020(資料性附錄)D.1重組菌將豬囊尾蚴18ku糖蛋白基因(TS-CC18)構(gòu)建于pET-28a(十)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),命名為pET-28a(十)-TS-CC18/BL21(DE3),—70℃保存。D.2TS-CC18重組蛋白表達(dá)取-70℃保存的pET-28a(+)-TS-CC18/BL21(DE3)重組菌按1:100的比例接種于10mL的D.2.2重組菌誘導(dǎo)表達(dá)取D.2.1中過夜培養(yǎng)物10mL接種于1000mLLB選擇性培養(yǎng)基中，37℃、230r/min振搖至OD?00為0.5～1.0,加入IPTG至終濃度0.5mmol/L,28℃D.3.1包涵體的洗滌及溶解-70℃反復(fù)凍融3次，加入200μL10mg/mL溶菌酶、10μL100mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)及25μLTriton置37℃培養(yǎng)箱溫育15min后，在冰浴中超聲破碎菌體20min(功率600W,工作3s,間歇5s)。4℃、13000g離心10min收集沉淀。將收集的沉淀用洗滌緩沖液充分重懸，加入終濃度為0.2%脫氧膽酸鈉(DOC),混勻，室溫靜置20min,13000g離心10min收集包涵體沉淀；反復(fù)洗滌3次。再以含終濃度2%DOC的洗滌緩沖液同上洗滌包涵體3次。在洗滌后的包涵體中加入結(jié)合緩沖液(0.05mol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl,0.2%TritonX-100,使沉淀慢慢溶解，室溫靜置約1h。D.3.2鎳柱親和純化蛋白按NiSepharose6FF說明書操作進(jìn)行親和層析純化目的蛋白。每1L培養(yǎng)物的包涵體裂解液中加入2mLNiSepharose6FF填料進(jìn)行結(jié)合，再用100mL結(jié)合緩沖液洗去雜蛋白。將200mmol/L~400mmol/L咪唑梯度洗脫的TS-CC18重組蛋白合并、濃縮后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)分析蛋白濃度及純化效果。GB/T18644—2020D.4TS-CC18重組蛋白檢測D.4.1SDS取重組蛋白樣品，加入2×蛋白上樣緩沖液混勻，水浴煮沸5min上樣。用80V電壓電泳至溴酚藍(lán)到分離膠，把電壓提高到120V,繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。取下凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染色2h后脫色，待藍(lán)色背景脫凈后，觀察和分析電泳結(jié)果。D.4.2純化蛋白濃度測定用紫外分光光度法測定TS-CC18重組蛋白濃度，根據(jù)公式(D.1)計(jì)算蛋白濃度：M=(1.45×OD?so—0.74×OD??0)×N…(D.1)式中：M——蛋白濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);以O(shè)D?s?/OD?60>1.6為蛋白純度合格。(資料性附錄)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的加樣圖E.1為間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)加樣示例圖。123456789A空白對照空白對照空白對照陰性對照陰性對照陰性對照樣品1樣品1樣品2樣品2B樣品3樣品3樣品3樣品4樣品4樣品4樣品5樣品5樣品5樣品6樣品6樣品6樣品7樣品7樣品7樣品8樣品8樣品8樣品9樣品9樣品9樣品樣品樣品D樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品E樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品F樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品G樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品H樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品陽性對照陽性對照陽性對照GB/T18644—2020(資料性附錄)豬囊尾蚴TS-CC18和烯醇化酶單克隆抗體的制備F.1免疫抗原構(gòu)建豬囊尾蚴TS-CC18和烯醇化酶TsENO基因原核表達(dá)載體pET-28a(+)-TS-CC18和pET-30a(十)-TsENO,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選高表達(dá)菌株；以終濃度0.5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)TS-CC18和TsENO重組蛋白；采用NiSepharose6FF親和層析法進(jìn)行純化獲得TS-CC18和F.2動(dòng)物免疫采用常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，一共4次，免疫間隔21d。首次免疫取0.01mol/LPBS稀釋的5只；第2次、第3次免疫將抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背部、皮下及足跖部，注射抗原量倍增；第4次經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。F.3抗體效價(jià)測定采用間接ELISA方法，以包被液將TS-CC18和TsENO抗原均稀釋至工作濃度(10μg/mL),分別包被96孔酶標(biāo)板(防止產(chǎn)生氣泡),每孔100μL,37℃水浴作用2h后置4℃過夜。以PBST洗滌3次，在紙巾上拍干。每孔加入120μL封閉液1(見C.4),37℃封閉2h,瀝干；加入1:40～1:20480倍比稀釋的免疫小鼠血清，并以正常小鼠的血清作陰性對照。37℃孵育30min,PBST洗滌4次。加入羊抗鼠IgG-HRP,37℃孵育30min,PBST洗滌5次。以TMB顯色液避光顯色10min,2mol/L硫酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)檢測儀測定OD?so值；效價(jià)達(dá)到1:20480為免疫合格，取效價(jià)最高的小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。F.4雜交瘤細(xì)胞株的建立將凍存SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞從液氮中取出后，立即放到37℃溫水中溶解，1000g離心10min。無菌條件下用吸管吸取上清，然后用無血清的RPMI-1640洗滌，混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。把細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于5%CO?、37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。每隔1d傳一次，一瓶傳兩瓶。在進(jìn)行傳代培養(yǎng)的時(shí)候，用8-氮鳥嘌呤進(jìn)行處理，每瓶100μL,選擇其中生長良好的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。F.4.2飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備在超凈工作臺上，取健康的成年小鼠的腹腔細(xì)胞混于60mLHAT培養(yǎng)基中，按每孔100μL轉(zhuǎn)入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，共6板。在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使飼養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到10?個(gè)/mL,以促進(jìn)GB/T18644—2020融合細(xì)胞的生長。F.4.3脾細(xì)胞的準(zhǔn)備在超凈工作臺上，取抗體效價(jià)最高的免疫小鼠脾臟，置于金屬網(wǎng)中，用注射器芯輕輕研磨，并用20mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗脾臟細(xì)胞。將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到10mL離心管中，1000g離心F.4.4細(xì)胞的融合將培養(yǎng)好的6瓶～8瓶骨髓瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，1000g離心5min。棄上清，用10mL無血清RPMI-1640懸浮，顯微計(jì)數(shù)。脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按10:1混合，以PEG4000融合后轉(zhuǎn)入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL,于37℃在5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。F.4.5雜交瘤細(xì)胞