實(shí)驗(yàn)二 淀粉酶活性的測(cè)定

Pleasebequiet,上課了?。?/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)淀粉酶活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)二學(xué)時(shí)：36/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、學(xué)習(xí)并掌握植物體內(nèi)淀粉酶活性測(cè)定的原理和方法。

2、掌握α，β-兩種淀粉酶的理化特性。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)原理酶（enzyme）是具有高效性與專一性的生物催化劑（biologicalcatalyst）。

絕大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。特點(diǎn)：1、酶具有高效性（highcatalyticpower）2、酶具有專一性（specifity）6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)原理:

酶活性（emzymeactivity）

指酶催化特定化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用一定條件下酶促反應(yīng)速度來(lái)表示，酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

二、實(shí)驗(yàn)原理:

淀粉是植物生長(zhǎng)期間以淀粉粒形式存在于細(xì)胞的儲(chǔ)存多糖。種子、塊莖、塊根器官含量豐富。

天然淀粉含兩種組分：直鏈和支鏈淀粉。多數(shù)淀粉含直鏈與支鏈淀粉的比例(20％－25％)：(75％－80％)。6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)NRERE直鏈淀粉直鏈淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)0.8nm1.4nm6個(gè)殘基RENRE

(1-6)分支點(diǎn)支鏈淀粉或糖原分子示意圖支鏈淀粉或糖原分支點(diǎn)的結(jié)構(gòu)β-淀粉酶斷裂產(chǎn)生游離麥芽糖6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)RENRE

(1-6)分支點(diǎn)支鏈淀粉或糖原分子示意圖β-淀粉酶斷裂產(chǎn)生游離麥芽糖淀粉酶能催化淀粉水解為麥芽糖。6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)植物中淀粉酶有兩種，各有其不同的理化特性。

α-淀粉酶耐熱不耐酸，70℃加熱15min仍保持活性,pH＜3.6時(shí)鈍化。

β-淀粉酶耐酸不耐熱，70℃加熱15min則鈍化。據(jù)此鈍化其中之一，即可測(cè)出另一種酶的活性。6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用加熱法鈍化β-淀粉酶，測(cè)定α-淀粉酶的活性。具體方法是利用3,5-二硝基水楊酸比色法來(lái)測(cè)定淀粉酶水解生成的麥芽糖的含量，以單位時(shí)間淀粉酶分解生成麥芽糖的量來(lái)表示淀粉酶活性的大小。6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

在堿性，加熱條件下，還原糖與3,5-二硝基水楊酸(DNS)

反應(yīng)，還原糖被氧化成糖酸，DNS被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。3-氨基-5-硝基水楊酸(棕紅色,A540)3,5-二硝基水楊酸

(DNS)6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料：萌發(fā)的小麥種子2、儀器：(1)可見(jiàn)分光光度計(jì)

(2)恒溫水浴鍋

(3)離心機(jī)

(4)刻度試管3、試劑：(1)0.4MNaOH；

(2)1%淀粉；

(3)3,5-二硝基水楊酸；

(4)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg/ml)。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)步驟1.麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取5支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按表1加入試劑：表1麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作試劑管號(hào)12345麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.51.01.52.0蒸餾水（mL）2.01.51.00.50麥芽糖濃度（mg/ml）00.250.50.751.03,5-二硝基水楊酸（mL）2.02.02.02.02.0沸水浴5min，冷卻，稀釋至20ml測(cè)定540nm處吸光度吸光度值06/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定光密度。以麥芽糖濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)2、酶液的制備：稱取2.0g萌發(fā)的小麥種子→于研缽中，加2ml水及少許石英砂，研成勻漿→轉(zhuǎn)入離心管→用6ml蒸餾水分三次洗滌研缽→均轉(zhuǎn)入離心管→用玻璃棒攪動(dòng)20min→等重→4000r/min離心10min→上清夜轉(zhuǎn)入100ml容量瓶→定容，此提取液即為淀粉酶液。6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)3、α-淀粉酶活性的測(cè)定：

