芋脫毒種莖生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

芋脫毒種莖生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了芋試管種莖生產(chǎn)所需的儀器設(shè)備及化學(xué)試劑，培養(yǎng)基配制，材料選取、莖尖脫毒培養(yǎng)，脫毒苗增殖，試管種莖誘導(dǎo)，脫毒種莖移栽與貯存，脫毒種芋繁育的操作規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于芋脫毒種莖的生產(chǎn)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29378-2012馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程DB36/T919-2016綠色食品紅芽芋DB36/T921-2016紅芽芋脫毒種芋繁育技術(shù)規(guī)程術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。脫毒苗

應(yīng)用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的再生試管苗，經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)不帶芋花葉病毒（DsMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）等病毒，即確認(rèn)為脫毒苗。脫毒種莖用脫毒苗在無菌環(huán)境下誘導(dǎo)形成的微型球莖。原原種利用試管苗在容器內(nèi)生產(chǎn)的試管芋或在防蟲網(wǎng)室內(nèi)無菌營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)條件下培養(yǎng)生產(chǎn)出來的、不帶病毒、類病毒的種芋。組培所需的儀器設(shè)備及化學(xué)試劑儀器設(shè)備培養(yǎng)基制作及滅菌設(shè)備：天平、純水機(jī)、酸度計(jì)、高溫高壓蒸汽滅菌鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱等。無菌操作設(shè)備：超凈工作臺(tái)、滅菌器等。培養(yǎng)室設(shè)備：空調(diào)、定時(shí)器、培養(yǎng)架、搖床、光柵培養(yǎng)箱、人工氣候室等。藥品儲(chǔ)存與配制設(shè)備：冰箱、萬(wàn)分之一天平。觀察分析儀器：解剖鏡、顯微鏡、切片機(jī)等。常用器皿及器材包括培養(yǎng)器皿（試管、錐形瓶、培養(yǎng)皿及各類專用培養(yǎng)瓶等）、培養(yǎng)基分注器、細(xì)菌過濾器、金屬操作器械（鑷子、剪刀、解剖刀等）、盛裝器皿（燒杯、試劑瓶等）、計(jì)量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。常用化學(xué)試劑包括組培苗基本培養(yǎng)基所需的無機(jī)鹽類、有機(jī)物類及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)類等。MS基本培養(yǎng)基成分及母液配制參見附錄A；其它常用試劑及植物生長(zhǎng)物質(zhì)的配制參見附錄B。培養(yǎng)基制作培養(yǎng)基配制制作培養(yǎng)基前需先配制MS基本培養(yǎng)基母液（配方及配制方法見附錄A），配好后4℃保存（保存期不超過180d）。采用附錄C方法配制好固體MS培養(yǎng)基，組培瓶分裝后放入高壓蒸汽滅菌鍋（0.1Mpa，121℃）滅菌20min，取出冷卻凝固后備用。培養(yǎng)基配方莖尖成苗培養(yǎng)基：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g蔗糖+7g瓊脂粉，pH5.8，固體培養(yǎng)基；組培苗增殖培養(yǎng)基：MS+3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g蔗糖+7g瓊脂粉，pH5.8，固體培養(yǎng)基；脫毒種莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+80g蔗糖+7g瓊脂粉，pH5.8，固體培養(yǎng)基；材料選取選擇具備多子芋品種（如紅芽芋、白芽芋、花果芋等）典型性狀的株系，挑選植株健壯、長(zhǎng)勢(shì)良好的子芋球莖作為誘導(dǎo)材料。莖尖脫毒培養(yǎng)莖尖剝離首先，選取符合品種特性、形狀規(guī)則的子芋帶芽球莖，切下0.5cm左右的頂芽或側(cè)芽，剝下外層鱗片2-3層，清水沖洗干凈。其次，將芽置于干凈燒杯中，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)一步消毒（75%酒精浸泡45s，無菌水沖洗，0.1%氯化汞浸泡8min，無菌水沖洗干凈）。第三，將消毒后的芋芽置于解剖鏡操作臺(tái)，用鑷子和解剖刀片對(duì)芋芽莖尖進(jìn)行剝離，一手用鑷子固定芋芽，一手用解剖刀片進(jìn)行鱗片剝離，直至將鱗片剝離至可見近似球形莖尖（大小約0.2~0.4mm），用解剖刀片挑起剝離好的莖尖，接種于MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA（30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，調(diào)pH至5.8左右）試管培養(yǎng)基中。