（1）取兩支試管一支對(duì)照，一支測(cè)定→各加淀粉酶液1ml→70℃準(zhǔn)確加熱15min→冷卻→向?qū)φ展芗?ml0.4MNaOH，終止酶活性；（2）測(cè)定管和對(duì)照管于40℃水浴15min→均加入2ml40℃預(yù)熱的淀粉→立即40℃水浴保溫5min→取出后迅速向測(cè)定管加入4ml0.4MNaOH；6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（3）取對(duì)照管和測(cè)定管中溶液各2ml,分別加入到刻度試管中→各加2ml3,5-二硝基水楊酸→沸水浴5min→冷卻→稀釋至20ml刻度→混勻→以制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的1號(hào)試管為參比溶液，調(diào)“零”，測(cè)定540nm處吸光度→記錄結(jié)果。6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)酶液鈍化β-淀粉酶鈍化酶活性酶促反應(yīng)終止酶促反應(yīng)麥芽糖含量測(cè)定記錄結(jié)果對(duì)照管（A1）1ml70℃15min4mlNaOH2ml淀粉40℃5min分別取2ml溶液+2ml3,5-二硝基水楊酸沸水浴5min冷卻后稀釋至20ml混勻測(cè)定540nm處吸光度測(cè)定管（A2）1ml70℃15min2ml淀粉40℃5min4ml

NaOHα-淀粉酶活性的測(cè)定6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)4、淀粉酶總活力的測(cè)定

（1）取兩支試管一支對(duì)照，一支測(cè)定→各加酶液1ml，向?qū)φ展芗?ml0.4MNaOH，以鈍化酶的活性；（2）測(cè)定管和對(duì)照管于40℃水浴5min→均加入2ml40℃預(yù)熱的淀粉→立即40℃水浴保溫5min→取出后迅速向測(cè)定管加入4ml0.4MNaOH；6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（3）取對(duì)照管和測(cè)定管中溶液各2ml，分別加入到刻度試管中→各加2ml3,5-二硝基水楊酸→沸水浴5min→冷卻→稀釋至20ml刻度→混勻→以制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的1號(hào)試管為參比溶液，調(diào)“零”，測(cè)定540nm處吸光度→記錄結(jié)果。6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)酶液鈍化酶活性酶促反應(yīng)終止酶促反應(yīng)麥芽糖含量測(cè)定記錄結(jié)果對(duì)照管(B1)1ml4mlNaOH2ml淀粉40℃5min分別取2ml溶液+2ml3,5-二硝基水楊酸沸水浴5min冷卻后稀釋至20ml混勻測(cè)定540nm處吸光度測(cè)定管(B2)1ml2ml淀粉40℃5min4mlNaOH淀粉酶總活力的測(cè)定6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量（mg/ml），按下列公式計(jì)算α-淀粉酶和β-淀粉酶的活力。α-淀粉酶活力（麥芽糖毫克數(shù)/樣品鮮重?分鐘）

=（A2-A1）×V×D÷樣品鮮重÷時(shí)間其中：A2：為α-淀粉酶水解淀粉生成麥芽糖的濃度（mg/ml）（測(cè)定試管中麥芽糖濃度）；

A1：為對(duì)照管中麥芽糖的濃度（mg/ml）。

V：為酶促反應(yīng)體積；

D：為稀釋倍數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算：6/30/2024生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（α＋β）淀粉酶總活力（麥芽糖毫克數(shù)/樣品鮮重?分鐘）

=（B2-B1）×V×D÷樣品鮮重÷時(shí)間B2：為（α+β）淀粉酶水解淀粉生成麥芽糖的濃度（mg/ml）；B1：為對(duì)照管中麥芽糖的濃度（mg/ml）；V：為酶促反應(yīng)