莖尖培養(yǎng)將接種莖尖的試管培養(yǎng)基放置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25℃，4000lx，14h/d），待莖尖長(zhǎng)至1個(gè)月時(shí)，將莖尖移至組培瓶中培養(yǎng)（MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA（30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，調(diào)pH至5.8左右）），進(jìn)一步培養(yǎng)成苗。組培苗病毒檢測(cè)莖尖培養(yǎng)的組培苗在誘導(dǎo)增殖之前進(jìn)行病毒檢測(cè)，芋花葉病毒（DsMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）等病毒，可采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（DAS-ELISA）和（或）反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)法，具體檢測(cè)方法按GB/T29378-2012執(zhí)行。然后送到國(guó)家法定植檢部門復(fù)檢認(rèn)定，沒有檢出DsMV和CMV等病毒的脫毒苗，即為脫毒苗?？蓪?duì)脫毒苗進(jìn)一步進(jìn)行增殖擴(kuò)繁。脫毒苗增殖將脫毒苗基部自發(fā)根系切除，然后將其轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)（MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA），培養(yǎng)1個(gè)月后，將增殖的芽再繼續(xù)切成單芽在增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每繼代1次單芽可增殖5~7個(gè)，每株脫毒苗繼代擴(kuò)繁5次后，可獲得3000~4000株脫毒苗。脫毒種莖誘導(dǎo)選取株高4cm~5cm的健壯試管苗，將莖基部自發(fā)根系切除，轉(zhuǎn)接到MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+80g蔗糖固體培養(yǎng)基上，在室溫25℃，4000lx光強(qiáng)和16h/d條件下培養(yǎng)，7d后可見脫毒苗基部膨大，40～50d試管芋發(fā)育到縱徑1.0cm，橫徑0.5cm以上時(shí)可以收獲。脫毒種莖移栽收獲時(shí)將試管芋從培養(yǎng)瓶中取出，用清水多次沖洗，直至洗凈表面附著的培養(yǎng)基，種植在滅菌后的草炭+蛭石（2:1）的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，在人工氣候培養(yǎng)室培養(yǎng)成苗，當(dāng)年收取地下微球莖，作為芋原原種。脫毒種莖貯存從培養(yǎng)基上收獲的試管芋洗凈后，于陰涼處晾干，再貯藏于透氣的容器中，置于4°C條件下保存。試管芋經(jīng)國(guó)家法定植檢部門檢驗(yàn)合格后，方可作為芋生產(chǎn)用種。脫毒種芋繁育在3月下旬至4月上旬，按照DB36/T919-2016的要求進(jìn)行生長(zhǎng)環(huán)境的選擇，脫毒種芋的繁育按照DB36/T921-2016的規(guī)定實(shí)施。附錄A（規(guī)范性附錄）MS培養(yǎng)基母液配方及配制母液成分用量定容每升用量母液1（50倍）NH4NO382.5g1000mL20mLKNO395.0gMgSO4·7H2O18.5g母液2（100倍）CaCl2·H2O44.0g1000mL10mL母液3（100倍）KH2PO417.0g1000mL10mL母液4（100倍）Na2-EDTA3.730g1000mL10mLFeSO4·7H2O2.780g母液5（50倍）H3BO30.31g1000mL20mLMnSO4·4H2O1.115gZnSO4·7H2O0.43gKI0.0415gNaMoO4·2H2O0.0125gCuSO4·5H2O0.00125gCoCl2·6H2O0.00125g母液6（200倍）肌醇20.0g1000mL5mL甘氨酸0.4g煙酸（VB3）0.100g鹽酸吡哆醇（VB6）0.100g煙酸硫胺素（VB1）0.020g注：用少量蒸餾水將藥品分別溶解，依次混合，加蒸餾水定容至所需體積。附錄B（規(guī)范性附錄）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液配制1.稱量：用分析天平或電子天平準(zhǔn)確稱取生長(zhǎng)素（或細(xì)胞分裂素）50~100mg。2.溶解：生長(zhǎng)素（如IAA、IBA、NAA、2,4-D）可用少量0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，細(xì)胞分裂素（如KT、ZT、6-BA）可用0.1mol/L的HCl加熱溶解。3.定容：加蒸餾水定容至100ml，配制成濃度為0.5~1mg/ml的溶液。附錄C（規(guī)范性附錄）MS培養(yǎng)基配制1LMS基本培養(yǎng)基配制：根據(jù)培養(yǎng)基成分